Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים

Published: August 2, 2022 doi: 10.3791/64216
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, *1,4, *1,5
1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Centre for Advanced Imaging, Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology and ARC Training Centre for Innovation in Biomedical Imaging Technology, The University of Queensland, 3School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 4Mater Research and Mater Research Institute, The University of Queensland, 5Pathology Queensland, Royal Brisbane Women's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

גרורות במוח הן גורם לתחלואה קשה ולתמותה בחולי סרטן. רוב המודלים של עכברי גרורות במוח מסובכים על ידי גרורות מערכתיות מבלבלות ניתוח של תמותה ותוצאות התערבות טיפולית. מוצג כאן פרוטוקול להזרקת קרוטיד פנימית של תאים סרטניים המייצר גידולים תוך גולגולתיים עקביים עם גידולים סיסטמיים מינימליים.

Abstract

גרורות במוח הן גורם לתחלואה קשה ולתמותה בחולי סרטן. היבטים קריטיים של מחלות גרורתיות, כגון המיקרו-סביבה העצבית המורכבת והאינטראקציה בין התאים הסטרומלים, אינם ניתנים לשכפול לחלוטין באמצעות מבחני מבחנה ; לפיכך, מודלים של בעלי חיים הם קריטיים לחקירה ולהבנה של ההשפעות של התערבות טיפולית. עם זאת, רוב שיטות ההשתרשות של גידולי מוח אינן מייצרות גרורות במוח באופן עקבי מבחינת מסגרת הזמן ועומס הגידול. מודלים של גרורות במוח שנוצרו על ידי הזרקה תוך-לבבית של תאים סרטניים עלולים לגרום לעומס גידול חוץ-גולגולתי לא מכוון ולהוביל לתחלואה ותמותה גרורתית. למרות שהזרקה תוך גולגולתית של תאים סרטניים יכולה להגביל את היווצרות הגידול החוץ-גולגולתי, יש לה מספר אזהרות, כגון התאים המוזרקים היוצרים לעתים קרובות מסת גידול יחידה באתר ההזרקה, מעורבות גבוהה של לפטומנינגיאל, ופגיעה בכלי הדם במוח במהלך חדירת המחטים. פרוטוקול זה מתאר מודל עכברי של גרורות במוח הנוצרות על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי. שיטה זו מייצרת גידולים תוך גולגולתיים באופן עקבי ללא מעורבות של איברים אחרים, ומאפשרת הערכה של גורמים טיפוליים לגרורות במוח.

Introduction

גרורות במוח הן ממאירות שכיחה הקשורה לפרוגנוזה גרועה מאוד 1,2. הטיפול הסטנדרטי בחולי גרורות במוח הוא רב-מודאלי, המורכב מנוירוכירורגיה, הקרנות מוח שלמות ו/או רדיוכירורגיה סטריאוטקטית, בהתאם למצב הבריאותי הכללי של החולים, נטל המחלה החוץ-גולגולתית ומספר ומיקום הגידולים במוח 3,4. חולים עם עד שלושה נגעים תוך גולגולתיים זכאים לכריתה כירורגית או רדיוכירורגיה סטריאוטקטית, בעוד שטיפול בהקרנות למוח שלם מומלץ לחולים עם נגעים מרובים כדי למנוע את הסיכון לזיהום הקשור לניתוח ובצקת5. עם זאת, הקרנות מוח שלמות יכולות לגרום נזק למבנים מוחיים רגישים, מה שתורם לאיכות חיים ירודה6.

טיפול סיסטמי הוא גישה אלטרנטיבית והגיונית לא פולשנית לטיפול בחולים עם נגעים מרובים7. עם זאת, זה פחות נחשב בשל הרעיון ארוך השנים כי טיפולים סיסטמיים יש יעילות ירודה כי משלוח פסיבי של תרופות ציטוטוקסיות דרך זרם הדם לא יכול להשיג רמות טיפוליות במוח ללא הסיכון של רעילות לא בטוחה8. פרדיגמה זו מתחילה להשתנות עם הטיפול המערכתי שאושר לאחרונה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) (tucatinib עם trastuzumab ו- capecitabine המצוין עבור גרורות גרורתיות HER2+ סרטן השד)9,10,11,12 והעדכון בהנחיות הטיפול כך שיכלול התייחסות לאפשרויות טיפול סיסטמיות לחולות גרורות במוח13,14.

בהקשר זה, התפתחויות בתחום הטיפול הממוקד המולקולרי, האימונותרפיה ומערכות אספקת תרופות חלופיות, כגון נשא ננו-תרופה ממוקד, יכולות להתגבר על האתגרים של טיפול בגרורות במוח15,16,17,18. בנוסף, גישות כימיות ומכניות לשיפור אספקת תרופות באמצעות חלחול של מחסום גידול המוח נחקרות גםהן 19,20. כדי לחקור ולמטב גישות כאלה כך שיתאימו למטרה, חיוני להשתמש במודלים פרה-קליניים שלא רק משקפים את הפיזיולוגיה המורכבת של גרורות במוח, אלא גם מאפשרים ניתוח אובייקטיבי של תגובת תרופות תוך גולגולתית.

באופן כללי, הגישות הנוכחיות למודל גרורות במוח in vivo כוללות הזרקה תוך-לבבית (חדר שמאלי), תוך-ורידי (בדרך כלל וריד זנב), תוך-גולגולתי או תוך-גולגולתי (עורק צוואר משותף) של תאים סרטניים בעכברים 21,22,23,24,25,26,27 . מלבד אסטרטגיות השתלת גידולים, מודלים של עכברים מהונדסים גנטית שבהם היווצרות הגידול מופעלת על ידי הסרת גנים מדכאי גידול או הפעלה של אונקוגנים שימושיים למידול גידולים. עם זאת, דווח כי רק כמה מודלים של עכברים מהונדסים גנטית מייצרים גידולים משניים ועוד פחות מכך מייצרים גרורות מוחיותבאופן אמין 28,29,30.

