Summary
Burada, bizmut sülfür (BS) çökeltmesi için kullanılan modifiye edilmiş bir protokol ile hidrojen sülfür üreten bakterileri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin en önemli avantajları, değerlendirilmesinin kolay olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.
Abstract
Hidrojen sülfür (H2S), insan sağlığında önemli rol oynayan kükürt içeren amino asit ve proteinlerin proteolizinde bakteriler tarafından üretilen toksik bir gazdır. H2S üretim testi, önemli bakteriyel biyokimyasal tanımlama testlerinden biridir. Geleneksel yöntemler sadece sıkıcı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda kükürt içeren ortamdaki ağır metal tuzlarının toksik etkisi nedeniyle bakteriyel büyümenin inhibisyonuna eğilimlidir ve bu da genellikle olumsuz sonuçlara yol açar. Burada, bakterilerdeH2S'yi tespit etmek için basit ve hassas bir yöntem oluşturduk. Bu yöntem, 96 kuyucuklu şeffaf mikrotitre plakaları kullanan bizmut sülfür (BS) çökeltmesinin değiştirilmiş bir versiyonudur. Bakteri kültürü, L-sistein içeren bizmut çözeltisi ile birleştirildi ve sonunda siyah bir çökelti gözlenen 20 dakika boyunca ekildi. H2 S için görsel algılamasınırı 0,2 mM idi. Görsel renk değişimine bağlı olarak,H2S üreten bakterilerin basit, yüksek verimli ve hızlı tespiti sağlanabilir. Özetle, bu yöntem bakterilerdeH2S üretimini tanımlamak için kullanılabilir.
Introduction
Hidrojen sülfür üreten bakteriler, hidrojen sülfür (H2S) üretmek için kükürt içeren amino asitleri ve proteinleri kullanabilir. H2 S üretimigenellikle gram-negatif Enterobacteriaceae ailesi bakterilerinde ve ayrıca Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. ve Shewanella spp.1 üyelerinde görülür. Bu bakteriler, enerji elde etmek için sülfatı hidrojen sülfüre (H2S) indirgeme yeteneğine sahiptir. Hidrojen sülfür, bakteriyel ilaç direncinin gelişiminde rol oynamıştır. H2S, bakterileri reaktif oksijen türlerinin (ROS) toksisitesinden korur, böylece antibiyotiklerin antibakteriyel etkisini antagonize eder 2,3. H2S ayrıca homeostazın korunmasında önemli bir fizyolojik etkiye sahiptir. Suprafizyolojik seviyelerde,H2S'nin vücut için derinden toksik olduğu gösterilmiştir. İnsan vücudunda,H2S, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alan bir gaz sinyal molekülü olarak başka bir role sahiptir. H2S, kalbin sistolik fonksiyonunu düzenleyebilir ve kan damarlarının gevşetilmesinde, vasküler yeniden şekillenmenin inhibe edilmesinde ve miyokard 4,5'in korunmasında önemli bir fizyolojik rol oynar. H2S ayrıca sinir sistemi ve sindirim sisteminin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar 6,7. Bakterilerin bakterisidal antibiyotiklere maruz kaldıklarında hücre ölümüne yol açan ölümcül reaktif oksijen türleri (ROS) ürettikleri bulunmuştur 8,9,10,11.
