Summary
Hjernemetastase er en årsak til alvorlig sykelighet og dødelighet hos kreftpasienter. De fleste musemodeller for hjernemetastaser kompliseres av systemiske metastaser som forvirrer analyse av dødelighet og terapeutiske intervensjonsutfall. Presentert her er en protokoll for intern carotisinjeksjon av kreftceller som produserer konsistente intrakraniale svulster med minimale systemiske svulster.
Abstract
Hjernemetastase er en årsak til alvorlig sykelighet og dødelighet hos kreftpasienter. Kritiske aspekter ved metastatiske sykdommer, som det komplekse nevrale mikromiljøet og stromalcelleinteraksjonen, kan ikke helt replikeres med in vitro-analyser ; Dermed er dyremodeller avgjørende for å undersøke og forstå effekten av terapeutisk intervensjon. Imidlertid produserer de fleste hjernesvulst xenografting metoder ikke hjernemetastaser konsekvent når det gjelder tidsramme og tumorbelastning. Hjernemetastasemodeller generert ved intrakardiell injeksjon av kreftceller kan resultere i utilsiktet ekstrakraniell tumorbelastning og føre til ikke-hjernemetastatisk sykelighet og dødelighet. Selv om intrakraniell injeksjon av kreftceller kan begrense ekstrakraniell tumordannelse, har den flere advarsler, for eksempel at de injiserte cellene ofte danner en enkelt tumormasse på injeksjonsstedet, høy leptomeningeal involvering og skade på hjernens vaskulatur under nålpenetrasjon. Denne protokollen beskriver en musemodell av hjernemetastase generert ved injeksjon av arteria carotis interna. Denne metoden produserer intrakranielle svulster konsekvent uten involvering av andre organer, noe som muliggjør evaluering av terapeutiske midler for hjernemetastase.
Introduction
Hjernemetastase er en utbredt malignitet assosiert med en svært dårlig prognose 1,2. Standarden på omsorgen for hjernemetastasepasienter er multimodal, bestående av nevrokirurgi, helhjernestrålebehandling og/eller stereotaktisk radiokirurgi avhengig av pasientenes generelle helsetilstand, ekstrakraniell sykdomsbyrde og antall og plassering av svulster i hjernen 3,4. Pasienter med opptil tre intrakranielle lesjoner er kvalifisert for kirurgisk reseksjon eller stereotaktisk radiokirurgi, mens helhjernestrålebehandling anbefales for pasienter med flere lesjoner for å unngå risiko for operasjonsrelatert infeksjon og ødem5. Imidlertid kan hele hjernestrålebehandling forårsake skade på radiofølsomme hjernestrukturer, noe som bidrar til dårlig livskvalitet6.
Systemisk terapi er en ikke-invasiv alternativ og logisk tilnærming til behandling av pasienter med flere lesjoner7. Det er imidlertid mindre vurdert på grunn av den langvarige forestillingen om at systemiske terapier har dårlig effekt fordi passiv levering av cytotoksiske legemidler via blodet ikke kan oppnå terapeutiske nivåer i hjernen uten risiko for usikker toksisitet8. Dette paradigmet begynner å endre seg med den nylig amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkjente systemiske terapien (tucatinib med trastuzumab og kapecitabin indisert for metastatisk HER2 + brystkreft hjernemetastase) 9,10,11,12 og oppdateringen i behandlingsretningslinjene for å inkludere vurdering av systemiske terapialternativer for hjernemetastasepasienter13,14.
I denne sammenheng kan utviklingen innen molekylær målrettet terapi, immunterapi og alternative legemiddelleveringssystemer, for eksempel en målrettet nanomedisinbærer, potensielt overvinne utfordringene ved hjernemetastasebehandling15,16,17,18. I tillegg undersøkes kjemiske og mekaniske tilnærminger for å forbedre legemiddellevering via permeabilisering av hjerne-tumorbarrieren også19,20. For å studere og optimalisere slike tilnærminger for å være egnet til formålet, er det avgjørende å bruke prekliniske modeller som ikke bare speiler den komplekse fysiologien til hjernemetastase, men også tillater objektiv analyse av intrakraniell legemiddelrespons.
I stor grad involverer de nåværende tilnærmingene til å modellere hjernemetastase in vivo intrakardiell (venstre ventrikel), intravenøs (vanligvis halevene), intrakraniell eller intrakarotis (vanlig halspulsåren) injeksjon av kreftceller hos mus 21,22,23,24,25,26,27 . Bortsett fra tumor engraftment strategier, genetisk konstruert mus modeller hvor tumordannelse utløses ved fjerning av tumor suppressor gener eller aktivering av onkogener er nyttig for tumor modellering. Imidlertid er bare noen få genetisk utviklede musemodeller rapportert å produsere sekundære svulster og enda færre som pålitelig produserer hjernemetastaser28,29,30.