שיטות חריטה כגון הזרקה תוך לבבית (חדר שמאלי) והזרקה תוך ורידית (בדרך כלל וריד זנב) מחקות את ההפצה המערכתית של סרטן. מודלים אלה מייצרים בדרך כלל נגעים באיברים מרובים (למשל, מוח, ריאות, כבד, כליות, טחול) בהתאם למצע הנימי שלוכד את רוב תאי הגידול במהלך 'המעבר הראשון' שלהם במחזור הדם31. עם זאת, שיעורים לא עקביים של השתלת מוח ידרשו יותר בעלי חיים כדי להשיג את גודל המדגם עבור הכוח הסטטיסטי הרצוי. מספר תאי הגידול שבסופו של דבר מתבססים במוח באמצעות שיטות הזרקה תוך-לבביות ותוך-ורידיות אלה משתנה. לפיכך, נטל הגידול בגרורות במוח יכול להשתנות בין בעלי חיים וההבדל בהתקדמות יכול להפוך את הסטנדרטיזציה של ציר הזמן הניסויי ואת הפרשנות של התוצאות לאתגר. נטל הגידול החוץ-גולגולתי עלול להוביל לתמותה של גרורות שאינן מוחיות, מה שהופך מודלים אלה לבלתי מתאימים להערכת יעילות תוך גולגולתית. קווי תאים טרופיים במוח הוקמו באמצעות תהליכי ברירה של תאי שיח מלאכותיים כדי להפחית את ההתבססות החוץ-גולגולתית, אך שיעורי הקליטה לא היו עקביים, ותהליך הברירה הקלונלית יכול להפחית את ההטרוגניות שנמצאת בדרך כלל בגידולים אנושיים32.

שיטות השתלה ספציפיות למוח, כגון הזרקה תוך-גולגולתית ותוך-גולגולתית, מאפשרות מידול עקבי ויעיל יותר של גרורות במוח. בשיטה התוך גולגולתית33, תאים סרטניים מוזרקים בדרך כלל לקליפת המוח הקדמית, אשר מייצרת צמיחת גידול מהירה וניתנת לשחזור עם מעורבות מערכתית נמוכה. בעוד שההליך נסבל היטב עם תמותה נמוכה33, האזהרות הן שמדובר בגישה גסה יחסית המציגה במהירות בולוס (מקומי) של תאים במוח ואינה מדגימה פתוגנזה מוקדמת של גרורות במוח. המחט פוגעת בכלי הדם של רקמת המוח, מה שגורם לדלקת מקומית 5,34. מניסיון, קיימת נטייה להזרקת תאי הגידול לרפלוקס במהלך הסרת המחט, מה שמוביל למעורבות לפטומנינגיאלית. לחלופין, השיטה התוך-קרוטית מעבירה תאים לעורק הצוואר המשותף עם מיקרו-ווסקולטורה במוח כמצע הנימי הראשון שנתקלו בו, ומדגימה הישרדות במחזור הדם, בפזרנות ובקולוניזציה24. בהסכמה עםאחרים 25, הניסיון שלנו עם שיטה זו מצא כי היא יכולה לגרום לגידולים בפנים עקב העברה לא מכוונת של תאים סרטניים דרך עורק הצוואר החיצוני למיטות נימי ברקמות אלה (נתונים שלא פורסמו). ניתן למנוע גידולים בפנים על-ידי קשירת עורק הצוואר החיצוני לפני הזרקת עורק הצוואר הנפוץ (איור 1). בהמשך המאמר, שיטה זו מכונה 'הזרקת עורק הצוואר הפנימי'. מניסיון, שיטת ההזרקה של עורק הצוואר הפנימי מייצרת באופן עקבי גרורות במוח עם מעט מאוד אירועים סיסטמיים, והצליחה לייצר מודלים של גרורות במוח של סוגי סרטן ראשוניים שונים (למשל, מלנומה, סרטן השד והריאות) (איור 1). החסרונות הם שזה מאתגר מבחינה טכנית, גוזל זמן, פולשני, ודורש אופטימיזציה זהירה של מספרי תאים וציר זמן ניטור. לסיכום, הן שיטות ההזרקה התוך-גולגולתיות והן שיטות ההזרקה של עורקי הצוואר הפנימיים מייצרות מודלים של עכברים המתאימים להערכת ההשפעה הטיפולית על תועלת ההישרדות הקשורה לגידול במוח.

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ההזרקה של עורק הצוואר הפנימי כדי לייצר מודל עכברי של גרורות במוח כמעט ללא מעורבות מערכתית ולכן מתאים להערכה פרה-קלינית של הפצת תרופות ויעילות של טיפולים ניסיוניים.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזרקת עורק הצוואר הפנימי עבור גרורות במוח. הזרקת עורק הצוואר הפנימי עם קשירת עורק הצוואר החיצוני יכולה לייצר באופן אמין מודל גרורות במוח מסוגי סרטן ראשוניים שונים. בפרוטוקול זה, שלוש ליגטורות ממוקמות על עורק הצוואר (מבואר כ- L1-L3 באיור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים נערכו במסגרת ההנחיות של ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת קווינסלנד (UQCCR/186/19), והקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.

1. הכנת תאים סרטניים להזרקה

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקו התאים של סרטן השד האנושי, BT-474 (BT474). BT474 תורבית במדיום גדילה מלא הכולל מדיום RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% אינסולין. התאים נשמרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני באטמוספירת האוויר. לאמת את קו התא על ידי טנדם לווייני חוזר על בדיקה35, לאשר את הביטוי של חלבון הכתב (למשל, לוציפראז) אם בכלל, ולבדוק זיהום מיקופלסמה.

