Summary
Hier presenteren we een protocol om waterstofsulfide producerende bacteriën te detecteren met een aangepast protocol dat wordt gebruikt voor bismutsulfide (BS) precipitatie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze gemakkelijk te evalueren is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.
Abstract
Waterstofsulfide (H2S) is een giftig gas geproduceerd door bacteriën in de proteolyse van zwavelhoudende aminozuren en eiwitten dat een belangrijke rol speelt in de menselijke gezondheid. De H2S-productietest is een van de belangrijke bacteriële biochemische identificatietests. De traditionele methoden zijn niet alleen vervelend en tijdrovend, maar ook vatbaar voor remming van bacteriegroei als gevolg van het toxische effect van zware metaalzouten in zwavelhoudend medium, wat vaak tot negatieve resultaten leidt. Hier hebben we een eenvoudige en gevoelige methode ontwikkeld om H2S in bacteriën te detecteren. Deze methode is een aangepaste versie van bismutsulfide (BS) precipitatie die 96-well transparante microtiterplaten gebruikt. Bacteriecultuur werd gecombineerd met bismutoplossing die L-cysteïne bevatte en gedurende 20 minuten gekweekt, aan het einde waarvan een zwart neerslag werd waargenomen. De visuele detectiegrens voor H 2 S was0,2mM. Op basis van de visuele kleurverandering kan de eenvoudige, hoge doorvoer en snelle detectie van H2S-producerende bacteriën worden bereikt. Samenvattend kan deze methode worden gebruikt om H2S-productie in bacteriën te identificeren.
Introduction
Waterstofsulfide producerende bacteriën kunnen zwavelhoudende aminozuren en eiwitten gebruiken om waterstofsulfide (H2S) te produceren. De productie van H2S komt meestal voor in gramnegatieve Enterobacteriaceae-familiebacteriën en ook in leden van Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. en Shewanella spp.1. Deze bacteriën hebben het vermogen om sulfaat te reduceren tot waterstofsulfide (H2S) om energie te verkrijgen. Waterstofsulfide is betrokken bij de ontwikkeling van bacteriële resistentie tegen geneesmiddelen. H2 S beschermt bacteriën tegen de toxiciteit van reactieve zuurstofsoorten (ROS), waardoor het antibacteriële effect van antibiotica wordt tegengewerkt 2,3. H2S heeft ook een belangrijk fysiologisch effect bij het handhaven van homeostase. Op suprafysiologische niveaus is aangetoond dat H2S zeer giftig is voor het lichaam. In het menselijk lichaam heeft H2S een andere rol als een gassignaleringsmolecuul dat betrokken is bij een verscheidenheid aan fysiologische en pathologische processen. H2S kan de systolische functie van het hart reguleren en speelt een belangrijke fysiologische rol bij het ontspannen van bloedvaten, het remmen van vasculaire remodellering en het beschermen van het myocardium 4,5. H2S speelt ook een belangrijke rol bij het reguleren van het zenuwstelsel en het spijsverteringskanaal 6,7. Het is gebleken dat bacteriën bij blootstelling aan bacteriedodende antibiotica dodelijke reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceren die leiden tot celdood 8,9,10,11.
Als een veel voorkomende biochemische test in microbiologische laboratoriumcursussen, is de waterstofsulfidetest een belangrijk experiment in de identificatie van bacteriën, met name bacteriën van de familie Enterobacteriaceae. Op dit moment wordt de waterstofsulfidetest meestal uitgevoerd op een groot aantal zwavelhoudende aminozuren en loodacetaatmedium dat is ingeënt met de te testen bacteriën. Na een incubatieperiode (2-3 dagen) worden de resultaten beoordeeld door te observeren of het kweekmedium of de papierstrook voor loodacetaat zwart is geworden vanwege de productie van loodacetaat11. Deze traditionele methoden zijn echter niet alleen vervelend en tijdrovend, maar ook vatbaar voor remming van bacteriegroei als gevolg van het toxische effect van zware metaalzouten in zwavelhoudend medium, wat vaak tot negatieve resultaten leidt. Er is een op bismut gebaseerde methode vastgesteld voor de detectie van H2S12,13. H2S kan reageren met bismut en vormt zwarte bismutsulfideprecipitatie. Om een hervorming voor deze biochemische test uit te voeren, moet een eenvoudige en snelle methode zonder bijwerkingen op de bacteriegroei worden vastgesteld. Hier hebben we een eenvoudige methode opgezet voor de detectie van waterstofsulfideproducerende bacteriën gekweekt in een in vitro omgeving met bismutsulfide als substraat in een 96-well microtiterplaatformaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriestammen
OPMERKING: Voor dit experiment werden negen standaardstammen gebruikt, waaronder Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris en Klebsiella pneumoniae (tabel 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa en Proteus vuigaris kunnen H2S produceren, zoals beschreven in eerdere literatuur1.
- Bereiding van bacteriecultuur
- Breng één bacteriekolonie Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 en Klebsiella pneumoniae over van een Luria-Bertani (LB) agarplaat naar 100 ml LB-medium en kweek bij 37 °C gedurende 12-16 uur totdat de bacteriële concentratie ongeveer 1 x 109 cellen / ml is (zoals aangegeven door OD600 = 1).
- Breng één bacteriekolonie Fusobacterium nucleatum en Proteus vuigaris over van trypticase sojabouillon (TSB) agarplaten naar 100 ml TSB-medium en kweek gedurende 24 uur anaeroob bij 37 °C totdat de bacteriële concentratie ongeveer 1 x 109 cellen/ml is (zoals aangegeven door OD600 = 1).