Mikrobiyolojik laboratuvar derslerinde yaygın bir biyokimyasal test olan hidrojen sülfür testi, bakterilerin, özellikle de Enterobacteriaceae familyasının bakterilerinin tanımlanmasında önemli bir deneydir. Şu anda, hidrojen sülfür testi genellikle test edilecek bakterilerle aşılanmış çok sayıda kükürt içeren amino asit ve kurşun asetat ortamı üzerinde gerçekleştirilmektedir. Bir inkübasyon süresinden sonra (2-3 gün), sonuçlar, kurşun asetat üretimi nedeniyle kültür ortamının veya kurşun asetat kağıt şeridinin kararıp kararmadığı gözlemlenerek değerlendirilir11. Bununla birlikte, bu geleneksel yöntemler sadece sıkıcı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda kükürt içeren ortamdaki ağır metal tuzlarının toksik etkisi nedeniyle bakteriyel büyümenin inhibisyonuna eğilimlidir ve bu da genellikle olumsuz sonuçlara yol açar. H2S12,13'ün tespiti için bizmut tabanlı bir yöntem oluşturulmuştur. H2S, bizmut ile reaksiyona girerek siyah bizmut sülfür çökeltmesi oluşturabilir. Bu biyokimyasal test için bir reform yapmak için, bakteri büyümesi üzerinde hiçbir yan etkisi olmayan basit ve hızlı bir yöntem oluşturulması gerekmektedir. Burada, 96 delikli mikrotitre plaka formatında substrat olarak bizmut sülfür kullanılarak in vitro bir ortamda yetiştirilen hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti için basit bir yöntem oluşturduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteri suşları
NOT: Bu deney için Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris ve Klebsiella pneumoniae dahil olmak üzere dokuz standart suş kullanılmıştır (Tablo 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa ve Proteus vuigaris, önceki literatür1'de belirtildiği gibiH2S üretebilir.
- Bakteri kültürünün hazırlanması
- Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 ve Klebsiella pneumoniae'nin bir bakteri kolonisini bir Luria-Bertani (LB) agar plakasından 100 mL LB ortamına ve kültürüne 12-16 saat boyunca 37 ° C'de bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1 x 109 hücre / mL olana kadar (OD600 = 1 ile gösterildiği gibi) aktarın.
- Fusobacterium nucleatum ve Proteus vuigaris'in bir bakteri kolonisini, triptikaz soya suyu (TSB) agar plakalarından, bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1 x 109 hücre / mL olana kadar 24 saat boyunca anaerobik olarak 37 ° C'de 100 mL TSB ortamına ve kültürüne aktarın (OD600 = 1 ile gösterildiği gibi).
2. H2S tespit testi
- Hidrojen sülfür üretim testi
- 100 μL bakteri kültürünü, 100 μL yeni hazırlanmış bizmut çözeltisi (pH 8.0; 10 mM bizmut (III) klorür, 0.4 M trietanolamin-HCl, 20 mM piridoksal 5-fosfat monohidrat, 20 mM EDTA ve 40 mM L-sistein) ile 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında ve kültüründe 37 °C'de 20 dakika boyunca karıştırın. Her bakteri suşu için, analizi üçlü olarak gerçekleştirin.
- 20 dakika sonra renk değişikliği olup olmadığını kontrol edin. Çözeltinin rengi açık sarıdan siyaha değişirse, bu bakterilerinH2S üretebildiğini gösterir.
- Yöntemin hassasiyeti
- Farklı konsantrasyonlarda sodyum hidrosülfür (NaHS) kullanarak yöntemin duyarlılığını belirleyin: BS çözeltisi 14 ile karıştırılmış 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM ve 0 mM.
- Siyah bir BS çökeltisinin oluşumunu gözlemleyerek HS−/S2− varlığını belirleyin. Renk üretimi yok (-) ile en koyu siyah renk üretimine (+++++++) kadar görsel bir ölçek kullanarak kuyuların rengini puanlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti
H2 S testininperformansı, Tablo 1'de listelendiği gibi, seçilmiş bakteri suşlarının saf kültürleri kullanılarak araştırılmıştır. Sonuçlar, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa ve Proteus vuigaris'in siyah BS çökeltisi ileH2S üretebildiğini, Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila ve Klebsiella pneumoniae'nin herhangi bir siyah çökelti gösteremediğini göstermiştir. En hızlıH2S üretimi Fusobacterium nucleatum için görülmüş ve maksimum renk üretimine ulaşmıştır (Şekil 1).