  1. זרע BT474 תאים סרטניים בצפיפות זריעה של 2.0 x 106 תאים לתוך בקבוק T75 באמצעות 10 מ"ל של מדיית גדילה מלאה ותרבית (ב 37 °C עם 5% CO2) עד 70%-80% מפגש לפני ההזרקה.
  2. ביום ההזרקה, יש להשליך את מדיית הגדילה ולשטוף את התא מונולאייר עם מלח חצוב פוספט (PBS) פעמיים.
  3. הוסיפו 5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תרבית תאים שחוממה מראש (ראו טבלת חומרים) ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד לניתוק התאים. לאחר 5 דקות, יש להקיש בעדינות על הבקבוקון כדי לסייע בניתוק התא.
  4. יש להוסיף 5 מ"ל של מדיית גדילה מלאה המכילה 10% סרום בקר עוברי כדי להרוות את פעילות מגיב הדיסוציאציה.
  5. החזירו את התאים בעדינות על ידי פיפטינג כדי להפחית את גושי התאים.
  6. העבר את מתלה התא לצינור של 50 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 180 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. דקנו את תמיסת העל והחזירו את כדור התא ב-10 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של Hank (HBSS) ללא סידן ומגנזיום כדי למזער את היווצרות הגושים בתאים.
  8. צנטריפוגה של מתלה התא ב 180 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. דקאנט את הסופר-נאטנט כדי להסיר ריאגנט סרום/דיסוציאציה שיורי ולהחיות את כדור התא ב-3 מ"ל של HBSS.
  10. מניחים מסננת תאים בקוטר 100 מיקרומטר על צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל ומעבירים את מתלה התא כדי להסיר גושים של תאים.
    הערה: תרחיף של תא בודד חיוני כדי למזער את חסימת כלי הדם ואת הסיכון לשבץ בהזרקה.
  11. חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות הרחקת Trypan Blue והמוציטומטר בשיטות סטנדרטיות.
  12. דלל את תרחיף התא עם HBSS לריכוז תאים של 2.5 x 106 תאים למ"ל.
  13. השאירו את הצינור אופקי על קרח ונדנדו בעדינות את הצינור מעת לעת כדי למזער גושים. ניתן לאחסן את תרחיף התא על קרח למשך 6 שעות לכל היותר.
    הערה: נדנדה נעשתה באופן ידני אך ניתן לעשות זאת גם באמצעות שייקר בסל"ד נמוך.

2. הכנת העכבר להליך

הערה: במחקר זה, בני 4-5 שבועות, נעשה שימוש בנקבות עכברי NOD scid. הציגו לעכברים מזון להתאוששות מתזונה רכה (למשל, ג'ל דיאטה, הידרוג'ל, צ'או עכבר מעוך) 3 ימים לפני ההליך כדי לעודד האכלה לאחר ההליך.

  1. כלי ניתוח אוטוקלב. יש לרסס ולנגב את אזור הניתוח והציוד בחומר חיטוי משטחים, ואחריו 70% אתנול.
  2. הניחו שטיחון חום לבעלי חיים מתחת ללוח הניתוח כדי למנוע היפותרמיה. הפעל אותו 30 דקות לפני הניתוח. יש לרסס ולנגב את לוח הניתוח בחומר חיטוי משטחי ואחריו 70% אתנול.
  3. הכינו כלוב ביתי נקי לבעלי חיים וכרית חימום חמה להתאוששות.
  4. יש ללבוש ציוד מגן אישי נקי (חלוק, מסכה, רשת שיער וכפפות). שמרו על סטריליות לאורך כל ההליך על ידי שימוש בכפפות בדיקה נקיות ובטכניקה של 'טיפים למכשירים בלבד'.
  5. הרדמת העכבר עם תא הרדמה באמצעות 5% איזופלורן עם זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה עד שהעכבר מאבד את רפלקס הדוושה.
  6. הוציאו את החיה מהתא והניחו אותה בקונוס אף המספק 2% איזופלוראן בזרימת חמצן של 2 ליטר לדקה להליך הכירורגי הנותר.
  7. עכבר אגרוף לאוזן לזיהוי והשתמש בקוצץ חשמלי כדי לגלח את הפרווה מאזור הצוואר. יש לנקות את עודפי השיער מעור חשוף באמצעות סרט הדבקה.
  8. שקול את העכבר לחישוב מינוני תרופות ההרדמה ומשככי הכאבים הנדרשים. יש לתת בופרנורפין ומלוקסיקם ב-50 מיקרוגרם/ק"ג ו-1 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, באמצעות הזרקה תת-עורית.
  9. העבר את העכבר ללוח ניתוחים חם וחבר את חרוט האף באמצעות סרט הדבקה.
  10. יש למרוח חומר סיכה עיני על העיניים כדי למנוע התייבשות.
  11. אבטח את העכבר בעדינות על ידי חיבור השיניים החותכות העליונות באמצעות חוט המודבק ללוח הניתוח, ולאחר מכן הקשה על הרגליים הקדמיות והאחוריות. צעד זה מאריך את הגוף ושומר על הצוואר ישר במהלך ההליך.
  12. יש לבצע הכנת עור לפני הניתוח כמתואר להלן.
    1. נגבו את הצוואר בחומר חיטוי מקומי (פובידון-יוד) כדי להפחית את עומס המיקרופלורה בעור ולהסיר שיער רפוי. נקי ממרכז העור, עובד כלפי חוץ כדי למנוע זיהום מחדש של אתר החתך. חזור על התהליך באמצעות 70% אתנול. בצע שלושה סבבים מתחלפים של יוד ואתנול לחיטוי.
    2. הניחו וילון כירורגי מעל החיה. זה נחתך ומעוצב מחתיכת מגבת נייר סטרילית או שקית אוטוקלאב.
  13. הניחו מגבות נייר סטריליות או שקיות אוטוקלאב לכלי ניתוח.
  14. בדוק רפלקס באמצעות 'בדיקת צביטה' כדי להבטיח הרדמה מספקת לפני שתמשיך בהליך.

