Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare i batteri che producono idrogeno solforato con un protocollo modificato utilizzato per la precipitazione del solfuro di bismuto (BS). I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da valutare e non richiede attrezzature specializzate.
Abstract
L'idrogeno solforato (H2S) è un gas tossico prodotto dai batteri nella proteolisi degli amminoacidi e delle proteine contenenti zolfo che svolge un ruolo importante nella salute umana. Il test di produzione di H2S è uno dei più importanti test di identificazione biochimica batterica. I metodi tradizionali non sono solo noiosi e dispendiosi in termini di tempo, ma anche inclini all'inibizione della crescita batterica a causa dell'effetto tossico dei sali di metalli pesanti nel mezzo contenente zolfo, che spesso porta a risultati negativi. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice e sensibile per rilevare H2S nei batteri. Questo metodo è una versione modificata della precipitazione del solfuro di bismuto (BS) che utilizza piastre di microtitolazione trasparenti a 96 pozzetti. La coltura batterica è stata combinata con una soluzione di bismuto contenente L-cisteina e coltivata per 20 minuti, al termine della quale è stato osservato un precipitato nero. Il limite di rilevamento visivo per H 2 S era di0,2mM. Sulla base del cambiamento di colore visivo, è possibile ottenere il rilevamento semplice, ad alto rendimento e rapido dei batteri che producono H2S. In sintesi, questo metodo può essere utilizzato per identificare la produzione di H2S nei batteri.
Introduction
I batteri che producono idrogeno solforato possono utilizzare aminoacidi e proteine contenenti zolfo per produrre idrogeno solforato (H2S). La produzione di H2S si verifica di solito nei batteri della famiglia Enterobacteriaceae gram-negativi e anche nei membri di Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. e Shewanella spp.1. Questi batteri hanno la capacità di ridurre il solfato in idrogeno solforato (H2S) per ottenere energia. L'idrogeno solforato è stato implicato nello sviluppo della resistenza batterica ai farmaci. H 2 S protegge i batteri dalla tossicità delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), antagonizzando così l'effetto antibatterico degli antibiotici 2,3. H2S ha anche un importante effetto fisiologico nel mantenimento dell'omeostasi. A livelli sovrafisiologici, H2S ha dimostrato di essere profondamente tossico per il corpo. Nel corpo umano, H2S ha un altro ruolo come molecola di segnalazione del gas che è coinvolta in una varietà di processi fisiologici e patologici. H2S può regolare la funzione sistolica del cuore e svolge un importante ruolo fisiologico nel rilassare i vasi sanguigni, inibendo il rimodellamento vascolare e proteggendo il miocardio 4,5. H2S svolge anche un ruolo importante nella regolazione del sistema nervoso e del tratto digestivo 6,7. È stato riscontrato che, quando esposti ad antibiotici battericidi, i batteri producono specie reattive letali dell'ossigeno (ROS) che portano alla morte cellulare 8,9,10,11.
Come test biochimico comune nei corsi di laboratorio microbiologici, il test dell'idrogeno solforato è un importante esperimento nell'identificazione di batteri, in particolare batteri della famiglia Enterobacteriaceae. Allo stato attuale, il test dell'idrogeno solforato viene solitamente eseguito su un gran numero di aminoacidi contenenti zolfo e mezzo di acetato di piombo inoculati con i batteri da testare. Dopo un periodo di incubazione (2-3 giorni), i risultati vengono giudicati osservando se il terreno di coltura o la striscia di carta di acetato di piombo è annerita a causa della produzione di acetato di piombo11. Tuttavia, questi metodi tradizionali non sono solo noiosi e dispendiosi in termini di tempo, ma anche inclini all'inibizione della crescita batterica a causa dell'effetto tossico dei sali di metalli pesanti nel mezzo contenente zolfo, che spesso porta a risultati negativi. È stato stabilito un metodo basato sul bismuto per la rilevazione di H2S12,13. H2S può reagire con il bismuto, formando precipitazioni di solfuro di bismuto nero. Al fine di condurre una riforma per questo test biochimico, è necessario stabilire un metodo semplice e rapido senza effetti collaterali sulla crescita batterica. Qui, abbiamo impostato un metodo semplice per la rilevazione di batteri che producono idrogeno solforato coltivati in un ambiente in vitro utilizzando il solfuro di bismuto come substrato in un formato di piastra di microtitolazione a 96 pozzetti.
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Protocol
1. Ceppi batterici
NOTA: Per questo esperimento, sono stati utilizzati nove ceppi standard, tra cui Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris e Klebsiella pneumoniae (Tabella 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris possono produrre H2S, come delineato nella letteratura precedente1.
- Preparazione della coltura batterica
- Trasferire una colonia batterica di Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 e Klebsiella pneumoniae da una piastra di agar Luria-Bertani (LB) a 100 ml di terreno LB e coltura a 37 °C per 12-16 ore fino a quando la concentrazione batterica è di circa 1 x 109 cellule/ml (come indicato da OD600 = 1).
- Trasferire una colonia batterica di Fusobacterium nucleatum e Proteus vuigaris da piastre di agar di brodo di soia tripticase (TSB) a 100 ml di terreno TSB e coltura a 37 °C anaerobicamente per 24 ore fino a quando la concentrazione batterica è di circa 1 x 109 cellule/ml (come indicato da OD600 = 1).
2. Saggio di rilevamento H2S
- Test di produzione di idrogeno solforato
- Mescolare 100 μL di coltura batterica con 100 μL di soluzione di bismuto appena preparata (pH 8,0; 10 mM di cloruro di bismuto (III), 0,4 M di trietanolammina-HCl, 20 mM di piridossale 5-fosfato monoidrato, 20 mM EDTA e 40 mM di L-cisteina) nelle piastre di microtitolazione a 96 pozzetti e coltura per 20 minuti a 37 °C. Per ogni ceppo batterico, eseguire l'analisi in triplice copia.
- Dopo 20 minuti, controlla il cambio di colore. Se il colore della soluzione cambia da giallo chiaro a nero, ciò indica che il batterio è in grado di produrre H2S. Ripetere questa misurazione 3x.
- Sensibilità del metodo
- Determinare la sensibilità del metodo utilizzando diverse concentrazioni di idrosolfuro di sodio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM, miscelati con la soluzione BS 14.
- Determinare la presenza di HS−/S2− osservando la formazione di un precipitato nero di BS. Assegna un punteggio al colore dei pozzetti utilizzando una scala visiva da nessuna produzione di colore (-) alla produzione di colore nero più scuro (++++++).
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Representative Results
Rilevamento di batteri produttori di idrogeno solforato
Le prestazioni del test H2S sono state studiate utilizzando colture pure di ceppi batterici selezionati, come elencato nella Tabella 1. I risultati hanno indicato che Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris possono produrre H2S con precipitato BS nero, mentre Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, e Klebsiella pneumoniae non hanno mostrato alcun precipitato nero. La produzione più rapida di H2S è stata osservata per Fusobacterium nucleatum, raggiungendo la massima produzione di colore (Figura 1).
Sensibilità del metodo
La sensibilità è stata determinata miscelando diverse concentrazioni di idrosolfuro di sodio (NaHS) con soluzione BS. L'ispezione visiva ha rivelato che la profondità di colore della soluzione si è approfondita con l'aumento della concentrazione di ioni di HS − / S 2 - (Figura 2). Il limite di rilevazione di H 2 S per il metodo è0,2mM.
Figura 1: Rilevamento di batteri produttori di idrogeno solforato. La produzione di H2S nel Fusobacterium nucleatum è stata rilevata dalla formazione di precipitati BS neri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Sensibilità del metodo del solfuro di bismuto (BS). La sensibilità del metodo BS per il rilevamento di H2S è stata registrata come nessuna produzione di colore (-) alla produzione di colore nero più scuro (+++++). Da sinistra a destra, le concentrazioni di NaHS sono 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Specie | H2S produzione a | |
| Salmonella paratyphi Un | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabella 1: Valutazione visiva della produzione di H2S. La produzione di idrogeno solforato (H2S) da parte di diversi ceppi batterici è stata misurata utilizzando il metodo visivo in una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. a: Registrato come precipitazione di solfuro di bismuto nero (BS) da nessuna produzione di colore (-) a produzione di colore nero (+).
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Discussion
Il test di produzione di idrogeno solforato è uno dei test fenotipici convenzionali per l'identificazione e la differenziazione dei ceppi batterici. Molte specie batteriche possono produrre idrogeno solforato nel loro ambiente naturale, come l'acqua acquatica. Queste specie batteriche includono Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., alcuni ceppi di Klebsiella sp., Escherichia coli e alcune specie di Clostridia anaerobici15,16. Tuttavia, la sensibilità del metodo di prova tradizionale H2S è bassa e il metodo richiede tempo17,18. Il tradizionale mezzo di prova H2S contiene PbAc, che ha effetti tossici sulla crescita dei batteri, e la coltura viene inoculata in puntura in agar semi-solido. Il contenuto di ossigeno nella parte inferiore del mezzo è basso, quindi i batteri aerobici crescono male. Pertanto, spesso porta a risultati falsi negativi.
In questo metodo, abbiamo usato il bismuto (III) invece di piombo o ioni ferrosi. Quando un isolato batterico che produce H2S è esposto al cloruro di bismuto (III), si verifica una reazione di sostituzione. In questa reazione, lo ione cloruro e lo ione solfuro si scambiano posizioni, producendo acido clorico idrogeno e solfuro di bismuto (III); questo prodotto di solfuro di bismuto (III) precipita fuori dalla soluzione come solido nero. La profondità di colore del precipitato nero può essere utilizzata in una certa misura per determinare la quantità di H2S prodotta dal ceppo batterico. Sulla base della precipitazione di BS e dell'elevata riproducibilità, affidabilità e semplicità, il metodo mostrato nello studio è stato stabilito come test dell'idrogeno solforato per la rilevazione di batteri produttori di H2S. Il passo critico di questo metodo è che la soluzione di bismuto deve essere preparata fresca. Rispetto al metodo tradizionale, non vi è alcuna tossicità del sale di metalli pesanti nella crescita dei batteri e può anche far risparmiare tempo per la rilevazione di batteri aerobici che producono idrogeno solforato.
In questo articolo, basato sulla reazione del cloruro di bismuto (III) e H 2 S, che ha prodotto la precipitazione di BS visualblack, viene mostrato un metodo semplice, sensibile, economico e ad alto rendimento per la rilevazione di batteriche producono H2S. Questo metodo è utile per la rapida rilevazione di campioni contaminati.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) e dal Teaching Reform Research Project della China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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