Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera vätesulfidproducerande bakterier med ett modifierat protokoll som används för utfällning av vismutsulfid (BS). De viktigaste fördelarna med denna metod är att den är lätt att utvärdera och inte kräver specialutrustning.
Abstract
Vätesulfid (H2S) är en giftig gas som produceras av bakterier vid proteolys av svavelhaltiga aminosyror och proteiner som spelar en viktig roll för människors hälsa. H2S-produktionstestet är ett av de viktiga bakteriella biokemiska identifieringstesterna. De traditionella metoderna är inte bara tråkiga och tidskrävande utan också benägna att hämma bakterietillväxt på grund av den toxiska effekten av tungmetallsalter i svavelhaltigt medium, vilket ofta leder till negativa resultat. Här etablerade vi en enkel och känslig metod för att detekteraH2Si bakterier. Denna metod är en modifierad version av vismutsulfid (BS) utfällning som använder 96-väl transparenta mikrotiterplattor. Bakteriekulturen kombinerades med vismutlösning innehållande L-cystein och odlades i 20 minuter, i slutet av vilken en svart fällning observerades. Den visuella detektionsgränsen för H 2 S var0,2mM. Baserat på den visuella färgförändringen kan den enkla, höga genomströmningen och snabba detektionen avH2S-producerandebakterier uppnås. Sammanfattningsvis kan denna metod användas för att identifieraH2S-produktioni bakterier.
Introduction
Vätesulfidproducerande bakterier kan utnyttja svavelhaltiga aminosyror och proteiner för att producera vätesulfid (H2S). Produktionen avH2Ssker vanligtvis i gramnegativa Enterobacteriaceae-familjebakterier och även hos medlemmar av Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. och Shewanella spp.1. Dessa bakterier har förmågan att reducera sulfat till vätesulfid (H2S) för att erhålla energi. Vätesulfid har varit inblandad i utvecklingen av bakteriell läkemedelsresistens. H2Sskyddar bakterier från toxiciteten hos reaktiva syreradikaler (ROS), vilket motverkar den antibakteriella effekten av antibiotika 2,3. H2Shar också en viktig fysiologisk effekt för att upprätthålla homeostas. Vid suprafysiologiska nivåer harH2Svisat sig vara djupt giftigt för kroppen. I människokroppen harH2Sen annan roll som en gassignalmolekyl som är involverad i en mängd olika fysiologiska och patologiska processer. H2Skan reglera hjärtats systoliska funktion och spelar en viktig fysiologisk roll för att slappna av blodkärlen, hämma vaskulär ombyggnad och skydda hjärtmuskeln 4,5. H2Sspelar också en viktig roll i regleringen av nervsystemet och mag-tarmkanalen 6,7. Det har visat sig att bakterier, när de utsätts för bakteriedödande antibiotika, producerar dödliga reaktiva syrearter (ROS) som leder till celldöd 8,9,10,11.
Som ett vanligt biokemiskt test i mikrobiologiska laboratoriekurser är vätesulfidtestet ett viktigt experiment vid identifiering av bakterier, särskilt bakterier av familjen Enterobacteriaceae. För närvarande utförs vätesulfidtestet vanligtvis på ett stort antal svavelhaltiga aminosyror och blyacetatmedium inokulerade med bakterierna som ska testas. Efter en inkubationsperiod (2-3 dagar) bedöms resultaten genom att observera om odlingsmediet eller blyacetatpappersremsan är svärtad på grund av blyacetatproduktion11. Dessa traditionella metoder är emellertid inte bara tråkiga och tidskrävande utan också benägna att hämma bakterietillväxt på grund av den toxiska effekten av tungmetallsalter i svavelhaltigt medium, vilket ofta leder till negativa resultat. En vismutbaserad metod har fastställts för detektion av H2S12,13. H2Skan reagera med vismut och bilda utfällning av svart vismutsulfid. För att genomföra en reform för detta biokemiska test måste en enkel och snabb metod utan biverkningar på bakterietillväxt etableras. Här satte vi upp en enkel metod för detektion av vätesulfidproducerande bakterier odlade i en in vitro-miljö med vismutsulfid som substrat i ett 96-brunns mikrotiterplattformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriestammar
OBS: För detta experiment användes nio standardstammar, inklusive Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris och Klebsiella pneumoniae (tabell 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa och Proteus vuigaris kan produceraH2S, som beskrivits i tidigare litteratur1.
- Framställning av bakteriekultur
- Överför en bakteriekoloni av Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 och Klebsiella pneumoniae från en Luria-Bertani (LB) agarplatta till 100 ml LB-medium och odling vid 37 °C i 12-16 timmar tills bakteriekoncentrationen är ca 1 x 109 celler/ml (vilket indikeras av OD600 = 1).
- Överför en bakteriekoloni av Fusobacterium nucleatum och Proteus vuigaris från tryptikassojabuljongplattor (TSB) till 100 ml TSB-medium och odla vid 37 °C anaerobt i 24 timmar tills bakteriekoncentrationen är ca 1 x 109 celler/ml (vilket indikeras av OD600 = 1).