3. הזרקת קרוטיד פנימית

הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בצינורית עירוי של 31 גרם ובהגדרת מזרקים המופעלת על ידי כף הרגל כדי להקל על הליך ההזרקה (איור משלים 1). הגדרה זו היא אופציונלית והמשתמש יכול להשתמש במזרק אינסולין 31 G ולדלג על שלבים 3.11 ו- 3.12. כדי להכין את צינורית העירוי, משכו והפרידו את חלק המחט מהחלק המתאים למזרק של מחט 31 גרם באמצעות שני זוגות מהדקי תפר. לאחר מכן, חבר את חלק המחט לקצה אחד של צינור עירוי עדין באורך של כ -10 ס"מ.

  1. מקם את מיקרוסקופ הנתיחה מעל העכבר.
  2. באמצעות מספריים, בצע חתך אנכי של 15 מ"מ לאורך קו האמצע באזור הצוואר החל מ-5 מ"מ מתחת ללסת ועד לפתח בית החזה.
  3. באמצעות שני זוגות של מלקחיים זוויתיים, יש להפריד את העור ואת בלוטות הרוק שמתחתיו, ולמרוח רטרקטורים כדי לשמור על קנה הנשימה חשוף. השלב הבא יחשוף את נדן הצוואר שנמצא במקביל לקנה הנשימה.
  4. באמצעות שני זוגות של מלקחיים בזווית עדינה, יש לנתח בבוטות את רקמת השריר והשומן הסמוכה לקנה הנשימה ולחשוף את נדן הצוואר הימני. נדן הצוואר הוא השכבה הסיבית המכסה את עורק הצוואר המשותף, הווריד והעצב התועה, וניתן לדמיין צרור זה על ידי עורק הצוואר המשותף האדום הבוהק. במחקר זה, ההזרקה בוצעה על עורק הצוואר הימני.
  5. יש לנקות מקטע של עורק הצוואר המשותף לביפורקציה הקרוטידית של החיתולית שמסביב ולהפריד אותה מהעצב התועה והוורידים.
  6. לבודד ולנקות את ביפורקציה הצוואר (הצומת המחבר בין עורקי הצוואר החיצוניים והפנימיים) מהעצבים והחיתולית שמסביב. מקמו מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר החיצוני והעבירו תפר משי (בעובי 5-0) מתחת לעורק. קשרו והדקו את התפר וחתכו את הקו העודף.
    הערה: ליגטורה זו (L1) תמנע מהזרקה לעבור דרך עורק הצוואר החיצוני.
  7. מקמו מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר המשותף והעבירו תפר משי (בעובי 5-0) מתחת לעורק. קושרים קשר ומהדקים את התפר במיקום פרוקסימלי לאתר ההזרקה המוצע. חותכים את התפר העודף ומשאירים כ-10 מ"מ של קו.
    הערה: ליגטורה שנייה זו (L2) תגביל את זרימת הדם ואת הדימום לאחר ההזרקה. הוא משמש גם כדי למקם ולהחזיק את עורק הצוואר במהלך ההזרקה.
  8. חותכים ומרטיבים רצועה של מגבים חד פעמיים (אוטומטיים) בעלי מוך נמוך (ראו טבלת חומרים) כ-10 מ"מ על 5 מ"מ. קפל את הרצועה לתוך 4 מ"מ x 5 מ"מ, 2-3 מ"מ עובי, ומניחים אותו מתחת לעורק הצוואר באתר ההזרקה המוצע. זה יתמוך בכלי במהלך ההזרקה.
  9. על עורק הצוואר המשותף rostral לאתר ההזרקה המוצע, למקם קשירה שלישית (L3) עם קשר רופף. זה מהודק רק לאחר ההזרקה (בשלב 3.16).
  10. התסיסו בעדינות את תרחיף התאים ושאבו 200 μL של תרחיף התא לתוך מזרק אינסולין (עם מחט של 31 גרם).
  11. טען את המזרק לתוך דרייבר המזרק המחובר לדוושת רגל מפעילה.
  12. חברו צינורית דקה עם מחט 31 גרם למזרק והגדילו את הקו.
  13. בדוק אם עורק הצוואר ממוקם היטב בלחץ.
  14. באמצעות שני מלקחיים זוויתיים עדינים, האחד מותח בעדינות על קצה הליגטורה הראשונה והשני אוחז במחט 31 G, מחדירים באיטיות את המחט עם השיקוע למעלה לתוך לומן של כלי הדם תוך הקפדה שלא לנקב אותה.
  15. יש להזריק באיטיות 100 μL של תרחיף התא (משלב 1.13) לעורק הצוואר המשותף במהירות של 10 μL/s. זה יספק 2.5 x 105 תאים לתוך כלי הדם. הזרקה מוצלחת היא הדמיה באמצעות ניקוי של דם מכלי הדם carotid.
  16. הרימו והדקו בעדינות את הליגטורה הרופפת (L3) (משלב 3.9) מיד לאחר משיכת המחט כדי למנוע זרימה חוזרת ודימום. לקצץ תפר עודף.
    הערה: זה נורמלי לראות כמות קטנה של דם spuring לאחר הנסיגה של המחט. עם זאת, אסור שיהיה דימום פעיל לאחר הידוק הליגטורה השלישית.
  17. הסירו את חתיכת המגבים החד-פעמיים הלחים בעלי מוך נמוך.
  18. באמצעות פיפטה P200, יש לשטוף את חלל הניתוח פעמיים עם 150-200 μL של מים סטריליים או מלוחים.
  19. בדוק שוב אם יש דימום, ולאחר מכן להסיר את retractors.
  20. מקם מחדש את הרקמות הרכות, בלוטות הרוק והעור מעל עורק הצוואר וקנה הנשימה.
  21. יש לסגור את שכבת העור של החתך באמצעות מחזיק מחט תפר, מלקחיים ותפר מונופילמנט 6/0 נספג או לא נספג בתבנית רציפה.
  22. השליכו את מזרק מחט הצינורית והכינו מערך חדש לעכבר הבא. שימוש במזרק חדש יבטיח שמספר התאים המוזרקים לכל עכבר יהיה עקבי.
    הערה: תמונות מייצגות של ההליך מופיעות באיור משלים 2. אם כלי השיט מנוקב או קרוע על ידי המחט, מסומן על ידי דליפה של הזרקה או דימום, ההליך נחשב לא מוצלח. לאחר מכן, יש למשוך את המחט, ולהדק מיד את הליגטורה השלישית כדי למנוע דימום נוסף. אם הדימום הוא מתמשך לאחר הידוק של התפר, החיה חייבת להיות מורדמת עם pentobarbital.