Engraftment metoder som intrakardiell (venstre ventrikkel) og intravenøs (vanligvis halevene) injeksjon etterligne systemisk spredning av kreft. Disse modellene produserer vanligvis lesjoner i flere organer (f.eks. Hjerne, lunger, lever, nyrer, milt) avhengig av kapillærsengen som fanger de fleste tumorceller under sirkulasjonspasset 31. Imidlertid vil inkonsekvente hastigheter av hjernetransplantasjon kreve flere dyr for å oppnå prøvestørrelsen for ønsket statistisk styrke. Antallet tumorceller som etter hvert etablerer seg i hjernen via disse intrakardiale og intravenøse injeksjonsmetodene er variabelt. Derfor kan hjernemetastasetumorbyrden variere mellom dyr, og forskjellen i progresjon kan gjøre standardisering av eksperimentell tidslinje og tolkning av resultater en utfordring. Den ekstrakraniale tumorbyrden kan føre til ikke-hjernemetastasedødelighet, noe som gjør disse modellene uegnet til å evaluere intrakraniell effekt. Hjernetrope cellelinjer er etablert ved hjelp av kunstige klonale seleksjonsprosesser for å redusere ekstrakraniell etablering, men opptakshastighetene har vært inkonsekvente, og den klonale seleksjonsprosessen kan redusere heterogeniteten som normalt finnes i humane svulster32.
Hjernespesifikke engraftmentmetoder som intrakraniell og intrakarotidinjeksjon muliggjør mer konsistent og effektiv hjernemetastasemodellering. I den intrakraniale metoden33 injiseres kreftceller vanligvis i den frontale hjernebarken, noe som genererer rask og reproduserbar tumorutvekst med lav systemisk involvering. Mens prosedyren tolereres godt med lav dødelighet33, er forbeholdene at det er en relativt grov tilnærming som raskt introduserer en (lokalisert) bolus av celler i hjernen og ikke modellerer tidlig patogenese av hjernemetastase. Nålen skader hjernevevsvaskulaturen, som deretter forårsaker lokalisert betennelse 5,34. Av erfaring er det en tendens til at tumorcelleinjektat refluks under fjerning av nålen, noe som fører til leptomeningeal involvering. Alternativt leverer intrakarotismetoden celler inn i den vanlige halspulsåren med hjernemikrovaskulatur som den første kapillærsengen som skal oppstå, modellering av overlevelse i sirkulasjon, ekstravasasjon og kolonisering24. I samråd med andre25 fant vi i vår erfaring med denne metoden at den kan resultere i ansiktssvulster på grunn av utilsiktet tilførsel av kreftceller via arteria carotis til kapillærsenger i dette vevet (upubliserte data). Det er mulig å forebygge ansiktssvulster ved først å ligere arteria carotis communis før vanlig halspulsåreinjeksjon (figur 1). I resten av artikkelen omtales denne metoden som «injeksjon av arteria carotis interna». Av erfaring genererer den indre halspulsåreinjeksjonsmetoden konsekvent hjernemetastase med svært få systemiske hendelser og har vært vellykket i å generere hjernemetastasemodeller av forskjellige primære kreftformer (f.eks. melanom, bryst og lungekreft) (figur 1). Ulempene er at det er teknisk utfordrende, tidkrevende, invasivt og krever nøye optimalisering av celletall og en overvåkingstidslinje. Oppsummert produserer både intrakranielle og interne halspulsåreinjeksjonsmetoder musemodeller som er egnet for å evaluere terapeutisk effekt på hjernesvulstrelatert overlevelsesfordel.
Denne protokollen beskriver den interne halspulsåren injeksjonsmetode for å produsere en musemodell av hjernemetastase med nesten ingen systemisk involvering og derfor egnet for preklinisk evaluering av legemiddeldistribusjon og effekt av eksperimentelle terapier.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av indre halspulsåren injeksjonsprotokoll for hjernemetastase. Intern halspulsåren injeksjon med ekstern halspulsåren ligering kan pålitelig produsere en hjernemetastase modell fra ulike primære kreftformer. I denne protokollen er tre ligaturer plassert på halspulsåren (annotert som L1-L3 i figuren). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier ble utført innenfor retningslinjene fra Animal Ethics Committee ved University of Queensland (UQCCR / 186/19), og den australske koden for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelig formål.
1. Forberedelse av kreftceller til injeksjon
MERK: I denne studien ble den humane brystkreftcellelinjen, BT-474 (BT474), brukt. BT474 ble dyrket i komplett vekstmedium bestående av RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% insulin. Cellene ble vedlikeholdt i en inkubator ved 37 °C med 5 % karbondioksid i luftatmosfæren. Autentiser cellelinjen ved satellitt-tandem gjentar testing35, bekreft ekspresjon av reporterproteinet (f.eks. Luciferase) hvis noen, og se etter mykoplasmainfeksjon.