2. H2S-detektionstest
- Test för produktion av vätesulfid
- Blanda 100 μl bakteriekultur med 100 μl nyberedd vismutlösning (pH 8,0; 10 mM vismut (III) klorid, 0,4 M trietanolamin-HCl, 20 mM pyridoxal 5-fosfatmonohydrat, 20 mM EDTA och 40 mM L-cystein) i 96-brunns mikrotiterplattor och kultur i 20 min vid 37 °C. För varje bakteriestam, utför analysen i tre exemplar.
- Kontrollera om färgen ändras efter 20 minuter. Om lösningens färg ändras från ljusgul till svart, indikerar detta att bakterierna kan produceraH2S. Upprepa denna mätning 3x.
- Metodens känslighet
- Bestäm metodens känslighet med olika koncentrationer av natriumhydrosulfid (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM och 0 mM, blandat med BS-lösning 14.
- Bestäm närvaron av HS − / S2 − genom att observera bildandet av en svart BS-fällning. Poängsätt brunnarnas färg med hjälp av en visuell skala från ingen färgproduktion (-) till mörkaste svarta färgproduktion (++++++).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detektion av vätesulfidproducerande bakterier
Prestanda för H2S-testet undersöktes med användning av rena kulturer av utvalda bakteriestammar, som anges i tabell 1. Resultaten indikerade att Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa och Proteus vuigaris kan produceraH2Smed svart BS-fällning, medan Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila och Klebsiella pneumoniae inte visade någon svart fällning. Den snabbasteH2S-produktionensågs för Fusobacterium nucleatum och nådde maximal färgproduktion (figur 1).
Metodens känslighet
Känsligheten bestämdes genom att blanda olika koncentrationer av natriumhydrosulfid (NaHS) med BS-lösning. Visuell inspektion visade att lösningens färgdjup fördjupades med en ökande jonkoncentration av HS − / S 2 − (figur 2). Detektionsgränsen förH2Sför metoden är 0,2 mM.
Figur 1: Detektion av vätesulfidproducerande bakterier. Produktionen avH2Si Fusobacterium nucleatum detekterades genom svart BS-fällningsbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Känslighet för vismutsulfidmetoden (BS). BS-metodens känslighet för detektion avH2Sregistrerades som ingen färgproduktion (-) till mörkaste svarta färgproduktion (+++++). Från vänster till höger är NaHS-koncentrationerna 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM och 0 mM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Art | H2S produktion a | |
| Salmonella paratyphi A | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nukleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tabell 1: Visuell bedömning av H2S-produktion. Produktionen av vätesulfid (H2S) av olika bakteriestammar mättes med den visuella metoden i en 96-brunns mikrotiterplatta. a: Registreras som utfällning av svart vismutsulfid (BS) från ingen färgproduktion (-) till svart färgproduktion (+).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vätesulfidproduktionstestet är ett av de konventionella fenotypiska testerna för identifiering och differentiering av bakteriestammar. Många bakteriearter kan producera vätesulfid i sin naturliga miljö, såsom vattenvatten. Dessa bakteriearter inkluderar Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., vissa stammar av Klebsiella sp., Escherichia coli och vissa arter av anaerob Clostridia15,16. Känsligheten hos den traditionella H2S-testmetoden är dock låg och metoden är tidskrävande17,18. Det traditionella H2S-testmediet innehåller PbAc, som har toxiska effekter på bakterietillväxten, och kulturen punkteras inokuleras i halvfast agar. Syrehalten i den nedre delen av mediet är låg, så de aeroba bakterierna växer dåligt. Därför leder det ofta till falskt negativa resultat.
I denna metod använde vi vismut (III) istället för bly eller järnjoner. När ett bakterieisolat som producerarH2Sexponeras för vismut (III) klorid sker en substitutionsreaktion. I denna reaktion är kloridjon- och sulfidjonbytespositionerna, vilket ger väteklorsyra och vismut (III) sulfid; denna vismut (III) sulfidprodukt fälls ut ur lösningen som ett svart fast ämne. Färgdjupet hos den svarta fällningen kan i viss utsträckning användas för att bestämma mängdenH2Ssom produceras av bakteriestammen. Baserat på BS-utfällningen och den höga reproducerbarheten, tillförlitligheten och enkelheten fastställdes metoden som visades i studien som ett vätesulfidtest för detektion avH2S-producerandebakterier. Det kritiska steget i denna metod är att vismutlösningen ska beredas färskt. Jämfört med den traditionella metoden finns det ingen tungmetallsalttoxicitet i tillväxten av bakterier, och det kan också spara tid för detektering av vätesulfidproducerande aeroba bakterier.
I denna artikel, baserad på reaktionen mellan vismut (III) klorid och H2S, som producerade visuell svart BS-utfällning, visas en enkel, känslig, billig och hög genomströmningsmetod för detektion avH2S-producerandebakterier. Denna metod är användbar för snabb upptäckt av kontaminerade prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) och Teaching Reform Research Project of China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