4. התאוששות לאחר ההזרקה

  1. יש להזריק בופרנורפין (50 מיקרוגרם/ק"ג) ומלוקסיקם (1 מ"ג/ק"ג) בהזרקה תת-עורית להקלה על כאבים לאחר ניתוח.
  2. העבירו את החיה לכלוב חם ונקי כדי להתאושש מההרדמה. זה נורמלי שבעל חיים יש פעילות מאופקת (מצטופפת ולא פעילה או מסתובבת לאט) לאחר התעוררות.
  3. לאחר 30-45 דקות, העבירו עכברים למתקן החזקה לטווח ארוך.
  4. לספק לעכברים דיאטה רכה (ג'ל דיאטה, הידרוג'ל, מחית) לפחות שבוע לאחר הניתוח ולבדוק את המצב הגופני מדי יום עם תשומת לב מיוחדת עבור סימנים של שבץ, זיהום, דימום סביב אתר הפצע.
  5. יומיים לאחר הניתוח, זה אופייני לבעל החיים יש פעילות מופחתת, פרווה קלה פרועה ואיבד 15% ממשקל הגוף לפני הניתוח. מתן משכך כאבים (meloxicam) מדי יום במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח כדי לנהל את הכאב ולסייע להחלמה.
  6. מהיום השלישי ואילך, בעלי החיים חייבים לחזור לפעילות, להגביר את תדירות ההאכלה והטיפוח ולחזור למשקל. המתת בעלי חיים עם ליקויים מתמשכים במצב גופני (כאבים, חיבוקים, לא פעילים, ירידה במשקל) לאחר 4 ימים לאחר הניתוח על ידי הזרקת נתרן פנטוברביטל במינון 200 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תוך-צפקית.
  7. ניתן לעקוב אחר השתלת הגידול והתקדמותו באמצעות שיטות הרדמה והדמיה לפי בחירה כגון הדמיה ביולומינסנטית, MRI או PET/MRI. הדרישה והיכולת לבצע הדמיה כזו יהיו תלויות מטבען במטרות הפרויקט האינדיבידואליות ובמתקן שבתוכו הוא מתבצע, ובהתאם לסוג תג המדווח של קווי התאים בהם נעשה שימוש, נגישות של רדיוכימיה רלוונטית ומתקני הדמיה גרעינית36,37
    הערה: בעלי חיים מסוימים עשויים שלא להגיב טוב ולחוות שבץ למרות הליך מוצלח. לאחר ההליך, בעלי חיים המופיעים עם תסמינים כלשהם של מצוקה נוירולוגית (סיבוב ראש ומשיכה לצד אחד, התנהגות הקיפה, גלגול, ת'ראש, אובדן תפקוד מוטורי) חייבים להיות מורדמים באופן מיידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השוואת הזרקת עורק הצוואר הנפוצה עם או בלי קשירת עורק הצוואר החיצוני
כאשר תאים סרטניים הוזרקו דרך עורק הצוואר המשותף מבלי לקשור תחילה את עורק הצוואר החיצוני24, נמצאו גידולי פנים ב-77.8% מהעכברים המושתלים (n = 7/9 בעלי חיים). דוגמה לגידול בפנים מודגמת באיור משלים 3. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מונעת גרורות לא מכוונות בפנים על ידי קשירת עורק הצוואר החיצוני לפני עורק הצוואר המשותף.

כדי להשוות בין שתי השיטות, לקטין הוזרק לעורק הצוואר המשותף של עכברים עם או בלי קשירת עורק הצוואר החיצוני. לאחר מכן, רקמת הפנים והמוח תוקנו, עובדו ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ירידה בלקטין נצפתה בניתוח אימונופלואורסצנטי ברקמות הלחי כאשר עורק הצוואר החיצוני נקשר (איור 2A-B). התוצאות מראות גם כי קשירת עורק הצוואר החיצוני לא השפיעה על העברת המוח מאחר שניתן לראות לקטין ברקמת המוח של עכברים שעברו הזרקה נפוצה של עורק הצוואר עם קשירת עורק הצוואר החיצוני (איור 2C-D). לכן, צעד נוסף זה יכול לכוון את העברת תאי הסרטן דרך עורק הצוואר הפנימי לתוך המוח עם זריעה מינימלית לרקמת הפנים.