- Frø BT474 kreftceller ved en sådensitet på 2,0 x 106 celler til en T75-kolbe ved bruk av 10 ml komplett vekstmedium og kultur (ved 37 ° C med 5% CO2) til 70% -80% sammenløp før injeksjon.
- På injeksjonsdagen, kast vekstmediet og vask cellemonolaget med fosfatbufret saltvann (PBS) to ganger.
- Tilsett 5 ml forvarmet cellekulturdissosiasjonsreagens (se materialtabell) og inkuber ved 37 °C i 5 minutter eller til cellene har løsnet. Etter 5 min, trykk forsiktig på kolben for å hjelpe celleløsningen.
- Tilsett 5 ml komplett vekstmedium som inneholder 10 % føtalt bovint serum for å slukke dissosiasjonsreagensaktiviteten.
- Resuspend cellene forsiktig ved pipettering for å redusere celleklumper.
- Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml rør og sentrifuger ved 180 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Dekanter supernatanten og resuspendere cellepelleten i 10 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) uten kalsium og magnesium for å minimere celleklumping.
- Sentrifuge cellesuspensjonen ved 180 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Dekanter supernatanten for å fjerne gjenværende serum / dissosiasjonsreagens og resuspendere cellepelleten i 3 ml HBSS.
- Plasser en 100 μm cellesil på et nytt 50 ml konisk rør og pass cellesuspensjonen gjennom for å fjerne celleklumper.
MERK: En enkeltcellesuspensjon er viktig for å minimere okklusjon av blodkar og risikoen for slag ved injeksjon. - Beregn antall levedyktige celler ved hjelp av Trypan Blue-ekskludering og et hemocytometer med standardmetoder.
- Fortynn cellesuspensjonen med HBSS til en cellekonsentrasjon på 2,5 x 106 celler/ml.
- Hold røret horisontalt på is og vugg røret forsiktig med jevne mellomrom for å minimere klumping. Cellesuspensjonen kan lagres på is i maksimalt 6 timer.
MERK: Rocking ble gjort manuelt, men dette kan også gjøres ved hjelp av en shaker ved lave turtall.
2. Forberedelse av musen for prosedyren
MERK: I denne studien ble 4-5 uker gamle, kvinnelige NOD scid mus brukt. Introduser myk diett utvinning mat (f.eks diett gel, hydrogel, mashed mus chow) til mus 3 dager før prosedyren for å oppmuntre fôring etter inngrepet.
- Autoklav kirurgiske verktøy. Spray og tørk av operasjonsområdet og utstyret med overflatedesinfeksjonsmiddel, etterfulgt av 70% etanol.
- Plasser en dyrevarmematte under operasjonstavlen for å forhindre hypotermi. Slå dette på 30 min før operasjonen. Spray og tørk av operasjonsbrettet med overflatedesinfeksjonsmiddel etterfulgt av 70% etanol.
- Forbered et rent dyrehus og en varm varmepute for utvinning.
- Ta på deg rent personlig verneutstyr (kjole, maske, hårnett og hansker). Oppretthold steriliteten gjennom hele prosedyren ved å bruke rene eksamenshansker og en "kun instrumenttips"-teknikk.
- Bedøv musen med et bedøvelseskammer ved å bruke 5% isofluran med en oksygenstrøm på 2 l / min til musen mister pedalrefleksen.
- Ta dyret ut av kammeret og legg det i en nesekegle som gir 2% isofluran ved en oksygenstrøm på 2 l / min for den gjenværende kirurgiske prosedyren.
- Øreslagmus for identifikasjon og bruk elektriske klippere for å barbere pelsen fra nakkeområdet. Rengjør overflødig hår fra eksponert hud ved hjelp av tape.
- Vei musen for å beregne de bedøvelses- og smertestillende legemiddeldosene som kreves. Administrer buprenorfin og meloksikam med henholdsvis 50 μg/kg og 1 mg/kg via subkutan injeksjon.
- Overfør musen til et varmt kirurgisk bord og fest nesekeglen med tape.
- Påfør okulært smøremiddel i øynene for å forhindre tørking.
- Fest musen forsiktig ved først å hekte de øvre fortennene ved hjelp av tråd teipet til operasjonsbrettet, etterfulgt av å teipe for- og bakbenene. Dette trinnet utvider kroppen og holder nakken rett under prosedyren.
- Utfør preoperativ hudpreparasjon som beskrevet nedenfor.
