Summary
Hersenmetastase is een oorzaak van ernstige morbiditeit en mortaliteit bij kankerpatiënten. De meeste muismodellen voor hersenmetastasen worden gecompliceerd door systemische metastasen die de analyse van mortaliteit en therapeutische interventie-uitkomsten verstoren. Hier gepresenteerd is een protocol voor interne carotisinjectie van kankercellen dat consistente intracraniale tumoren produceert met minimale systemische tumoren.
Abstract
Hersenmetastase is een oorzaak van ernstige morbiditeit en mortaliteit bij kankerpatiënten. Kritische aspecten van gemetastaseerde ziekten, zoals de complexe neurale micro-omgeving en stromale celinteractie, kunnen niet volledig worden gerepliceerd met in vitro assays; diermodellen zijn dus van cruciaal belang voor het onderzoeken en begrijpen van de effecten van therapeutische interventie. De meeste xenotransplantatiemethoden voor hersentumoren produceren echter niet consistent hersenmetastasen in termen van het tijdsbestek en de tumorlast. Hersenmetastasemodellen gegenereerd door intracardiale injectie van kankercellen kunnen leiden tot onbedoelde extracraniële tumorbelasting en leiden tot niet-hersenmetastase morbiditeit en mortaliteit. Hoewel intracraniale injectie van kankercellen de extracraniële tumorvorming kan beperken, heeft het verschillende kanttekeningen, zoals de geïnjecteerde cellen vormen vaak een enkelvoudige tumormassa op de injectieplaats, hoge leptomeningeale betrokkenheid en schade aan de vasculatuur van de hersenen tijdens naaldpenetratie. Dit protocol beschrijft een muismodel van hersenmetastasen gegenereerd door interne halsslagaderinjectie. Deze methode produceert intracraniale tumoren consequent zonder de betrokkenheid van andere organen, waardoor de evaluatie van therapeutische middelen voor hersenmetastase mogelijk wordt.
Introduction
Hersenmetastase is een veel voorkomende maligniteit geassocieerd met een zeer slechte prognose 1,2. De standaardzorg voor patiënten met hersenmetastase is multimodaal, bestaande uit neurochirurgie, radiotherapie van de hele hersenen en / of stereotactische radiochirurgie, afhankelijk van de algemene gezondheidstoestand van de patiënt, extracraniële ziektelast en het aantal en de locatie van tumoren in de hersenen 3,4. Patiënten met maximaal drie intracraniale laesies komen in aanmerking voor chirurgische resectie of stereotactische radiochirurgie, terwijl bestralingstherapie van de hele hersenen wordt aanbevolen voor patiënten met meerdere laesies om het risico op operatiegerelateerde infectie en oedeem te voorkomen5. Radiotherapie van de hele hersenen kan echter schade toebrengen aan radiogevoelige hersenstructuren, wat bijdraagt aan een slechte kwaliteit van leven6.
Systemische therapie is een niet-invasieve alternatieve en logische benadering voor de behandeling van patiënten met meerdere laesies7. Het wordt echter minder overwogen vanwege het al lang bestaande idee dat systemische therapieën een slechte werkzaamheid hebben omdat de passieve toediening van cytotoxische geneesmiddelen via de bloedbaan geen therapeutische niveaus in de hersenen kan bereiken zonder het risico op onveilige toxiciteit8. Dit paradigma begint te veranderen met de onlangs door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde systemische therapie (tucatinib met trastuzumab en capecitabine geïndiceerd voor gemetastaseerde HER2 + borstkanker hersenmetastase)9,10,11,12 en de update in behandelingsrichtlijnen om rekening te houden met systemische therapieopties voor hersenmetastasen patiënten 13,14.
In deze context kunnen ontwikkelingen op het gebied van moleculaire gerichte therapie, immunotherapie en alternatieve toedieningssystemen voor geneesmiddelen, zoals een gerichte nanogeneesmiddeldrager, mogelijk de uitdagingen van de behandeling van hersenmetastasen overwinnen 15,16,17,18. Daarnaast worden ook chemische en mechanische benaderingen onderzocht om de medicijnafgifte te verbeteren via permeabilisatie van de hersentumorbarrière19,20. Om dergelijke benaderingen te bestuderen en te optimaliseren om geschikt te zijn voor het doel, is het cruciaal om preklinische modellen te gebruiken die niet alleen de complexe fysiologie van hersenmetastase weerspiegelen, maar ook een objectieve analyse van intracraniale geneesmiddelrespons mogelijk maken.
