Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород, с модифицированным протоколом, используемым для осаждения сульфида висмута (BS). Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он легко поддается оценке и не требует специализированного оборудования.
Abstract
Сероводород (H2S) представляет собой токсичный газ, образующийся бактериями при протеолизе серосодержащих аминокислот и белков, который играет важную роль в здоровье человека. Производственный тест H2S является одним из важных тестов на биохимическую идентификацию бактерий. Традиционные методы не только утомительны и трудоемки, но и склонны к торможению роста бактерий из-за токсического действия солей тяжелых металлов в серосодержащей среде, что часто приводит к негативным результатам. Здесь мы разработали простой и чувствительный метод обнаружения H2S в бактериях. Этот метод представляет собой модифицированную версию осаждения сульфида висмута (BS), в которой используются 96-луночные прозрачные микротитровальные планшеты. Бактериальную культуру объединяли с раствором висмута, содержащим L-цистеин, и культивировали в течение 20 мин, в конце которого наблюдался черный осадок. Предел визуального обнаружения для H 2 S составлял0,2мМ. На основе визуального изменения цвета может быть достигнуто простое, высокопроизводительное и быстрое обнаружение бактерий, продуцирующих H2S. Таким образом, этот метод может быть использован для идентификации продукции H2S в бактериях.
Introduction
Бактерии, продуцирующие сероводород, могут использовать серосодержащие аминокислоты и белки для производства сероводорода (H2S). ПродукцияH2S обычно происходит у грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также у членов Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. и Shewanella spp.1. Эти бактерии обладают способностью восстанавливать сульфат до сероводорода (H2S) для получения энергии. Сероводород участвует в развитии бактериальной лекарственной устойчивости. H2S защищает бактерии от токсичности активных форм кислорода (АФК), тем самым противодействуя антибактериальному действию антибиотиков 2,3. H2S также оказывает важное физиологическое влияние на поддержание гомеостаза. Было показано, что на супрафизиологическом уровнеH2S глубоко токсичен для организма. В организме человекаH2S играет еще одну роль в качестве газовой сигнальной молекулы, которая участвует во множестве физиологических и патологических процессов. H2Sможет регулировать систолическую функцию сердца и играет важную физиологическую роль в расслаблении кровеносных сосудов, ингибировании ремоделирования сосудов и защите миокарда 4,5. H2Sтакже играет важную роль в регуляции нервной системы и пищеварительного тракта 6,7. Было обнаружено, что при воздействии бактерицидных антибиотиков бактерии продуцируют летальные активные формы кислорода (АФК), что приводит к гибели клеток 8,9,10,11.
Как распространенный биохимический тест на микробиологических лабораторных курсах, сероводородный тест является важным экспериментом по идентификации бактерий, особенно бактерий семейства Enterobacteriaceae. В настоящее время испытание сероводородом обычно проводится на большом количестве серосодержащих аминокислот и среде ацетата свинца, инокулированных тестируемыми бактериями. После периода инкубации (2-3 дня) результаты оцениваются путем наблюдения за тем, не почернела ли питательная среда или бумажная полоска из ацетата свинца из-за образования ацетатасвинца 11. Однако эти традиционные методы не только утомительны и трудоемки, но и склонны к торможению роста бактерий из-за токсического действия солей тяжелых металлов в серосодержащей среде, что часто приводит к негативным результатам. Разработан метод на основе висмута для обнаружения H2 S12,13. H2S может реагировать с висмутом с образованием осаждения черного сульфида висмута. Для того, чтобы провести реформу этого биохимического теста, необходимо создать простой и быстрый метод без побочных эффектов на рост бактерий. Здесь мы разработали простой метод обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород, выращенных в среде in vitro, с использованием сульфида висмута в качестве субстрата в формате 96-луночного микротитровального планшета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Бактериальные штаммы
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента использовали девять стандартных штаммов, включая Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris и Klebsiella pneumoniae (таблица 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vuigaris могут продуцировать H2S, как описано в предыдущей литературе1.
- Подготовка бактериального посева
- Перенесите одну бактериальную колонию Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 и Klebsiella pneumoniae из агаровой пластины Лурия-Бертани (LB) в 100 мл среды LB и культивируйте при 37 ° C в течение 12-16 ч до тех пор, пока бактериальная концентрация не составит около 1 x 109 клеток / мл (как указано OD600 = 1).
- Перенесите одну бактериальную колонию Fusobacterium nucleatum и Proteus vuigaris из агаровых пластин из триптиказного соевого бульона (TSB) в 100 мл среды TSB и культивируйте при 37 °C анаэробно в течение 24 ч до тех пор, пока бактериальная концентрация не составит около 1 x10,9 клеток/мл (как указано OD600 = 1).