- Tørk nakken med aktuelt antiseptisk middel (povidon-jod) for å redusere hudens mikroflorabelastning og fjerne løst hår. Rengjør fra midten av huden, arbeid utover for å forhindre rekontaminering av snittstedet. Gjenta prosessen med 70% etanol. Utfør tre vekslende runder med jod og etanol for desinfeksjon.
- Legg en kirurgisk drapering over dyret. Dette er kuttet og formet fra et stykke sterilt papirhåndkle eller autoklavpose.
- Legg ut sterile papirhåndklær eller autoklavposer for kirurgiske verktøy.
- Sjekk for refleks via "Knipetest" for å sikre tilstrekkelig anestesi før du fortsetter med prosedyren.
3. Intern carotisinjeksjon
MERK: I dette eksperimentet ble en 31 G infusjonskanyle og fotaktivert sprøytedriveroppsett brukt for å lette injeksjonsprosedyren (supplerende figur 1). Dette oppsettet er valgfritt, og brukeren kan bruke en 31 G insulinsprøyte og hoppe over trinn 3.11 og 3.12. For å klargjøre infusjonskanylen trekker du ut og separerer kanyledelen fra sprøytetilpasningsdelen av en 31 G nål ved hjelp av to par suturklemmer. Fest deretter kanyledelen til den ene enden av et fint infusjonsrør som er ca. 10 cm langt.
- Plasser disseksjonsmikroskopet over musen.
- Bruk saks til å lage et vertikalt 15 mm snitt langs midtlinjen ved nakkeområdet fra 5 mm under kjeven til thoraxinnløpet.
- Bruk to par vinklede tang, del huden og underliggende spyttkjertler, og bruk retractors for å holde luftrøret utsatt. Det neste trinnet vil avsløre halshylsen som ligger parallelt med luftrøret.
- Bruk to par finvinklede tang, disseker du muskler og fettvev ved siden av luftrøret for å eksponere høyre karotiskjede. Karotiskjeden er det fibrøse laget som dekker den vanlige halspulsåren, venen og vagusnerven, og denne bunten kan visualiseres av den lyse røde vanlige halspulsåren. I denne studien ble injeksjonen utført på høyre halspulsåre.
- Fjern et segment av den vanlige halspulsåren kaudal til karoten bifurkasjon av den omkringliggende fascia og skille den fra vagusnerven og venene.
- Isoler og fjern karoten bifurkasjon (krysset som forbinder de ytre og indre halspulsårene) fra de omkringliggende nerver og fascia. Plasser fine tang under den ytre halspulsåren og pass en silkesutur (5-0 tykkelse) under arterien. Knut og stram suturen og kutt overflødig linje.
MERK: Denne ligaturen (L1) vil forhindre injeksjon i å passere gjennom den eksterne halspulsåren. - Plasser fine tang under halspulsåren og pass en silkesutur (5-0 tykkelse) under arterien. Bind en knute og stram suturen i en posisjon proksimal til det foreslåtte injeksjonsstedet. Klipp overflødig sutur og la ca 10 mm linje.
MERK: Denne andre ligaturen (L2) vil begrense blodstrømmen og blødningen etter injeksjonen. Det brukes også til å plassere og holde halspulsåren under injeksjonen. - Klipp og fukt en stripe med (autoklaverte) engangsviskere med lite lo (se Materialtabell) ca. 10 mm x 5 mm. Brett stripen inn i 4 mm x 5 mm, 2-3 mm tykk, og legg den under halspulsåren på det foreslåtte injeksjonsstedet. Dette vil støtte fartøyet under injeksjonen.
- På den vanlige halspulsåren rostral til det foreslåtte injeksjonsstedet, plasser en tredje ligering (L3) med en løs knute. Dette strammes først etter injeksjonen (i trinn 3.16).
- Beveg cellesuspensjonen forsiktig og trekk 200 μL cellesuspensjon inn i en insulinsprøyte (med 31 G kanyle).
- Legg sprøyten i sprøytedriveren som er koblet til en fotpedal som aktiveres.
- Fest en fin kanyle med en 31 G kanyle til sprøyten og klargjør snøret.
- Kontroller om halspulsåren er godt plassert og trykksatt.
- Ved hjelp av to finvinklede tang, den ene forsiktig spent på enden av den første ligaturen og den andre holder 31 G-nålen, stikk sakte nålen med skrå opp i blodkarets lumen, pass på at du ikke punkterer den.
- Injiser langsomt 100 μL cellesuspensjon (fra trinn 1.13) inn i halspulsåren ved 10 μL/s. Dette vil levere 2,5 x 105 celler inn i blodkaret. Vellykket injeksjon visualiseres via rydding av blod fra karoten blodkar.
- Løft og stram forsiktig den løse ligaturen (L3) (fra trinn 3.9) umiddelbart etter at nålen er trukket ut, for å forhindre tilbakestrømning og blødning. Trim overflødig sutur.