In grote lijnen omvatten de huidige benaderingen om hersenmetastasen in vivo te modelleren intracardiale (linker ventrikel), intraveneuze (meestal staartader), intracraniale of intracarotis (gemeenschappelijke halsslagader) injectie van kankercellen bij muizen 21,22,23,24,25,26,27 . Afgezien van tumortransplantatiestrategieën, zijn genetisch gemanipuleerde muismodellen waarbij tumorvorming wordt geactiveerd door de verwijdering van tumorsuppressorgenen of activering van oncogenen nuttig voor tumormodellering. Er wordt echter gemeld dat slechts een paar genetisch gemanipuleerde muismodellen secundaire tumoren produceren en nog minder die betrouwbaar hersenmetastasen produceren 28,29,30.
Engraftmentmethoden zoals intracardiale (linker ventrikel) en intraveneuze (meestal staartader) injectie bootsen de systemische verspreiding van kanker na. Deze modellen produceren meestal laesies in meerdere organen (bijv. Hersenen, longen, lever, nieren, milt), afhankelijk van het capillaire bed dat de meeste tumorcellen gevangen houdt tijdens hun circulerende 'first pass'31. Inconsistente snelheden van hersentransplantatie zullen echter meer dieren vereisen om de steekproefgrootte voor de gewenste statistische kracht te bereiken. Het aantal tumorcellen dat zich uiteindelijk via deze intracardiale en intraveneuze injectiemethoden in de hersenen nestelt, is variabel. Vandaar dat de tumorlast van hersenmetastase kan variëren tussen dieren en het verschil in progressie kan het standaardiseren van de experimentele tijdlijn en interpretatie van resultaten een uitdaging maken. De extracraniële tumorlast kan leiden tot niet-hersenmetastasesterfte, waardoor deze modellen ongeschikt zijn voor het evalueren van intracraniale werkzaamheid. Hersentropencellijnen zijn vastgesteld met behulp van kunstmatige klonale selectieprocessen om extracraniële vestiging te verminderen, maar de opnamesnelheden zijn inconsistent geweest en het klonale selectieproces kan de heterogeniteit verminderen die normaal wordt aangetroffen in menselijke tumoren32.
Hersenspecifieke engraftmentmethoden zoals de intracraniale en intracarotide-injectie zorgen voor een consistentere en efficiëntere modellering van hersenmetastase. In de intracraniale methode33 worden kankercellen meestal geïnjecteerd in de frontale hersenschors, die een snelle en reproduceerbare tumoruitgroei genereert met een lage systemische betrokkenheid. Hoewel de procedure goed wordt verdragen met een lage mortaliteit33, zijn de kanttekeningen dat het een relatief ruwe benadering is die snel een (gelokaliseerde) bolus van cellen in de hersenen introduceert en geen vroege pathogenese van hersenmetastase modelleert. De naald beschadigt de vasculatuur van hersenweefsel, wat vervolgens een gelokaliseerde ontsteking veroorzaakt 5,34. Uit ervaring is er een tendens voor tumorcelinjectaat tot reflux tijdens het verwijderen van de naald, wat leidt tot leptomeningeale betrokkenheid. Als alternatief levert de intracarotidemethode cellen in de gemeenschappelijke halsslagader met hersenmicrovasculatuur als het eerste capillaire bed dat wordt aangetroffen, waarbij overleving in circulatie, extravasatie en kolonisatie wordt gemodelleerd24. In overeenstemming met anderen25, bleek uit onze ervaring met deze methode dat het kan resulteren in gezichtstumoren als gevolg van onbedoelde afgifte van kankercellen via de externe halsslagader naar capillaire bedden in deze weefsels (ongepubliceerde gegevens). Het is mogelijk om gezichtstumoren te voorkomen door eerst de uitwendige halsslagader te bruinen voordat de gemeenschappelijke injectie van de halsslagader wordt geadopteerd (figuur 1). In de rest van het artikel wordt deze methode de 'interne halsslagaderinjectie' genoemd. Uit ervaring blijkt dat de interne carotisslagaderinjectiemethode consequent hersenmetastasen genereert met zeer weinig systemische gebeurtenissen en succesvol is geweest in het genereren van hersenmetastasemodellen van verschillende primaire kankers (bijv. Melanoom, borst- en longkanker) (figuur 1). De nadelen zijn dat het technisch uitdagend, tijdrovend, invasief is en een zorgvuldige optimalisatie van celaantallen en een monitoringtijdlijn vereist. Samenvattend produceren zowel de intracraniale als de interne carotisslagaderinjectiemethoden muismodellen die geschikt zijn voor het evalueren van de therapeutische impact op het overlevingsvoordeel van hersentumoren.
Dit protocol beschrijft de interne halsslagaderinjectiemethode om een muismodel van hersenmetastase te produceren met bijna geen systemische betrokkenheid en daarom geschikt voor preklinische evaluatie van medicijndistributie en werkzaamheid van experimentele therapieën.