Figure 2
איור 2: העברת שתלים תוך-קרוטיים עם ובלי קשירת עורק הצוואר החיצוני. הדמיה פלואורסצנטית של שריר הלחי הימנית (A,B) והמוח (C,D) של עכברים עם לקטין (ירוק) המועברת לעורק הצוואר המשותף, עם (A,C) או בלי (B,D) קשירת קרוטיד חיצונית. הלחי והמוח צולמו בהגדלה של 20x ו-5x ופסי קנה המידה מייצגים 50 ו-200 מיקרומטר, בהתאמה. גרעינים (כחולים) היו מוכתמים ב-DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניטור ביולומינסנטי
קו תאי סרטן שד מוגבר HER2, BT474, שעבר הנדסה גנטית כדי לבטא לוציפראז שימש במחקר זה כדי לאפשר ניטור שבועי של התקדמות הגידול על ידי מתן לוציפרין וביצוע הדמיה ביולומינסנטית in vivo. במודל זה של גרורות במוח מסוג BT474, ניתן לצפות באותות ביולומינסנטיים משבוע 5 לאחר הזרקת קרוטיד פנימית, והם גדלים בהדרגה בעוצמתם עם הזמן (איור 3).

Figure 3
איור 3: ניטור ביולומינסנטי וכימות של אות ביולומינסנציה. תמונות ביולומינסנטיות שבועיות מייצגות משבוע 0 עד שבוע 7 מראות עוצמה גוברת שמקורה בראש. הגרף מראה את כימות האותות הביולומינסנטיים בעכברים. נתונים הם אמצעי ± שגיאת תקן (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דימות תהודה מגנטית (MRI)
מודל החיות של גרורות במוח צולם באמצעות MRI משוקלל T2 בשבוע 2, 5 ו-8 כדי להעריך את התקדמות הגידול התוך גולגולתי. משבוע 5 עד שבוע 8, ניתן לצפות באזור עם עוצמת אות הטרוגנית, מה שמצביע על גידול תוך גולגולתי עם זליגת נוזלים מורכבת, ככל הנראה מכלי דם של גידולים משובשים (איור 4A). מחסום הדם-מוח במודל הגרורות במוח משובש ודומה לזה של גרורות מוחיות קליניות. זה הוערך באמצעות שיפור ניגודיות גדוליניום ואחריו רצף MRI משוקלל T1. ריכוז גדוליניום באזור הגידול עולה ככל שהוא דולף ממחזור הדם לרקמת הגידול. הדבר מודגם על-ידי האזור הכהה המייצג את קיצור זמן ההרפיה של T1 (איור 4B). ניתן להשתמש בנתונים המתקבלים כדי לתאם את הגישה לתרופות לחדירות מחסום הדם-מוח. בנוסף, ניתן להפיק נפח גידול תוך גולגולתי ושטח פנים על ידי ביצוע סגמנטציה נפחית באמצעות תוכנת ניתוח התמונה 3D Slicer (איור 4C). ניתן לשרטט זאת בגרף כנגד הזמן כדי לעקוב אחר צמיחת גידולי המוח.

Figure 4
איור 4: אפיון מודל של גרורות במוח באמצעות דימות תהודה מגנטית . (A) סריקות רוחביות, קורונליות וסגיטליות משוקללות T2 של המודל בשבועות 1, 5 ו-8. בשבוע 5 ניתן לראות אזור מטושטש קלוש בתצפית הסגיטלית (חץ אדום), שהתקדמה לאזור היפר-אינטנסיבי והטרוגני בשבוע 8. (B) MRI משוקלל T1 משופר ניגודיות דינמית המראה גידול במוח (אזור באדום) לפני ואחרי הזרקה של חומר לשיפור ניגודיות גדוליניום (CE). אזורים כהים מצביעים על דליפה וספיגה של גדוליניום. (C) הגידול שהודגם במישורים הקורונליים, הרוחביים והסגיטליים עבר ביאור ופילוח באמצעות תוכנת ניתוח התמונה התלת-ממדית Slicer כדי להפיק נפח גידול תוך גולגולתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הדמיית PET/MR לקביעת ההתפלגות הביולוגית של ננו-רפואה
השילוב של מחסום דם-מוח משובש וכלי הדם של הגידול הדולף מאפשר קליטה פסיבית והצטברות של טיפולים בקנה מידה ננומטרי, באמצעות חדירות משופרת ואפקט שימור36,37. כאשר מודל הגרורות במוח BT474 מבטא יתר על המידה את HER2, בוצעה ספיגה מוחית של ננו-רפואה המכוונת ל-HER2 עם תווית זירקוניום-89 באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/תהודה מגנטית (PET/MR) (איור 5). בקבוצה של עכברי BT474 BM, הננו-רפואה שזוהתה באזור הגידול הייתה גבוהה מזו שבאזורי מוח לא מעורבים, מה שאישר את הצטברות הננו-רפואה בגרורות במוח.

Figure 5
איור 5: תמונת PET/MR מייצגת של זירקוניום-89 שכותרתה ננו-רפואה ממוקדת HER2 (89Zr-HER2-NM) בעכברי גרורות במוח BT474. (A) התמונה השמאלית מתארת MRI במשקל T2 (תצוגה קורונלית) המציגה גידול במוח (אזור אדום) ומוח לא מעורב (אזור כחול). שתי התמונות הסמוכות מציגות תמונות MRI (ראייה קורונלית ורוחבית) על גבי שכבת-על של PET. שכבת העל הצבעונית של PET מראה שלאזור הגידול יש ספיגה גבוהה יותר של ננו-רפואה (לבן, אדום, צהוב) בהשוואה לאזורים הלא מעורבים (כחול/ירוק). (B) הגרף ממחיש את העלייה בעוצמת אות ה-PET ובספיגה של ננו-רפואה (מינון מוזרק לגרם, ID/g) בגידולי מוח ביחס למוח הלא מעורב (n = 12). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הישרדות ומעמד פיזי של מודלים BM
מודל הגרורות במוח BT474 שרד חציון של 9 שבועות לאחר ההזרקה (איור 6). ככל שהתקדמו הגרורות במוח, בעלי חיים החלו לאבד עד 20% ממשקל הגוף, מה שהצריך המתת חסד (בין שבוע 6-9). בגרורות מוחיות בשלב מאוחר, המצגות הנפוצות כוללות פרווה פרועה וגולגולת בולטת וכיפה. בעלי החיים היו לעתים קרובות לא פעילים, הצטופפו והראו ליקויים תפקודיים במיומנויות מוטוריות ובכוח.