MERK: Det er normalt å observere en liten mengde blodspurting etter tilbaketrekking av nålen. Det må imidlertid ikke være noen aktiv blødning etter at den tredje ligaturen er strammet. - Fjern stykket fuktede engangsviskere med lite lo.
- Bruk en P200-pipette, skyll det kirurgiske hulrommet to ganger med 150-200 μL sterilt vann eller saltvann.
- Sjekk igjen for blødning, og fjern deretter retractors.
- Plasser bløtvevet, spyttkjertlene og huden over halspulsåren og luftrøret.
- Lukk hudlaget av snittet ved hjelp av en sutur nåleholder, tang og en absorberbar eller ikke-absorberbar 6/0 monofilament sutur i et kontinuerlig mønster.
- Kast kanylesprøyten og klargjør et nytt oppsett for neste mus. Bruk av en ny sprøyte vil sikre at antall celler injisert i hver mus er konsistent.
MERK: Representative øyeblikksbilder av prosedyren er i supplerende figur 2. Hvis fartøyet punkteres eller rives av nålen, indikert ved lekkasje av injeksjon eller blødning, anses prosedyren som mislykket. Etter dette må nålen trekkes ut, og den tredje ligaturen må umiddelbart strammes for å forhindre ytterligere blødning. Hvis blødningen er vedvarende etter stramming av suturen, må dyret avlives med pentobarbital.
4. Gjenoppretting etter injeksjon
- Injiser buprenorfin (50 μg/kg) og meloksikam (1 mg/kg) via subkutan injeksjon som postoperativ smertelindring.
- Flytt dyret til et varmt og rent bur for å gjenopprette fra anestesi. Det er normalt at et dyr har dempet aktivitet (sammenkrøpet og inaktivt eller beveger seg sakte) etter å ha våknet.
- Etter 30-45 min, overfør mus til et langsiktig holdinganlegg.
- Gi mus et mykt kosthold (diettgel, hydrogel, mos) i minst en uke etter operasjonen og kontroller fysisk status daglig med spesiell oppmerksomhet for tegn på hjerneslag, infeksjon, blødning rundt sårstedet.
- To dager etter operasjonen er det typisk for dyret å ha redusert aktivitet, mild ruffled pels og mistet 15% av preoperativ kroppsvekt. Administrer smertestillende (meloksikam) daglig i 2-3 dager etter operasjonen for å håndtere smerte og hjelpe utvinning.
- Fra dag 3 og utover må dyrene ha gjenvunnet aktivitet, økt i fôrings- og stellfrekvens og gjenvunnet vekt. Avlive dyr med vedvarende fysisk tilstand (smerte, sammenkrøpet, inaktiv, vekttap) etter 4 dager etter operasjonen ved å injisere natriumpentobarbital på 200 mg/kg via intraperitoneal injeksjon.
- Tumor engraftment og progresjon kan overvåkes ved hjelp av anestesi og imaging modalitet av valget som bioluminescerende bildebehandling, MR eller PET / MR. Kravet og evnen til å foreta slik avbildning vil være iboende avhengig av de enkelte prosjektmålene og anlegget der det gjennomføres, og avhengig av hvilken type reporter som merker cellelinjene som brukes, vil tilgjengeligheten til relevante radiokjemi- og kjernefysiske bildebehandlingsanlegg36,37
MERK: Noen dyr kan ikke svare godt og oppleve et slag til tross for en vellykket prosedyre. Etter prosedyren må dyr som har symptomer på nevrologisk nød (snu hodet og trekke til den ene siden, sirkle oppførsel, rulle, juling, tap av motorisk funksjon) avlives umiddelbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning av vanlig karotisarterieinjeksjon med eller uten ekstern halspulsåresligering
Når kreftceller ble injisert via arteria carotis communis uten først å ligere arteria carotis24, ble det funnet ansiktssvulster hos 77,8 % av de transplanterte musene (n = 7/9 dyr). Et eksempel på ansiktssvulst er illustrert i supplerende figur 3. Metoden beskrevet i denne protokollen forhindrer utilsiktet ansiktsmetastase ved å ligere den eksterne halspulsåren før den felles halspulsåren.
For å sammenligne de to metodene ble lektin injisert i arteria carotis communis hos culled mus med eller uten ekstern halspulsåren ligering. Deretter ble ansiktsvevet og hjernen fikset, behandlet og observert under fluorescerende mikroskop. Reduksjon i lektin ble observert ved immunfluorescensanalyse i kinnvevet når arteria carotis ekstern carotis var ligert (figur 2A-B). Resultatene viser også at ekstern halspulsåresligering ikke påvirket hjernefødselen fordi lektin kan observeres i hjernevevet hos mus som gjennomgikk vanlig halspulsåreinjeksjon med ekstern halspulsåresligering (figur 2C-D). Derfor kan dette ekstra trinnet lede levering av kreftceller via den indre halspulsåren inn i hjernen med minimal såing til ansiktsvev.