2. Анализ обнаружения H2S
- Испытание на производство сероводорода
- Смешайте 100 мкл бактериальной культуры со 100 мкл вновь приготовленного раствора висмута (рН 8,0; 10 мМ хлорида висмута (III), 0,4 М триэтаноламина-HCl, 20 мМ пиридоксаль-5-фосфата моногидрата, 20 мМ ЭДТА и 40 мМ L-цистеина) в 96-луночных микротитровальных планшетах и культуре в течение 20 мин при 37 °C. Для каждого бактериального штамма проводите анализ в трех экземплярах.
- Через 20 минут проверьте, не изменилось ли цвет. Если цвет раствора меняется со светло-желтого на черный, это указывает на то, что бактерии способны продуцировать H2S. Повторите это измерение 3 раза.
- Чувствительность метода
- Определяют чувствительность метода, используя различные концентрации гидросульфида натрия (NaHS): 2 мМ, 1 мМ, 0,8 мМ, 0,6 мМ, 0,4 мМ, 0,2 мМ, 0,1 мМ и 0 мМ, смешанные с раствором BS 14.
- Определите наличие HS−/S2−, наблюдая за образованием черного осадка BS. Оцените цвет лунок, используя визуальную шкалу от отсутствия цветообразования (-) до получения самого темного черного цвета (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обнаружение бактерий, продуцирующих сероводород
Эффективность теста H2S была исследована с использованием чистых культур выбранных бактериальных штаммов, как указано в таблице 1. Результаты показали, что Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vuigaris могут продуцироватьH2S с черным осадком BS, в то время как Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila и Klebsiella pneumoniae не показали никакого черного осадка. Наиболее быстрая продукция H2S наблюдалась у Fusobacterium nucleatum, достигая максимальной цветопередачи (рис. 1).
Чувствительность метода
Чувствительность определяли путем смешивания различных концентраций гидросульфида натрия (NaHS) с раствором БС. Визуальный осмотр показал, что глубина цвета раствора углубляется с увеличением концентрации ионов HS−/S 2− (рис. 2). Предел обнаружения H 2 S для метода составляет0,2мМ.
Рисунок 1: Обнаружение бактерий, продуцирующих сероводород. ПродукцияH2S в ядре Fusobacterium была обнаружена путем образования черного осадка BS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Чувствительность метода сульфида висмута (БС). Чувствительность метода BS для обнаружения H2S регистрировалась как отсутствие получения цвета (-) до получения самого темного черного цвета (+++++). Слева направо концентрации NaHS составляют 2 мМ, 1 мМ, 0,8 мМ, 0,6 мМ, 0,4 мМ, 0,2 мМ, 0,1 мМ и 0 мМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Вид | H2S производство a | |
| Salmonella paratyphi A | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Золотистый стафилококк | _ | |
| Синегнойная палочка | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Таблица 1: Визуальная оценка производства H2S. Продукцию сероводорода (H2S) различными штаммами бактерий измеряли визуальным методом на 96-луночной микротитровальной пластинке. a: Регистрируется как осаждение сульфида висмута черного (БС) от отсутствия образования цвета (-) до образования черного цвета (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тест на производство сероводорода является одним из традиционных фенотипических тестов для идентификации и дифференциации бактериальных штаммов. Многие виды бактерий могут производить сероводород в своей естественной среде, например, в водной воде. Эти виды бактерий включают Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., некоторые штаммы Klebsiella sp., Escherichia coli и некоторые виды анаэробных Clostridia15,16. Однако чувствительность традиционного метода испытаний H2S низкая, и метод занимает много времени17,18. Традиционная тестовая среда H2S содержит PbAc, который оказывает токсическое воздействие на рост бактерий, и культура инокулируется в полутвердый агар. Содержание кислорода в нижней части среды низкое, поэтому аэробные бактерии плохо растут. Поэтому это часто приводит к ложноотрицательным результатам.
В этом методе мы использовали висмут (III) вместо ионов свинца или железа. Когда бактериальный изолят, продуцирующий H2S, подвергается воздействию хлорида висмута (III), происходит реакция замещения. В этой реакции ион хлорида и ион сульфида обмениваются местами, образуя соляную водородную кислоту и сульфид висмута (III); этот продукт сульфида висмута (III) выпадает в осадок из раствора в виде черного твердого вещества. Глубина окраски черного осадка может быть использована в некоторой степени для определения количестваH2S, продуцируемого бактериальным штаммом. Основываясь на осаждении BS и высокой воспроизводимости, надежности и простоте, метод, показанный в исследовании, был создан как сероводородный тест для обнаружения бактерий, продуцирующих H2S. Критическим этапом этого метода является то, что раствор висмута должен быть приготовлен в свежем виде. По сравнению с традиционным методом, нет токсичности солей тяжелых металлов при росте бактерий, и это также может сэкономить время для обнаружения аэробных бактерий, продуцирующих сероводород.
В этой работе, основанной на реакции хлорида висмута (III) и H 2 S, которая произвела осаждение визуального черного BS, показан простой, чувствительный, недорогой и высокопроизводительный метод обнаружения бактерий, продуцирующих H2S. Этот метод полезен для быстрого обнаружения загрязненных образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD) и Исследовательским проектом по реформе преподавания Китайского фармацевтического университета (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
