Summary
यहां, हम बिस्मथ सल्फाइड (बीएस) वर्षा के लिए उपयोग किए जाने वाले संशोधित प्रोटोकॉल के साथ हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस विधि के प्रमुख लाभ यह हैं कि इसका मूल्यांकन करना आसान है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है।
Abstract
हाइड्रोजन सल्फाइड (एच2एस) सल्फर युक्त अमीनो एसिड और प्रोटीन के प्रोटियोलिसिस में बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक जहरीली गैस है जो मानव स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। एच2एस उत्पादन परीक्षण महत्वपूर्ण जीवाणु जैव रासायनिक पहचान परीक्षणों में से एक है। पारंपरिक तरीके न केवल थकाऊ और समय लेने वाले होते हैं, बल्कि सल्फर युक्त माध्यम में भारी धातु लवण के विषाक्त प्रभाव के कारण बैक्टीरिया के विकास के निषेध से भी ग्रस्त होते हैं, जो अक्सर नकारात्मक परिणाम की ओर जाता है। यहां, हमने बैक्टीरिया में एच2एस का पता लगाने के लिए एक सरल और संवेदनशील विधि स्थापित की। यह विधि बिस्मथ सल्फाइड (बीएस) वर्षा का एक संशोधित संस्करण है जो 96-अच्छी तरह से पारदर्शी माइक्रोटिटर प्लेटों का उपयोग करता है। बैक्टीरियल कल्चर को एल-सिस्टीन युक्त बिस्मथ समाधान के साथ जोड़ा गया और 20 मिनट के लिए खेती की गई, जिसके अंत में एक काला अवक्षेप देखा गया। एच 2 एस के लिए दृश्य पहचान सीमा0.2एमएम थी। दृश्य रंग परिवर्तन के आधार पर, एच2एस उत्पादक बैक्टीरिया का सरल, उच्च-थ्रूपुट और तेजी से पता लगाया जा सकता है। सारांश में, इस विधि का उपयोग बैक्टीरिया में एच2एस उत्पादन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादक बैक्टीरिया हाइड्रोजन सल्फाइड (एच2एस) का उत्पादन करने के लिए सल्फर युक्त अमीनो एसिड और प्रोटीन का उपयोग कर सकते हैं। एच2एस का उत्पादन आमतौर पर ग्राम-नकारात्मक एंटरोबैक्टीरिया परिवार के बैक्टीरिया में होता है और सिट्रोबैक्टर एसपीपी, प्रोटियस एसपीपी, एडवर्ड्सिएला एसपीपी और शेवनेला एसपीपी के सदस्यों में भी होता है। इन जीवाणुओं में ऊर्जा प्राप्त करने के लिए हाइड्रोजन सल्फाइड (एच2एस) में सल्फेट को कम करने की क्षमता होती है। हाइड्रोजन सल्फाइड को जीवाणु दवा प्रतिरोध के विकास में फंसाया गया है। एच 2 एस बैक्टीरिया को प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की विषाक्तता से बचाता है, इस प्रकार एंटीबायोटिक दवाओं के जीवाणुरोधी प्रभाव को रोकता है 2,3. होमोस्टैसिस को बनाए रखने में एच2एस का भी एक महत्वपूर्ण शारीरिक प्रभाव है। सुपरफिजियोलॉजिकल स्तरों पर, एच2एस को शरीर के लिए गहराई से विषाक्त दिखाया गया है। मानव शरीर में, एच2एस की गैस सिग्नलिंग अणु के रूप में एक और भूमिका है जो विभिन्न प्रकार की शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में शामिल है। एच2एस हृदय के सिस्टोलिक फ़ंक्शन को विनियमित कर सकता है और रक्त वाहिकाओं को आराम देने, संवहनी रीमॉडेलिंग को रोकने और मायोकार्डियम 4,5 की रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका निभाता है। एच2एस तंत्रिका तंत्र और पाचन तंत्र 6,7 को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह पाया गया है कि, जब जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आते हैं, तो बैक्टीरिया घातक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करते हैं जिससे कोशिका मृत्यु 8,9,10,11 हो जाती है।
सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में एक सामान्य जैव रासायनिक परीक्षण के रूप में, हाइड्रोजन सल्फाइड परीक्षण बैक्टीरिया की पहचान में एक महत्वपूर्ण प्रयोग है, विशेष रूप से एंटरोबैक्टीरिया परिवार के बैक्टीरिया। वर्तमान में, हाइड्रोजन सल्फाइड परीक्षण आमतौर पर बड़ी संख्या में सल्फर युक्त अमीनो एसिड और लीड एसीटेट माध्यम पर किया जाता है, जिसे बैक्टीरिया के साथ परीक्षण किया जाता है। इनक्यूबेशन (2-3 दिनों) की अवधि के बाद, परिणामों को यह देखकर आंका जाता है कि क्या लीड एसीटेट उत्पादन11 के कारण कल्चर माध्यम या लीड एसीटेट पेपर स्ट्रिप काला हो गया है। हालांकि, ये पारंपरिक तरीके न केवल थकाऊ और समय लेने वाले हैं, बल्कि सल्फर युक्त माध्यम में भारी धातु लवण के विषाक्त प्रभाव के कारण बैक्टीरिया के विकास के निषेध से भी ग्रस्त हैं, जो अक्सर नकारात्मक परिणामों की ओर जाता है। एच2एस12,13 का पता लगाने के लिए एक बिस्मथ-आधारित विधि स्थापित की गई है। एच2एस बिस्मथ के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, जिससे काले बिस्मथ सल्फाइड वर्षा होती है। इस जैव रासायनिक परीक्षण के लिए एक सुधार करने के लिए, बैक्टीरिया के विकास पर कोई दुष्प्रभाव नहीं होने के साथ एक सरल और त्वरित विधि स्थापित करने की आवश्यकता है। यहां, हमने 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट प्रारूप में सब्सट्रेट के रूप में बिस्मथ सल्फाइड का उपयोग करके इन विट्रो वातावरण में उगाए गए हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक सरल विधि स्थापित की है।
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Protocol
1. बैक्टीरियल उपभेद
नोट: इस प्रयोग के लिए, नौ मानक उपभेदों का उपयोग किया गया था, जिनमें साल्मोनेला पैराटाइफी ए, साल्मोनेला पैराटाइफी बी, फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम, एंटरोकोकस फिकलिस, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पीएओ 1, एरोमोनास हाइड्रोफिला वाईजे -1, प्रोटियस वुइगारिस और क्लेबसिएला निमोनिया (तालिका 1) शामिल हैं। साल्मोनेला पैराटाइफी ए, फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, और प्रोटियस वुइगारिस एच2एस का उत्पादन कर सकते हैं, जैसा कि पिछले साहित्य1 में उल्लिखित है।
- बैक्टीरियल कल्चर की तैयारी
- साल्मोनेला पैराटाइफी ए, साल्मोनेला पैराटाइफी बी, एंटरोकोकस फिकेलिस, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पीएओ 1, एरोमोनास हाइड्रोफिला वाईजे -1, और क्लेबसिएला निमोनिया की एक जीवाणु कॉलोनी को लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट से 100 एमएल एलबी माध्यम और कल्चर 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए स्थानांतरित करें जब तक कि बैक्टीरिया की एकाग्रता लगभग 1 x 109 सेल / एमएल न हो ।
- ट्रिप्टिकेस सोया शोरबा (टीएसबी) एगर प्लेटों से फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम और प्रोटियस वुइगारिस की एक जीवाणु कॉलोनी को टीएसबी माध्यम के 100 एमएल और कल्चर को 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक रूप से 24 घंटे के लिए स्थानांतरित करें जब तक कि बैक्टीरिया की एकाग्रता लगभग 1 x 109 कोशिकाओं / एमएल (जैसा कि ओडी600 = 1 द्वारा इंगित किया गया है)।
2. एच2एस डिटेक्शन परख
- हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादन परीक्षण