Figur 2: Intrakarotisablevering med og uten ekstern halspulsåresligering. Fluorescerende avbildning av høyre kinnmuskel (A,B) og hjerne (C,D) av mus med lektin (grønn) levert inn i arteria carotis communis, enten med (A,C) eller uten (B,D) ekstern halspulsillasjon. Kinn og hjerne ble avbildet ved 20x og 5x forstørrelse og skala barer representerer henholdsvis 50 og 200 μm. Kjerner (blå) ble farget med DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Bioluminescerende overvåking
En HER2-forsterket brystkreftcellelinje, BT474, som ble genetisk modifisert for å uttrykke luciferase ble brukt i denne studien for å tillate ukentlig overvåking av tumorprogresjon ved å administrere luciferin og utføre in vivo bioluminescerende bildebehandling. I denne BT474-hjernemetastasemodellen kan bioluminescerende signaler observeres fra uke 5 etter intern carotisinjeksjon og gradvis øke i intensitet over tid (figur 3).
Figur 3: Bioluminescerende overvåking og kvantifisering av bioluminescenssignal. Representative ukentlige bioluminescerende bilder fra uke 0 til uke 7 som viser økende intensitet som kommer fra hodet. Grafen viser kvantifiseringen av bioluminescerende signaler hos mus. Data er midler ± standardfeil (n = 4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Magnetisk resonansavbildning (MR)
Dyremodellen med hjernemetastase ble avbildet med T2-vektet MR ved uke 2, 5 og 8 for å vurdere intrakraniell tumorprogresjon. Fra uke 5 til uke 8 kan man observere en region med heterogen signalintensitet, noe som indikerer en intrakraniell tumor med kompleks væskeperfusjon, antagelig fra forstyrret tumorvaskulatur (figur 4A). Blod-hjerne-barrieren i hjernemetastasemodellen er forstyrret og ligner på klinisk hjernemetastase. Dette ble evaluert ved hjelp av gadoliniumkontrastforbedring etterfulgt av en T1-vektet MR-sekvens. Gadoliniumkonsentrasjonen i tumorområdet øker ettersom den lekker fra blodsirkulasjonen til tumorvev. Dette illustreres av det mørklagte området som representerer forkortelsen av T1-avslapningstiden (figur 4B). Data innhentet kan brukes til å korrelere medikamenttilgang til blod-hjerne-barriere permeabilitet. I tillegg kan intrakranielt tumorvolum og overflateareal utledes ved å utføre volumetrisk segmentering ved hjelp av 3D Slicer-bildeanalyseprogramvaren (figur 4C). Dette kan plottes på en graf mot tiden for å spore hjernesvulstvekst.
Figur 4: Karakterisering av dyremodell med hjernemetastase ved hjelp av magnetisk resonansavbildning . (A) T2-vektede tverrgående, koronale og sagittale skanninger av modellen ved uke 1, 5 og 8. I uke 5 kan man se et svakt flekkvis område på sagittalvisningen (rød pil), som utviklet seg til en hyperintens og heterogen region i uke 8. (B) Dynamisk kontrastforsterket T1-vektet MR som viser hjernesvulst (region i rødt) ved før og etter injeksjon av gadoliniumkontrastforbedringsmiddel (CE). Mørke områder indikerer gadoliniumlekkasje og opptak. (C) Tumor visualisert på koronal-, tverr- og sagittalplanet ble kommentert og segmentert ved hjelp av 3D Slicer-bildeanalyseprogramvaren for å utlede intrakranielt tumorvolum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
PET / MR-avbildning for å bestemme biofordelingen av nanomedisin
Kombinasjonen av forstyrret blod-hjerne-barriere og lekkende tumorvaskulatur letter passivt opptak og akkumulering av nanoskala terapeutiske midler, via forbedret permeabilitet og retensjonseffekt36,37. Da BT474-hjernemetastasemodellen overuttrykker HER2, ble det utført hjerneopptak av en zirkonium-89-merket HER2-målrettet nanomedisin ved bruk av positronemisjonstomografi / magnetisk resonans (PET / MR) avbildning (figur 5). I en kohorte av BT474 BM-mus var nanomedisinen oppdaget i tumorområdet høyere enn i ikke-involverte hjernegrupper, og bekreftet akkumuleringen av nanomedisin i hjernemetastaser.