Yöntemin hassasiyeti
Duyarlılık, farklı konsantrasyonlarda sodyum hidrosülfür (NaHS) BS çözeltisi ile karıştırılarak belirlendi. Görsel inceleme, çözeltinin renk derinliğinin HS−/S2− iyon konsantrasyonunun artmasıyla derinleştiğini ortaya koymuştur (Şekil 2). Yöntem içinH2S'nin algılama sınırı 0,2 mM'dir.
Şekil 1: Hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti. Fusobacterium nucleatum'da H2S üretimi, siyah BS çökelti oluşumu ile tespit edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bizmut sülfür (BS) yönteminin duyarlılığı. H2 S'nin tespiti için BS yöntemininduyarlılığı, en koyu siyah renk üretimine (+++++) renk üretimi yok (-) olarak kaydedildi. Soldan sağa, NaHS konsantrasyonları 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM ve 0 mM'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Tür | H2S üretim a | |
| Salmonella paratyphi A | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nükleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Stafilokok aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hidrofila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tablo 1:H2S üretiminin görsel değerlendirmesi. Farklı bakteri suşları tarafından hidrojen sülfür (H2S) üretimi, 96 delikli bir mikrotitre plakasında görsel yöntem kullanılarak ölçülmüştür. a: Renk üretimi yok (-) ile siyah renk üretiminden (+) siyah bizmut sülfür (BS) çökelmesi olarak kaydedilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hidrojen sülfür üretim testi, bakteri suşlarının tanımlanması ve farklılaştırılması için geleneksel fenotipik testlerden biridir. Birçok bakteri türü, su suyu gibi doğal ortamlarında hidrojen sülfür üretebilir. Bu bakteri türleri arasında Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., bazı Klebsiella sp., Escherichia coli suşları ve bazı anaerobik Clostridia türleri15,16 bulunur. Bununla birlikte, gelenekselH2S test yönteminin duyarlılığı düşüktür ve yöntem zaman alıcıdır17,18. GelenekselH2Stest ortamı, bakterilerin büyümesi üzerinde toksik etkileri olan PbAc'yi içerir ve kültür, yarı katı agar'a delinerek aşılanır. Ortamın alt kısmındaki oksijen içeriği düşüktür, bu nedenle aerobik bakteriler zayıf büyür. Bu nedenle, genellikle yanlış negatif sonuçlara yol açar.
Bu yöntemde kurşun veya demir iyonları yerine bizmut (III) kullandık. H2S üreten bir bakteri izolatı bizmut (III) klorüre maruz kaldığında, bir ikame reaksiyonu gerçekleşir. Bu reaksiyonda, klorür iyonu ve sülfit iyonu değişim pozisyonları, hidrojen klorik asit ve bizmut (III) sülfür üreten; Bu bizmut (III) sülfür ürünü, çözeltiden siyah bir katı olarak çökelir. Siyah çökeltinin renk derinliği, bakteri suşu tarafından üretilenH2S miktarını belirlemek için bir dereceye kadar kullanılabilir. BS yağışına ve yüksek tekrarlanabilirliğe, güvenilirliğe ve basitliğe dayanarak, çalışmada gösterilen yöntem,H2S üreten bakterilerin tespiti için bir hidrojen sülfür testi olarak kurulmuştur. Bu yöntemin kritik adımı, bizmut çözeltisinin taze olarak hazırlanması gerektiğidir. Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, bakterilerin büyümesinde ağır metal tuzu toksisitesi yoktur ve ayrıca hidrojen sülfür üreten aerobik bakterilerin tespiti için zaman kazandırabilir.
Bu yazıda, görsel siyah BS çökeltmesi üreten bizmut (III) klorür ve H2 S'nin reaksiyonuna dayanarak,H2S üreten bakterilerin tespiti için basit, hassas, ucuz ve yüksek verimli bir yöntem gösterilmiştir. Bu yöntem, kontamine numunelerin hızlı bir şekilde algılanması için kullanışlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) ve Çin Eczacılık Üniversitesi Öğretim Reformu Araştırma Projesi (2019XJYB18) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