Figure 6
איור 6: עקומת קפלן מאייר של מודל עכברי גרורות במוח BT474. ההישרדות החציונית הייתה 9 שבועות לאחר ההזרקה (n = 18). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

היסטולוגיה
לאחר המתת חסד, בעלי החיים הוכנסו לתמיסת פרפורמלדהיד של 4% כדי לשמר את ארכיטקטורת היסטולוגיה של המוח40. לאחר מכן, המוחות ואיברים אחרים עובדו, נחתכו והוכתמו בהמטוקסילין ובאוזין (H&E). במודל הגרורות במוח הזה, הגידולים אותרו באופן חד-צדדי, והתאימו לצד של הזרקת הצוואר (איור 7A). גידולי BT474 הופיעו בעיקר כמסות בודדות מוצקות, ובמקרים מסוימים כללו כמעט מחצית מחצי הכדור המוחי (איור 7B). כיסים של חללים ריקים נצפו לעתים קרובות והורכבו מתאים נמקיים (איור 7C). גידולים קטנים יותר היו נוכחים גם אצל חלק מבעלי החיים (איור 7E). צביעת אימונוהיסטוכימיה מראה שגרורות במוח מסוג BT474 מבטאות HER2 ו-HER3 חזקות, מה שמרמז על כך שהמודל הזה מתאים לטיפולים ממוקדי HER2 ו-HER3 (איור 7F).

Figure 7
איור 7: היסטולוגיה מוחית של מודל גרורות במוח BT474. (A) מקטע מוח מייצג של עכבר BT474 BM; תיבות צבעוניות המסומנות באזורי עניין מוגדלים. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (B) גידול מוצק המורכב ממסה של תאים אפיתלואידים. (C) תאים נמקיים בתוך חלל. (D) ממשק גידול-מוח (E) גידולים קטנים הידועים בשם מיקרו-מטסטאזות. (סרגל סולם B-E = 200 מיקרומטר). (F) תמונות אימונוהיסטוכימיה המציגות חיוביות של HER2 ו-HER3 ותואמות את המטוקסילין ואאוזין (H&E). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מעורבות מערכתית
לא נצפו גידולים במקטעי רקמה מאיברים אחרים (איור 8). ממצא זה תואם את הנתונים הביולומינסנטיים, שבהם ביולומינסנציה זוהתה רק מראשי בעלי החיים. יחד, התוצאות הראו כי מודל זה קשור ללא גידולים סיסטמיים הניתנים לזיהוי.

Figure 8
איור 8: היסטולוגיה של איברים אחרים. לא הייתה מעורבות ברורה של הגידול באיברים שנבדקו: עצם, כבד, כליות, לבלב, ריאות, לב, טחול, מעיים ושחלה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: מזרק צינורית להזרקת עורק הצוואר הפנימי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: תמונות של תהליך הזרקת עורק הצוואר הפנימי. תיאור התמונה מופיע בטבלה משלימה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: MRI משוקלל T2 מראה גידול תוך שרירי גדול ברקמת הפנים הימנית (מסומן באדום ). חתך רקמה מוכתם H&E חושף תאי גידול צפופים. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ (מרכז) ו- 100 מיקרומטר (מימין). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: תיאור שלב אחר שלב של הזרקת עורק הצוואר הפנימי באיור משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גרורות במוח הן תהליך מורכב של תאים סרטניים המתפשטים מהאתר הראשוני שלהם למוח. קיימים מודלים שונים של בעלי חיים המשקפים שלבים מסוימים בתהליך רב-שלבי זה, וישנם שיקולים פיזיולוגיים ומעשיים לתכנון מחקרי גרורות פרה-קליניים41,42. רוב המחקרים שפורסמו החוקרים את השימוש בננו-רפואה לטיפול בגרורות במוח השתמשו במודלים תוך-לבביים של 43,44ו-45,46,47,48,49 תוך-גולגולתיים. השתלת תאים סרטניים דרך עורק הצוואר עשויה לשחזר טוב יותר את התהליך הגרורתי ואת הפתוביולוגיה של גרורות במוח.

עם זאת, מניסיון, טכניקת הזרקת הקרוטיד הנפוצה הביאה לכך שמספר בעלי חיים הציגו גידולי פנים משמעותיים בנקודות זמן מוקדמות. בבעלי חיים עם גידולי מוח ופנים פעילים, גידולי פנים נצפו גדלים מהר יותר מגידולי המוח. ייתכן שהסיבה לכך היא המיקרו-סביבה הווסקולרית יותר שתומכת בצמיחת הגידול (איור משלים 3).

עורק הצוואר המשותף מספק דם לאזור הפנים ולמוח דרך העורקים החיצוניים והעורקים הצוואריים, בהתאמה. לפיכך, בהסכמה עםאחרים 25, הזרקת תאים סרטניים דרך עורק הצוואר המשותף תוביל לזריעה בשני האזורים. ניתן למנוע גידולים בפנים על ידי קשירת עורק הצוואר החיצוני לפני הזרקת עורק הצוואר הנפוץ.

שיטת ההזרקה של עורק הצוואר הפנימי המתוארת כאן מדמה גרורות במוח על ידי החדרת התאים הסרטניים לכלי הדם העיקרי המספק את המוח. מודל זה משחזר את הלינה של תאים סרטניים במחזור הדם במצע כלי הדם של המוח, ומאפשר את העברתם והיווצרותם של צמיחת מוח גרורתית. התוצאות מראות כי הזרקת עורק הצוואר מגבילה את זריעת הסרטן לאיברים אחרים הקשורים לשיטות כגון הזרקה תוך לבבית.