Figur 5: Representativt PET/MR-bilde av zirkonium-89 merket HER2-målrettet nanomedisin (89Zr-HER2-NM) i BT474 hjernemetastasemus. (A) Det venstre bildet viser T2-vekt MR (koronal visning) som viser hjernesvulst (rød region) og uinvolvert hjerne (blå region). De to tilstøtende bildene viser MR-bilder (koronal og tverrgående visning) overlappet med PET-overlegg. Det fargelagte PET-overlegget viser at tumorregionen har høyere opptak av nanomedisinen (hvit, rød, gul) sammenlignet med de ikke-involverte regionene (blå / grønn). (B) Grafen illustrerer økningen i PET-signalintensitet og opptak av nanomedisin (injisert dose per gram, ID / g) i hjernesvulster i forhold til den ikke-involverte hjernen (n = 12). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Overlevelse og fysisk status for BM-modeller
BT474 hjernemetastasemodell overlevde median 9 uker etter injeksjon (figur 6). Etter hvert som hjernemetastasene utviklet seg, begynte dyrene å miste opptil 20% kroppsvekt, som deretter krevde eutanasi (mellom uke 6-9). I sen-stadium hjernemetastaser, de vanlige presentasjonene inkluderer ruffled pels og svulmende og kuppelformede kranier. Dyrene var ofte inaktive, sammenkrøpet og viste funksjonelle underskudd i motoriske ferdigheter og styrke.
Figur 6: Kaplan Meier-kurve av BT474 hjernemetastasemusmodell. Median overlevelse var 9 uker etter injeksjon (n = 18). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Histologi
Etter eutanasi ble dyrene perfundert med en 4% paraformaldehydløsning for å bevare hjernens histologiarkitektur40. Deretter ble hjernen og andre organer behandlet, seksjonert og farget med hematoksylin og eosin (H&E). I denne hjernemetastasemodellen var svulstene lokalisert ensidig, tilsvarende siden av carotisinjeksjonen (figur 7A). BT474-svulstene fremsto for det meste som faste ensomme masser, i noen tilfeller med nesten halvparten av hjernehalvdelen (figur 7B). Lommer med tomme rom ble ofte observert og besto av nekrotiske celler (figur 7C). Mindre utvekster var også til stede hos noen dyr (figur 7E). Immunhistokjemifarging viser at BT474 hjernemetastaser uttrykker sterke HER2 og HER3, noe som tyder på at denne modellen er egnet for HER2- og HER3-målrettede terapier (figur 7F).
Figur 7: Hjernehistologi av BT474 hjernemetastasemodell. (A) Representativ hjerneseksjon av en BT474 BM-mus; fargede bokser merket forstørrede områder av interesse. Skalabar = 2 mm. (B) Fast tumor som består av en masse epiteloidceller. (C) Nekrotiske celler i et rom. (D) Tumor-hjernegrensesnitt (E) Små utvekster kjent som mikrometastaser. (B-E Skala bar = 200 μm). (F) Immunhistokjemiske bilder som viser HER2- og HER3-positivitet og matchet hematoksylin og eosin (H&E). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Systemisk involvering
Det ble ikke observert svulster i vevspartier fra andre organer (figur 8). Dette funnet stemmer overens med de bioluminescerende dataene, hvor bioluminescens bare ble oppdaget fra dyrenes hoder. Sammen viste resultatene at denne modellen er assosiert med ingen påvisbare systemiske svulster.
Figur 8: Histologi av andre organer. Det var ingen åpenbar tumoraffeksjon i organene som ble screenet: bein, lever, nyre, bukspyttkjertel, lunge, hjerte, milt, tarm og eggstokk. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Kanylesprøyte for injeksjon av halspulsåren internt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Øyeblikksbilder av den indre halspulsåren injeksjonsprosessen. Bildebeskrivelse er gitt i tilleggstabell 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: T2-vektet MR-undersøkelse som viser stor intramuskulær tumor i høyre ansiktsvev (skissert rødt). H&E-farget vevsseksjon avslører tettpakkede tumorceller. Skalalinje = 2 mm (midten) og 100 μm (høyre). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Trinnvis beskrivelse av injeksjon av halspulsåren i tillegg figur 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjernemetastase er en kompleks prosess med kreftceller som sprer seg fra deres primære sted til hjernen. Ulike dyremodeller er tilgjengelige som speiler visse stadier av denne flertrinnsprosessen, og det er fysiologiske og praktiske hensyn å designe prekliniske metastasestudier41,42. De fleste publiserte studier som undersøker bruken av nanomedisin for hjernemetastasebehandling har brukt intrakardielle43,44 og intrakranielle 45,46,47,48,49 modeller. Poding kreftceller via halspulsåren kan bedre rekapitulere metastatisk prosess og hjernen metastase patobiologi.
Av erfaring resulterte imidlertid den vanlige karotisinjeksjonsteknikken i at flere dyr presenterte betydelige ansiktstumorer på tidlige tidspunkter. Hos dyr med både aktive hjerne- og ansiktstumorer ble ansiktstumorer observert å vokse raskere i størrelse enn hjernesvulstene. Dette kan skyldes det mer vaskulariserte mikromiljøet som støtter tumorvekst (supplerende figur 3).
Den vanlige halspulsåren leverer blod til ansiktsregionen og hjernen via henholdsvis ytre og karoten arterier. Derfor, i samråd med andre25, vil injeksjon av kreftceller via den vanlige halspulsåren føre til såing i begge regioner. Det er mulig å forhindre ansiktstumorer ved først å ligere den eksterne halspulsåren før vanlig karotisarterieinjeksjon.
Den indre halspulsåren injeksjonsmetoden beskrevet her simulerer hjernemetastase ved å introdusere kreftcellene i det primære blodkaret som forsyner hjernen. Denne modellen rekapitulerer innkvartering av sirkulerende kreftceller i hjernens vaskulære seng, slik at deres transmigrasjon og dannelse av metastatisk hjerneutvekst. Resultatene viser at halspulsåren injeksjon begrenser seeding av kreft til andre organer assosiert med metoder som intrakardiell injeksjon.
Det er noen kritiske hensyn og feilsøkingsinformasjon for protokollen. For det første kan celleklumper okkludere intrakranielle blodkar og utløse et slag. Dette kan reduseres ved å føre cellesuspensjonen gjennom en cellesil for å sikre en klumpfri cellesuspensjon. Deretter kan injeksjon av overflødig væske inn i hjernen resultere i inflammatorisk ødem og hindre vaskulær lateralisering. Dette kan unngås ved å bruke injeksjonsvolum mindre enn 100 μL. Bruk av en sutur med frynsete ender og tilstedeværelse av fascia eller fibrofatty vev kan hindre looping av sutur rundt den eksterne halspulsåren. Det anbefales å først fjerne fascia eller fibrofatty vev ved å bruke en mild tørkebevegelse langs arterien med tangene og fjerne frynsete ender ved å kutte enden av suturen. Til slutt har kreftcellelinjer unike vekstrater, og det er derfor viktig å optimalisere cellekonsentrasjonen for injeksjon. Fra erfaring, i lunge- og melanomhjernemetastasemodeller som involverte de aggressive humane kreftcellelinjene NCI-H1975 og A2058, ble færre celler (1 x 105 celler i 100 μL) injisert for å forhindre rask sykdomsprogresjon.
Det mest utfordrende trinnet i denne protokollen er innsetting av nål i halspulsåren og injeksjon av celler. Det anbefales å bruke en ny nål per dyr for sterilitet fordi bruk av stumpe nåler øker risikoen for punktering eller rive blodkar. Det anbefales også å bruke en sprøytedriver for prosedyren for å redusere den første spruten av injeksjon og rystende nål under injeksjonen. Sprøyteføreren har også den ekstra fordelen å matche injeksjonshastigheten til fysiologisk blodstrømningshastighet.
Denne protokollen er ikke uten begrensninger. Prosedyren er teknisk krevende, og det er fare for at dyr bukker under for slag fra lateraliseringssvikt til tross for at de gjennomgår en vellykket prosedyre. Fra vår erfaring er frekvensen av hjerneslag 11,4% (n = 21/168 dyr). Derfor bør startprøvestørrelsen ta hensyn til disse dyrene som vil dø av slag. Siden denne metoden leverer kreftceller direkte mot hjernen, har den redusert systemisk tumorbelastning og er dermed ikke ideell for å studere systemisk spredning.
Oppsummert vil protokollen tillate generering av hjernemetastasemusmodell egnet for narkotikascreening og evaluering av terapeutisk profil av legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter. Finansiørene hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet, eller i beslutningen om å publisere papiret.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av The Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC), tilskuddsnummer APP1162560. ML ble finansiert av et UQ forskerstipend. Vi vil takke alle som har bistått med dyrehold og in vivo avbildning av dyrene. Vi takker Royal Brisbane og Women's Hospital for å donere aliquots av zirkonium for denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance needle | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
| Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
| Animal heat mat | |||
| Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Autoclave bags | |||
| BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
| Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
| Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| Dissection microscope | |||
| Ear puncher | |||
| Electric clippers | |||
| Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
| Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| Isoflurane | |||
| Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| Mashed mouse chow | |||
| Meloxicam (METACAM) | |||
| Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
| PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
| PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
| Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
| Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| Sticky tape | |||
| Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
| Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
| Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
| Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
| Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Thread | |||
| Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
| Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
- Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
- Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
- Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
- Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
- Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
- Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
- Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
- Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
- Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
- Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
- Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
- Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
- Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
- Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
- Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
- Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
- Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
- Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
- Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
- Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
- Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
- Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
- Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
- Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
- Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
- Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
- Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
- Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
- Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
- Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
- He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
- Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
- Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).