- 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में 100 μL बैक्टीरियल कल्चर को 100 μL नए तैयार बिस्मथ घोल (pH 8.0; 10 mM बिस्मथ (III) क्लोराइड, 0.4 M ट्राइएथेनॉलमाइन-HCl, 20 mM पाइरिडोक्सल 5-फॉस्फेट मोनोहाइड्रेट, 20 mM EDTA, और 40 mM L-सिस्टीन) के साथ मिलाएं। प्रत्येक जीवाणु तनाव के लिए, तीन प्रतियों में विश्लेषण करें।
- 20 मिनट के बाद, रंग परिवर्तन की जांच करें। यदि घोल का रंग हल्के पीले से काले रंग में बदल जाता है, तो यह इंगित करता है कि बैक्टीरिया एच2एस का उत्पादन करने में सक्षम है।
- विधि की संवेदनशीलता
- सोडियम हाइड्रोसल्फाइड (NaHS) की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके विधि की संवेदनशीलता निर्धारित करें: 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, और 0 mM, BS समाधान 14 के साथ मिश्रित।
- एक काले बीएस अवक्षेप के गठन को देखकर HS−/S2− की उपस्थिति निर्धारित करें। बिना रंग उत्पादन (-) से गहरे काले रंग के उत्पादन (++++++) तक दृश्य पैमाने का उपयोग करके कुओं के रंग को स्कोर करें।
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Representative Results
हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादक बैक्टीरिया का पता लगाना
एच2एस परीक्षण के प्रदर्शन की जांच चयनित जीवाणु उपभेदों की शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग करके की गई थी, जैसा कि तालिका 1 में सूचीबद्ध है। परिणामों से संकेत मिलता है कि साल्मोनेला पैराटाइफी बी, फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम, एंटरोकोकस फिकेलिस, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और प्रोटियस वुइगारिस काले बीएस अवक्षेप के साथ एच2एस का उत्पादन कर सकते हैं, जबकि साल्मोनेला पैराटाइफी ए, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, एरोमोनास हाइड्रोफिला और क्लेबसिएला निमोनिया कोई काला अवक्षेप दिखाने में विफल रहे। सबसे तेजी से एच2एस उत्पादन फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम के लिए देखा गया था, जो अधिकतम रंग उत्पादन तक पहुंच गया था (चित्रा 1)।
विधि की संवेदनशीलता
संवेदनशीलता बीएस समाधान के साथ सोडियम हाइड्रोसल्फाइड (एनएएचएस) की विभिन्न सांद्रता को मिलाकर निर्धारित की गई थी। दृश्य निरीक्षण से पता चला कि समाधान की रंग गहराई एचएस -/ एस 2की बढ़ती आयन एकाग्रता के साथ गहरी हो गई - (चित्रा 2)। विधि के लिए एच 2 एस की पहचान सीमा0.2एमएम है।
चित्र 1: हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादक बैक्टीरिया का पता लगाना। फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम में एच2एस के उत्पादन का पता काले बीएस अवक्षेप गठन द्वारा लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: बिस्मथ सल्फाइड (बीएस) विधि की संवेदनशीलता। एच2एस का पता लगाने के लिए बीएस विधि की संवेदनशीलता को गहरे काले रंग के उत्पादन (+++++) के लिए कोई रंग उत्पादन (-) के रूप में दर्ज नहीं किया गया था। बाएं से दाएं, एनएएचएस सांद्रता 2 एमएम, 1 एमएम, 0.8 एमएम, 0.6 एमएम, 0.4 एमएम, 0.2 एमएम, 0.1 एमएम और 0 एमएम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| प्रजातियां | एच2एस उत्पादन ए | |
| साल्मोनेला पैराटाइफी एक | _ | |
| साल्मोनेला पैराटाइफी B | +++ | |
| फ्यूसोबैक्टीरियम न्यूक्लेटम | ++++ | |
| एंटरोकोकस फिकेलिस | + | |
| स्टेफिलोकोकस ऑरियस। | _ | |
| स्यूडोमोनास एरुगिनोसा | ++ | |
| एरोमोनास हाइड्रोफिला। | _ | |
| प्रोटीन प्रोटीन | + | |
| क्लेबसिएला निमोनिया | _ | |
तालिका 1: एच2एस उत्पादन का दृश्य मूल्यांकन। विभिन्न जीवाणु उपभेदों द्वारा हाइड्रोजन सल्फाइड (एच2एस) का उत्पादन 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में दृश्य विधि का उपयोग करके मापा गया था। ए: काले बिस्मथ सल्फाइड (बीएस) वर्षा के रूप में दर्ज किया गया है जो बिना किसी रंग उत्पादन (-) से काले रंग के उत्पादन (+) तक है।
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Discussion
हाइड्रोजन सल्फाइड उत्पादन परीक्षण जीवाणु उपभेदों की पहचान और भेदभाव के लिए पारंपरिक फेनोटाइपिक परीक्षणों में से एक है। कई जीवाणु प्रजातियां अपने प्राकृतिक वातावरण में हाइड्रोजन सल्फाइड का उत्पादन कर सकती हैं, जैसे जलीय पानी। इन जीवाणु प्रजातियों में साल्मोनेला एसपी, सिट्रोबैक्टर एसपी, प्रोटियस एसपी, स्यूडोमोनास एसपी, क्लेबसिएला एसपी के कुछ उपभेद, एस्चेरिचिया कोलाई और एनारोबिक क्लोस्ट्रीडिया15,16 की कुछ प्रजातियां शामिल हैं। हालांकि, पारंपरिक एच2एस परीक्षण विधि की संवेदनशीलता कम है, और विधि17,18 समय लेने वाली है। पारंपरिक एच2एस परीक्षण माध्यम में पीबीएसी होता है, जो बैक्टीरिया के विकास पर विषाक्त प्रभाव डालता है, और संस्कृति को अर्ध-ठोस आगर में पंचर-टीका लगाया जाता है। माध्यम के निचले हिस्से में ऑक्सीजन की मात्रा कम होती है, इसलिए एरोबिक बैक्टीरिया खराब तरीके से बढ़ते हैं। इसलिए, यह अक्सर गलत-नकारात्मक परिणामों की ओर जाता है।
इस विधि में, हमने लीड या फेरस आयनों के बजाय बिस्मथ (III) का उपयोग किया। जब एच2एस का उत्पादन करने वाले एक जीवाणु पृथक को बिस्मथ (III) क्लोराइड के संपर्क में लाया जाता है, तो एक प्रतिस्थापन प्रतिक्रिया होती है। इस प्रतिक्रिया में, क्लोराइड आयन और सल्फाइड आयन विनिमय की स्थिति, हाइड्रोजन क्लोरिक एसिड और बिस्मथ (III) सल्फाइड का उत्पादन करते हैं; यह बिस्मथ (III) सल्फाइड उत्पाद एक काले ठोस के रूप में घोल से बाहर निकलता है। बैक्टीरिया के तनाव द्वारा उत्पादित एच2एस की मात्रा निर्धारित करने के लिए काले अवक्षेप की रंग गहराई का उपयोग कुछ हद तक किया जा सकता है। बीएस वर्षा और उच्च प्रजनन क्षमता, विश्वसनीयता और सादगी के आधार पर, अध्ययन में दिखाई गई विधि को एच2एस उत्पादक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए हाइड्रोजन सल्फाइड परीक्षण के रूप में स्थापित किया गया था। इस विधि का महत्वपूर्ण कदम यह है कि बिस्मथ समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए। पारंपरिक विधि की तुलना में, बैक्टीरिया के विकास में कोई भारी धातु नमक विषाक्तता नहीं है, और यह एरोबिक बैक्टीरिया का उत्पादन करने वाले हाइड्रोजन सल्फाइड का पता लगाने के लिए समय भी बचा सकता है।
इस पेपर में, बिस्मथ (III) क्लोराइड और एच 2 एस की प्रतिक्रिया के आधारपर, जिसने विज़ुअलब्लैक बीएस वर्षा का उत्पादन किया, एच2एस उत्पादक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक सरल, संवेदनशील, सस्ती और उच्च-थ्रूपुट विधि दिखाई गई है। यह विधि दूषित नमूनों का तेजी से पता लगाने के लिए उपयोगी है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों (पीएपीडी) के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास और चीन फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी (2019एक्सजेवाईबी 18) के शिक्षण सुधार अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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