Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי עם פרוטוקול שונה המשמש למשקעים ביסמוט סולפיד (BS). היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ואינו דורש ציוד מיוחד.
Abstract
מימן גופרתי (H2S) הוא גז רעיל המיוצר על ידי חיידקים בפרוטאוליזה של חומצות אמינו וחלבונים המכילים גופרית הממלא תפקיד חשוב בבריאות האדם. בדיקת הייצור H2S היא אחת מבדיקות הזיהוי הביוכימיות החשובות של חיידקים. השיטות המסורתיות הן לא רק מייגעות וגוזלות זמן, אלא גם נוטות לעכב את צמיחת החיידקים בשל ההשפעה הרעילה של מלחי מתכות כבדות בתווך המכיל גופרית, מה שמוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות. כאן הקמנו שיטה פשוטה ורגישה לזיהוי H2S בחיידקים. שיטה זו היא גרסה שונה של משקעי ביסמוט סולפיד (BS) המשתמשת בלוחות מיקרוטיטר שקופים של 96 בארות. תרבית חיידקים שולבה עם תמיסת ביסמוט המכילה L-ציסטאין וטופחה במשך 20 דקות, שבסופה נצפה משקע שחור. מגבלת הזיהוי החזותי עבור H 2 S הייתה0.2מילימול. בהתבסס על שינוי הצבע החזותי, ניתן להשיג זיהוי פשוט, בעל תפוקה גבוהה ומהיר של חיידקים מייצרי H2S. לסיכום, שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ייצור H2S בחיידקים.
Introduction
חיידקים המייצרים מימן גופרתי יכולים לנצל חומצות אמינו וחלבונים המכילים גופרית כדי לייצר מימן גופרתי (H2S). הייצור של H2S מתרחש בדרך כלל בחיידקים ממשפחת Enterobacteriaceae גראם-שליליים וגם בחברים Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. ו-Shewanella spp.1. חיידקים אלה יש את היכולת להפחית סולפט לתוך מימן גופרתי (H2S) על מנת לקבל אנרגיה. מימן גופרתי היה מעורב בפיתוח עמידות חיידקית לתרופות. H2S מגן על חיידקים מפני הרעילות של מיני חמצן תגובתי (ROS), ובכך נוגד את ההשפעה האנטיבקטריאלית של אנטיביוטיקה 2,3. H2S יש גם השפעה פיזיולוגית חשובה בשמירה על הומאוסטזיס. ברמות העל-פיזיולוגיות, H2S הוכח כרעיל מאוד לגוף. בגוף האדם, H2S יש תפקיד נוסף כמולקולת איתות גז המעורבת במגוון תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. H2S יכול לווסת את התפקוד הסיסטולי של הלב וממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב בהרפיית כלי הדם, עיכוב עיצוב מחדש של כלי הדם והגנה על שריר הלב 4,5. H2S גם משחק תפקיד חשוב בוויסות מערכת העצבים ומערכת העיכול 6,7. נמצא כי כאשר הם נחשפים לאנטיביוטיקה קוטלת חיידקים, חיידקים מייצרים מיני חמצן תגובתי קטלניים (ROS) המובילים למוות תאי 8,9,10,11.