2. H2S detectietest
- Waterstofsulfideproductietest
- Meng 100 μL bacteriecultuur met 100 μL nieuw bereide bismutoplossing (pH 8,0; 10 mM bismut(III)chloride, 0,4 M triethanolamine-HCl, 20 mM pyridoxaal 5-fosfaatmonohydraat, 20 mM EDTA en 40 mM L-cysteïne) in de 96-well microtiterplaten en kweek gedurende 20 minuten bij 37 °C. Voer voor elke bacteriestam de analyse in drievoud uit.
- Controleer na 20 minuten op kleurverandering. Als de kleur van de oplossing verandert van lichtgeel naar zwart, geeft dit aan dat de bacterie in staat is om H2S te produceren.
- Gevoeligheid van de methode
- Bepaal de gevoeligheid van de methode met behulp van verschillende concentraties natriumhydrosulfide (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM en 0 mM, gemengd met BS-oplossing 14.
- Bepaal de aanwezigheid van HS−/S2− door de vorming van een zwart BS-neerslag waar te nemen. Scoor de kleur van de putten met behulp van een visuele schaal van geen kleurproductie (-) tot donkerste zwarte kleurproductie (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detectie van waterstofsulfide producerende bacteriën
De prestaties van de H2S-test werden onderzocht met behulp van zuivere culturen van geselecteerde bacteriestammen, zoals vermeld in tabel 1. De resultaten gaven aan dat Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa en Proteus vuigaris H2S kunnen produceren met zwart BS-neerslag, terwijl Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila en Klebsiella pneumoniae geen zwart neerslag vertoonden. De snelste H2S-productie werd gezien voor Fusobacterium nucleatum en bereikte de maximale kleurproductie (figuur 1).
Gevoeligheid van de methode
De gevoeligheid werd bepaald door verschillende concentraties natriumhydrosulfide (NaHS) te mengen met BS-oplossing. Visuele inspectie toonde aan dat de kleurdiepte van de oplossing zich verdiepte met een toenemende ionenconcentratie van HS−/S 2− (figuur 2). De detectiegrens van H 2 S voor de methode is0,2mM.
Figuur 1: Detectie van waterstofsulfide producerende bacteriën. De productie van H2S in Fusobacterium nucleatum werd gedetecteerd door de zwarte BS-neerslagvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gevoeligheid van de bismutsulfide (BS) methode. De gevoeligheid van de BS-methode voor detectie van H2S werd geregistreerd als geen kleurproductie (-) tot donkerste zwarte kleurproductie (+++++). Van links naar rechts zijn de NaHS-concentraties 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM en 0 mM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Soort | H2S produktie a | |
| Salmonella paratyphi Een | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | | _ | |
Tabel 1: Visuele beoordeling van de H2S-productie. De productie van waterstofsulfide (H2S) door verschillende bacteriestammen werd gemeten met behulp van de visuele methode in een 96-well microtiterplaat. a: Geregistreerd als zwarte bismutsulfide (BS) neerslag van geen kleurproductie (-) tot zwarte kleurproductie (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De waterstofsulfideproductietest is een van de conventionele fenotypische tests voor de identificatie en differentiatie van bacteriestammen. Veel bacteriesoorten kunnen waterstofsulfide produceren in hun natuurlijke omgeving, zoals waterwater. Deze bacteriesoorten omvatten Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., sommige stammen van Klebsiella sp., Escherichia coli en sommige soorten anaerobe Clostridia15,16. De gevoeligheid van de traditionele H2S-testmethode is echter laag en de methode istijdrovend 17,18. Het traditionele H2S-testmedium bevat PbAc, dat toxische effecten heeft op de groei van bacteriën, en de cultuur wordt met prik ingeënt tot halfvaste agar. Het zuurstofgehalte in het onderste deel van het medium is laag, dus de aerobe bacteriën groeien slecht. Daarom leidt het vaak tot vals-negatieve resultaten.
Bij deze methode gebruikten we bismut (III) in plaats van lood- of ferromenen. Wanneer een bacterieel isolaat dat H2S produceert wordt blootgesteld aan bismut (III) chloride, vindt een substitutiereactie plaats. In deze reactie wisselen de chloride-ionen en sulfide-ionen posities uit, waarbij waterstofchlorzuur en bismut (III) sulfide worden geproduceerd; dit bismut (III) sulfideproduct slaat neer uit de oplossing als een zwarte vaste stof. De kleurdiepte van het zwarte neerslag kan tot op zekere hoogte worden gebruikt om de hoeveelheid H2S te bepalen die door de bacteriestam wordt geproduceerd. Op basis van de BS-precipitatie en de hoge reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en eenvoud, werd de methode die in de studie werd getoond, vastgesteld als een waterstofsulfidetest voor de detectie van H2S-producerende bacteriën. De kritieke stap van deze methode is dat de bismutoplossing vers moet worden bereid. In vergelijking met de traditionele methode is er geen zouttoxiciteit voor zware metalen in de groei van bacteriën en het kan ook tijd besparen voor de detectie van waterstofsulfide producerende aërobe bacteriën.
In dit artikel, gebaseerd op de reactie van bismut (III) chloride en H 2 S, die visuele BS-neerslag produceerden, wordt een eenvoudige, gevoelige, goedkope en high-throughput methode getoond voor de detectie van H2S producerende bacteriën. Deze methode is nuttig voor de snelle detectie van besmette monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) en het Teaching Reform Research Project van de China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