ישנם כמה שיקולים קריטיים ומידע לפתרון בעיות עבור הפרוטוקול. ראשית, גושי תאים יכולים לחסום כלי דם תוך גולגולתיים ולגרום לשבץ. ניתן למתן זאת על ידי העברת תרחיף התא דרך מסננת תא כדי להבטיח תרחיף תא ללא גושים. לאחר מכן, הזרקת נוזלים עודפים למוח עלולה לגרום לבצקת דלקתית ולעכב את הרוחב של כלי הדם. ניתן להימנע מכך על ידי שימוש בנפח הזרקה קטן מ-100 μL. שימוש בתפר עם קצוות מרופטים ונוכחות של רקמת החיתולית או הפיברופטית יכולים לעכב לולאה של תפר סביב עורק הצוואר החיצוני. מומלץ לפנות תחילה את החיתולית או את רקמת הפיברופטי על ידי החלת תנועת ניגוב עדינה לאורך העורק עם המלקחיים ולהסיר קצוות שבריריים על ידי חיתוך קצה התפר. לבסוף, לקווי תאים סרטניים יש שיעורי גדילה ייחודיים, ולכן, חיוני לייעל את ריכוז התאים להזרקה. מניסיון, במודלים של גרורות במוח של ריאות ומלנומה, שכללו את קווי התאים הסרטניים האנושיים האגרסיביים NCI-H1975 ו-A2058 בהתאמה, הוזרקו פחות תאים (1 x 105 תאים ב-100 μL) כדי למנוע התקדמות מהירה של המחלה.

השלב המאתגר ביותר בפרוטוקול זה הוא החדרת מחט לעורק הצוואר והזרקת תאים. מומלץ להשתמש במחט חדשה לכל חיה לסטריליות מכיוון ששימוש במחטים קהות מגביר את הסיכון לניקוב או לקריעת כלי הדם. מומלץ גם להשתמש בנהג מזרק עבור ההליך כדי להפחית את הפרץ הראשוני של הזרקת מחט רועדת במהלך ההזרקה. לנהג המזרק יש גם יתרון נוסף להתאמת קצב ההזרקה לקצב זרימת הדם הפיזיולוגי.

פרוטוקול זה אינו נטול מגבלות. ההליך הוא תובעני מבחינה טכנית וקיים סיכון שבעלי חיים ייכנעו לשבץ כתוצאה מכשל לרוחב למרות שעברו הליך מוצלח. מניסיוננו, שיעור השבץ הוא 11.4% (n = 21/168 בעלי חיים). לפיכך, גודל המדגם ההתחלתי צריך לקחת בחשבון את בעלי החיים האלה שימותו משבץ. מכיוון ששיטה זו מספקת תאים סרטניים ישירות לכיוון המוח, היא הפחיתה את נטל הגידול המערכתי ולכן אינה אידיאלית לחקר התפשטות מערכתית.

לסיכום, הפרוטוקול יאפשר יצירת מודל עכברי גרורות במוח המתאים לבדיקת סמים ולהערכת הפרופיל הטיפולי של תרופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד, או בהחלטה לפרסם את המאמר.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית האוסטרלית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC), מענק מספר APP1162560. ML מומנה על ידי מלגת מחקר לתואר שני של UQ. ברצוננו להודות לכל מי שסייע בגידול בעלי חיים ובהדמיה in vivo של בעלי החיים. אנו מודים לבית החולים המלכותי בריסביין ולנשים על תרומת אליקוטים של זירקוניום למחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100µm cell strainer Corning CLS431752
30G Microlance needle BD 23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe BD 326103
Angled forceps Proscitech T67A-SS Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic ThermoFisher Scientific 15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line ATCC HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter ThermoFisher Scientific C10227
Diet-76A ClearH2O 72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps Proscitech DEF11063-07 Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in Cole Parmer EW-06419-00
Foetal bovine serum ThermoFisher Scientific 26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium ThermoFisher Scientific 14170120
Hydrogel ClearH2O 70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers Kimberly Clark- Kimwipes Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)  Bausch and lomb
Povidone-iodine solution Betadine 2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors Kent Scientific SURGI-5001
RPMI 1640 Media ThermoFisher Scientific 11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm Ethicon JJ-640G
Sterile normal saline ThermoFisher Scientific TM4469
Sticky tape
Surgical board A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors Proscitech T104 Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps Proscitech T113C Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) Proscitech TC1322-180 length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump World Precision Instruments UMP3-3
T75 tissue culture flask ThermoFisher Scientific 156499
Thread
Trigene II surface disinfectant Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
TrypLE Express dissociating medium ThermoFisher Scientific 12605010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
  2. Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
  3. Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
  4. Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
  5. Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
  6. Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
  7. Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
  8. Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
  9. Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
  10. Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
  11. Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
  12. Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
  13. Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
  14. Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
  15. Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
  16. Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
  17. Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
  18. Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
  19. Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
  20. Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
  21. Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
  22. Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
  23. Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
  24. Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
  25. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
  26. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  27. Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
  28. Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
  29. Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
  30. Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
  31. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  32. Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
  33. Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
  34. Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
  35. Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
  36. Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
  37. Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
  38. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
  39. Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
  40. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
  41. Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
  42. Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
  43. Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
  44. Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
  45. Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
  46. Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
  47. He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
  48. Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
  49. Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).

Tags

חקר הסרטן גיליון 186
מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, M., Fletcher, N., McCart Reed,… More

Lim, M., Fletcher, N., McCart Reed, A., Flint, M., Thurecht, K., Saunus, J., Lakhani, S. R. Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (186), e64216, doi:10.3791/64216 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter