Modellering av hjernemetastase ved intern karotisarterieinjeksjon av kreftceller

Summary

Hjernemetastase er en årsak til alvorlig sykelighet og dødelighet hos kreftpasienter. De fleste musemodeller for hjernemetastaser kompliseres av systemiske metastaser som forvirrer analyse av dødelighet og terapeutiske intervensjonsutfall. Presentert her er en protokoll for intern carotisinjeksjon av kreftceller som produserer konsistente intrakraniale svulster med minimale systemiske svulster.

Abstract

Hjernemetastase er en årsak til alvorlig sykelighet og dødelighet hos kreftpasienter. Kritiske aspekter ved metastatiske sykdommer, som det komplekse nevrale mikromiljøet og stromalcelleinteraksjonen, kan ikke helt replikeres med in vitro-analyser ; Dermed er dyremodeller avgjørende for å undersøke og forstå effekten av terapeutisk intervensjon. Imidlertid produserer de fleste hjernesvulst xenografting metoder ikke hjernemetastaser konsekvent når det gjelder tidsramme og tumorbelastning. Hjernemetastasemodeller generert ved intrakardiell injeksjon av kreftceller kan resultere i utilsiktet ekstrakraniell tumorbelastning og føre til ikke-hjernemetastatisk sykelighet og dødelighet. Selv om intrakraniell injeksjon av kreftceller kan begrense ekstrakraniell tumordannelse, har den flere advarsler, for eksempel at de injiserte cellene ofte danner en enkelt tumormasse på injeksjonsstedet, høy leptomeningeal involvering og skade på hjernens vaskulatur under nålpenetrasjon. Denne protokollen beskriver en musemodell av hjernemetastase generert ved injeksjon av arteria carotis interna. Denne metoden produserer intrakranielle svulster konsekvent uten involvering av andre organer, noe som muliggjør evaluering av terapeutiske midler for hjernemetastase.

Introduction

Hjernemetastase er en utbredt malignitet assosiert med en svært dårlig prognose ^1,2. Standarden på omsorgen for hjernemetastasepasienter er multimodal, bestående av nevrokirurgi, helhjernestrålebehandling og/eller stereotaktisk radiokirurgi avhengig av pasientenes generelle helsetilstand, ekstrakraniell sykdomsbyrde og antall og plassering av svulster i hjernen ^3,4. Pasienter med opptil tre intrakranielle lesjoner er kvalifisert for kirurgisk reseksjon eller stereotaktisk radiokirurgi, mens helhjernestrålebehandling anbefales for pasienter med flere lesjoner for å unngå risiko for operasjonsrelatert infeksjon og ødem⁵. Imidlertid kan hele hjernestrålebehandling forårsake skade på radiofølsomme hjernestrukturer, noe som bidrar til dårlig livskvalitet⁶.

Systemisk terapi er en ikke-invasiv alternativ og logisk tilnærming til behandling av pasienter med flere lesjoner⁷. Det er imidlertid mindre vurdert på grunn av den langvarige forestillingen om at systemiske terapier har dårlig effekt fordi passiv levering av cytotoksiske legemidler via blodet ikke kan oppnå terapeutiske nivåer i hjernen uten risiko for usikker toksisitet⁸. Dette paradigmet begynner å endre seg med den nylig amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkjente systemiske terapien (tucatinib med trastuzumab og kapecitabin indisert for metastatisk HER2 + brystkreft hjernemetastase) 9,10,11,12 og oppdateringen i behandlingsretningslinjene for å inkludere vurdering av systemiske terapialternativer for hjernemetastasepasienter^13,14.

I denne sammenheng kan utviklingen innen molekylær målrettet terapi, immunterapi og alternative legemiddelleveringssystemer, for eksempel en målrettet nanomedisinbærer, potensielt overvinne utfordringene ved hjernemetastasebehandling^15,16,17,18. I tillegg undersøkes kjemiske og mekaniske tilnærminger for å forbedre legemiddellevering via permeabilisering av hjerne-tumorbarrieren også^19,20. For å studere og optimalisere slike tilnærminger for å være egnet til formålet, er det avgjørende å bruke prekliniske modeller som ikke bare speiler den komplekse fysiologien til hjernemetastase, men også tillater objektiv analyse av intrakraniell legemiddelrespons.

I stor grad involverer de nåværende tilnærmingene til å modellere hjernemetastase in vivo intrakardiell (venstre ventrikel), intravenøs (vanligvis halevene), intrakraniell eller intrakarotis (vanlig halspulsåren) injeksjon av kreftceller hos mus 21,22,23,24,25,26,27 . Bortsett fra tumor engraftment strategier, genetisk konstruert mus modeller hvor tumordannelse utløses ved fjerning av tumor suppressor gener eller aktivering av onkogener er nyttig for tumor modellering. Imidlertid er bare noen få genetisk utviklede musemodeller rapportert å produsere sekundære svulster og enda færre som pålitelig produserer hjernemetastaser^28,29,30.

Engraftment metoder som intrakardiell (venstre ventrikkel) og intravenøs (vanligvis halevene) injeksjon etterligne systemisk spredning av kreft. Disse modellene produserer vanligvis lesjoner i flere organer (f.eks. Hjerne, lunger, lever, nyrer, milt) avhengig av kapillærsengen som fanger de fleste tumorceller under sirkulasjonspasset ³¹. Imidlertid vil inkonsekvente hastigheter av hjernetransplantasjon kreve flere dyr for å oppnå prøvestørrelsen for ønsket statistisk styrke. Antallet tumorceller som etter hvert etablerer seg i hjernen via disse intrakardiale og intravenøse injeksjonsmetodene er variabelt. Derfor kan hjernemetastasetumorbyrden variere mellom dyr, og forskjellen i progresjon kan gjøre standardisering av eksperimentell tidslinje og tolkning av resultater en utfordring. Den ekstrakraniale tumorbyrden kan føre til ikke-hjernemetastasedødelighet, noe som gjør disse modellene uegnet til å evaluere intrakraniell effekt. Hjernetrope cellelinjer er etablert ved hjelp av kunstige klonale seleksjonsprosesser for å redusere ekstrakraniell etablering, men opptakshastighetene har vært inkonsekvente, og den klonale seleksjonsprosessen kan redusere heterogeniteten som normalt finnes i humane svulster³².

Hjernespesifikke engraftmentmetoder som intrakraniell og intrakarotidinjeksjon muliggjør mer konsistent og effektiv hjernemetastasemodellering. I den intrakraniale metoden³³ injiseres kreftceller vanligvis i den frontale hjernebarken, noe som genererer rask og reproduserbar tumorutvekst med lav systemisk involvering. Mens prosedyren tolereres godt med lav dødelighet³³, er forbeholdene at det er en relativt grov tilnærming som raskt introduserer en (lokalisert) bolus av celler i hjernen og ikke modellerer tidlig patogenese av hjernemetastase. Nålen skader hjernevevsvaskulaturen, som deretter forårsaker lokalisert betennelse ^5,34. Av erfaring er det en tendens til at tumorcelleinjektat refluks under fjerning av nålen, noe som fører til leptomeningeal involvering. Alternativt leverer intrakarotismetoden celler inn i den vanlige halspulsåren med hjernemikrovaskulatur som den første kapillærsengen som skal oppstå, modellering av overlevelse i sirkulasjon, ekstravasasjon og kolonisering²⁴. I samråd med andre²⁵ fant vi i vår erfaring med denne metoden at den kan resultere i ansiktssvulster på grunn av utilsiktet tilførsel av kreftceller via arteria carotis til kapillærsenger i dette vevet (upubliserte data). Det er mulig å forebygge ansiktssvulster ved først å ligere arteria carotis communis før vanlig halspulsåreinjeksjon (figur 1). I resten av artikkelen omtales denne metoden som «injeksjon av arteria carotis interna». Av erfaring genererer den indre halspulsåreinjeksjonsmetoden konsekvent hjernemetastase med svært få systemiske hendelser og har vært vellykket i å generere hjernemetastasemodeller av forskjellige primære kreftformer (f.eks. melanom, bryst og lungekreft) (figur 1). Ulempene er at det er teknisk utfordrende, tidkrevende, invasivt og krever nøye optimalisering av celletall og en overvåkingstidslinje. Oppsummert produserer både intrakranielle og interne halspulsåreinjeksjonsmetoder musemodeller som er egnet for å evaluere terapeutisk effekt på hjernesvulstrelatert overlevelsesfordel.

Denne protokollen beskriver den interne halspulsåren injeksjonsmetode for å produsere en musemodell av hjernemetastase med nesten ingen systemisk involvering og derfor egnet for preklinisk evaluering av legemiddeldistribusjon og effekt av eksperimentelle terapier.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av indre halspulsåren injeksjonsprotokoll for hjernemetastase. Intern halspulsåren injeksjon med ekstern halspulsåren ligering kan pålitelig produsere en hjernemetastase modell fra ulike primære kreftformer. I denne protokollen er tre ligaturer plassert på halspulsåren (annotert som L1-L3 i figuren). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle studier ble utført innenfor retningslinjene fra Animal Ethics Committee ved University of Queensland (UQCCR / 186/19), og den australske koden for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelig formål. 1. Forberedelse av kreftceller til injeksjon MERK: I denne studien ble den humane brystkreftcellelinjen, BT-474 (BT474), brukt. BT474 ble dyrket i komplett vekstmedium bestående av RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% insulin. C…

Representative Results

Sammenligning av vanlig karotisarterieinjeksjon med eller uten ekstern halspulsåresligeringNår kreftceller ble injisert via arteria carotis communis uten først å ligere arteria carotis24, ble det funnet ansiktssvulster hos 77,8 % av de transplanterte musene (n = 7/9 dyr). Et eksempel på ansiktssvulst er illustrert i supplerende figur 3. Metoden beskrevet i denne protokollen forhindrer utilsiktet ansiktsmetastase ved å ligere den ekstern…

Discussion

Hjernemetastase er en kompleks prosess med kreftceller som sprer seg fra deres primære sted til hjernen. Ulike dyremodeller er tilgjengelige som speiler visse stadier av denne flertrinnsprosessen, og det er fysiologiske og praktiske hensyn å designe prekliniske metastasestudier^41,42. De fleste publiserte studier som undersøker bruken av nanomedisin for hjernemetastasebehandling har brukt intrakardielle^43,44 og intrakranielle 45,46,47,48…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010