כבדיקה ביוכימית נפוצה בקורסי מעבדה מיקרוביולוגיים, בדיקת מימן גופרתי היא ניסוי חשוב בזיהוי חיידקים, במיוחד חיידקים ממשפחת Enterobacteriaceae. כיום, בדיקת מימן גופרתי מבוצעת בדרך כלל על מספר רב של חומצות אמינו המכילות גופרית ומדיום אצטט עופרת המחוסנים בחיידקים לבדיקה. לאחר תקופה של דגירה (2-3 ימים), התוצאות נשפטות על ידי התבוננות אם מדיום התרבית או רצועת נייר אצטט עופרת מושחרים בגלל ייצור אצטט עופרת11. עם זאת, שיטות מסורתיות אלה הן לא רק מייגעות וגוזלות זמן, אלא גם נוטות לעכב את צמיחת החיידקים בשל ההשפעה הרעילה של מלחי מתכות כבדות בתווך המכיל גופרית, מה שמוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות. נקבעה שיטה מבוססת ביסמוט לזיהוי H2S12,13. H2S יכול להגיב עם ביסמוט, וליצור משקעים גופרתיים ביסמוט שחור. על מנת לבצע רפורמה בבדיקה ביוכימית זו, יש לקבוע שיטה פשוטה ומהירה ללא תופעות לוואי על צמיחת חיידקים. כאן, הקמנו שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי הגדלים בסביבה חוץ גופית באמצעות ביסמוט סולפיד כמצע בפורמט צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זני חיידקים
הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בתשעה זנים סטנדרטיים, כולל סלמונלה פאראטיפי A, סלמונלה פאראטיפי B, פוסובקטריום נוקלאטום, אנטרוקוקוס פאקליס, סטפילוקוקוס זהוב, Pseudomonas aeruginosa PAO1, אירומונס הידרופילה YJ-1, Proteus vuigaris ודלקת ריאות קלבסיאלה (טבלה 1). סלמונלה פאראטיפי A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, ו Proteus vuigaris יכול לייצר H2S, כפי שתואר בספרות קודמת1.
- הכנת תרבית חיידקים
- העבר מושבת חיידקים אחת של סלמונלה paratyphi A, סלמונלה paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, ודלקת ריאות Klebsiella מצלחת אגר Luria-Bertani (LB) ל 100 מ"ל של LB בינוני ותרבית ב 37 ° C במשך 12-16 שעות עד ריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 109 תאים / מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD600 = 1).
- העבר מושבת חיידקים אחת של Fusobacterium nucleatum ו- Proteus vuigaris מצלחות אגר של מרק סויה טריפטיקז (TSB) ל -100 מ"ל של TSB בינוני ותרבית ב 37 ° C אנאירובית במשך 24 שעות עד ריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 109 תאים / מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD600 = 1).
2. בדיקת זיהוי H2S
- בדיקת ייצור מימן גופרתי
- יש לערבב 100 μL של תרבית חיידקים עם 100 μL של תמיסת ביסמוט שהוכנה לאחרונה (pH 8.0; 10 mM ביסמוט (III) כלוריד, 0.4 M triethanolamine-HCl, 20 mM פירידוקסל 5-פוספט מונוהידרט, 20 mM EDTA ו-40 mM L-ציסטאין) בצלחות מיקרוטיטר 96 בארות ובתרבית במשך 20 דקות ב-37°C. עבור כל זן חיידקי, לבצע את הניתוח משולש.
- לאחר 20 דקות, בדוק אם יש שינוי צבע. אם צבע התמיסה משתנה מצהוב בהיר לשחור, הדבר מצביע על כך שהחיידקים מסוגלים לייצר H2S. חזור על מדידה זו 3x.
- רגישות השיטה
- לקבוע את הרגישות של השיטה באמצעות ריכוזים שונים של hydrosulfide נתרן (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, ו 0 mM, מעורבב עם BS פתרון 14.
- קבע את נוכחותו של HS−/S2− על ידי התבוננות בהיווצרות של משקע BS שחור. הניקוד את צבע הבארות באמצעות סולם חזותי מהפקת צבע ללא ייצור צבע (-) להפקת צבע שחור כהה ביותר (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איתור חיידקים מימנים גופרתיים
הביצועים של בדיקת H2S נחקרו באמצעות תרביות טהורות של זני חיידקים נבחרים, כמפורט בטבלה 1. התוצאות הצביעו על כך שסלמונלה פאראטיפי B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, ו- Proteus vuigaris יכולים לייצר H2S עם משקע BS שחור, בעוד Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, ו - Klebsiella pneumoniae לא הראו כל משקע שחור. הייצור המהיר ביותר של H2S נצפה עבור Fusobacterium nucleatum, שהגיע לייצור צבע מרבי (איור 1).
רגישות השיטה
הרגישות נקבעה על ידי ערבוב ריכוזים שונים של נתרן הידרוסולפיד (NaHS) עם תמיסת BS. בדיקה חזותית גילתה שעומק הצבע של התמיסה העמיק עם ריכוז יונים הולך וגדל של HS−/S 2− (איור 2). מגבלת הזיהוי של H 2 S עבור השיטה היא0.2mM.
איור 1: זיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי. הייצור של H2S ב Fusobacterium nucleatum זוהה על ידי היווצרות BS שחור precipitate. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: רגישות שיטת ביסמוט סולפיד (BS). הרגישות של שיטת BS לזיהוי H2S נרשמה כהיעדר הפקת צבע (-) להפקת הצבע השחור הכהה ביותר (+++++). משמאל לימין, ריכוזי NaHS הם 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, ו 0 mM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מינים | H2S ייצור א | |
| סלמונלה פאראטיפי A | _ | |
| סלמונלה פאראטיפי B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| אנטרוקוקוס פאקאליס | + | |
| סטפילוקוקוס זהוב | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| אירומונס הידרופילה | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| קלבסיאלה דלקת ריאות | _ | |
טבלה 1: הערכה חזותית של ייצור H2S. ייצור מימן גופרתי (H2S) על ידי זני חיידקים שונים נמדד בשיטה החזותית בלוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות. A: נרשם כמשקעים של ביסמוט סולפיד שחור (BS) ללא הפקת צבע (-) לייצור צבע שחור (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקת ייצור מימן גופרתי היא אחת הבדיקות הפנוטיפיות המקובלות לזיהוי והתמיינות של זני חיידקים. מיני חיידקים רבים יכולים לייצר מימן גופרתי בסביבתם הטבעית, כגון מים ימיים. מיני חיידקים אלה כוללים סלמונלה sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., כמה זנים של Klebsiella sp., Escherichia coli, וכמה מינים של Clostridiaאנאירובית 15,16. עם זאת, הרגישות של שיטת הבדיקה המסורתית H2S נמוכה, והשיטה גוזלת זמן17,18. מדיום הבדיקה המסורתי H2S מכיל PbAc, שיש לו השפעות רעילות על צמיחת חיידקים, והתרבית מחוסנת לנקב לאגר מוצק למחצה. תכולת החמצן בחלק התחתון של המדיום נמוכה, ולכן החיידקים האירוביים גדלים בצורה גרועה. לכן, זה מוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות כוזבות.
בשיטה זו השתמשנו בביסמוט (III) במקום יוני עופרת או ברזל. כאשר חיידק מבודד המייצר H2S נחשף לביסמוט (III) כלוריד, מתרחשת תגובת החלפה. בתגובה זו, יון כלוריד ויון סולפיד מחליפים עמדות, ומייצרים חומצה כלורית מימנית וביסמוט (III) סולפיד; מוצר ביסמוט (III) סולפיד זה יוצא מהתמיסה כמוצק שחור. עומק הצבע של המשקע השחור יכול לשמש במידה מסוימת כדי לקבוע את כמות H2S המיוצר על ידי זן חיידקי. בהתבסס על משקעי BS והשכפול הגבוה, האמינות והפשטות, השיטה המוצגת במחקר הוקמה כבדיקת מימן גופרתי לזיהוי חיידקים המייצרים H2S. השלב הקריטי בשיטה זו הוא שתמיסת הביסמוט צריכה להיות מוכנה טרייה. בהשוואה לשיטה המסורתית, אין רעילות מלח מתכות כבדות בצמיחת חיידקים, והיא יכולה גם לחסוך זמן לאיתור חיידקים אירוביים המייצרים מימן גופרתי.
במאמר זה, המבוסס על התגובה של ביסמוט (III) כלוריד ו- H 2 S,אשר יצרו משקעי BS חזותיים, מוצגת שיטה פשוטה, רגישה, זולה ובעלת תפוקה גבוהה לזיהוי חיידקים מייצרי H2S. שיטה זו שימושית לזיהוי מהיר של דגימות מזוהמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD) ופרויקט המחקר של רפורמת ההוראה של אוניברסיטת התרופות של סין (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