Figuur 1: Schematische weergave van het interne carotisslagaderinjectieprotocol voor hersenmetastasen. Interne halsslagaderinjectie met externe ligatie van de halsslagader kan op betrouwbare wijze een hersenmetastasemodel produceren van verschillende primaire kankers. In dit protocol worden drie ligaturen op de halsslagader geplaatst (geannoteerd als L1-L3 in de figuur). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies werden uitgevoerd binnen de richtlijnen van de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Queensland (UQCCR / 186/19) en de Australian Code for the Care and Use of Animals for Science Purpose.
1. Voorbereiding van kankercellen voor injectie
OPMERKING: In deze studie werd de cellijn van menselijke borstkanker, BT-474 (BT474), gebruikt. BT474 werd gekweekt in een volledig groeimedium bestaande uit RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% insuline. De cellen werden in een incubator bij 37 °C gehouden met 5% koolstofdioxide in de luchtatmosfeer. Authenticeer de cellijn door satelliet tandem herhaalt testen35, bevestig de expressie van het reporter-eiwit (bijv. Luciferase) indien aanwezig, en controleer op mycoplasma-infectie.
- Zaai BT474-kankercellen met een zaaidichtheid van 2,0 x 106 cellen in een T75-kolf met behulp van 10 ml volledige groeimedia en -cultuur (bij 37 °C met 5% CO2) tot 70% -80% confluency voorafgaand aan injectie.
- Gooi op de dag van injectie groeimedia weg en was de celmonolaag tweemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 5 ml voorgewarmd celkweekdissociatiereagens toe (zie materiaaltabel) en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat de cellen zijn losgekomen. Tik na 5 minuten zachtjes op de kolf om de cellostatie te bevorderen.
- Voeg 5 ml volledige groeimedia toe die 10% foetaal runderserum bevatten om de dissociatiereagensactiviteit te doven.
- Resuspendeer de cellen voorzichtig door te pipetteren om celklonters te verminderen.
- Breng de celsuspensie over in een buis van 50 ml en centrifugeer bij 180 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteer het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zonder calcium en magnesium om celklontering te minimaliseren.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 180 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteer het supernatant om het resterende serum/dissociatiereagens te verwijderen en resuspenseer de celpellet in 3 ml HBSS.
- Plaats een celzeef van 100 μm op een verse conische buis van 50 ml en laat de celsuspensie door om celklonters te verwijderen.
OPMERKING: Een eencellige suspensie is essentieel om de occlusie van bloedvaten en het risico op een beroerte bij injectie te minimaliseren. - Bereken het aantal levensvatbare cellen met behulp van Trypan Blue-uitsluiting en een hemocytometer met standaardmethoden.
- Verdun de celsuspensie met HBSS tot een celconcentratie van 2,5 x 106 cellen/ml.
- Houd de buis horizontaal op ijs en schommel de buis voorzichtig periodiek om klonteren te minimaliseren. De celsuspensie kan maximaal 6 uur op ijs worden bewaard.
LET OP: Schommelen is handmatig gedaan maar dit kan ook met behulp van een shaker bij lage toeren.
2. Voorbereiding van de muis voor de procedure
OPMERKING: In deze studie, 4-5 weken oud, werden vrouwelijke NOD scid-muizen gebruikt. Introduceer herstelvoedsel met een zacht dieet (bijv. Dieetgel, hydrogel, gepureerde muis chow) aan muizen 3 dagen vóór de procedure om het voeden na de procedure aan te moedigen.
- Autoclaaf chirurgische hulpmiddelen. Spuit en veeg het chirurgische gebied en de apparatuur af met oppervlaktedesinfectiemiddel, gevolgd door 70% ethanol.
- Plaats een dierlijke warmtemat onder de operatieplaat om onderkoeling te voorkomen. Schakel dit 30 minuten voor de operatie in. Spuit en veeg de operatieplaat af met oppervlaktedesinfectiemiddel gevolgd door 70% ethanol.
- Bereid een schone kooi voor dierenhuisvesting en een warm verwarmingskussen voor herstel.
- Trek schone persoonlijke beschermingsmiddelen aan (jurk, masker, haarnetje en handschoenen). Behoud steriliteit tijdens de hele procedure door schone onderzoekshandschoenen en een 'instruments tips-only' techniek te gebruiken.
- Verdoof de muis met een verdovingskamer met behulp van 5% isofluraan met een zuurstofstroom van 2 L/min totdat de muis de pedaalreflex verliest.
- Haal het dier uit de kamer en plaats het in een neuskegel die 2% isofluraan aflevert bij een zuurstofstroom van 2 L/min voor de resterende chirurgische ingreep.
- Oorponsmuis voor identificatie en gebruik elektrische tondeuses om de vacht uit het nekgebied te scheren. Reinig overtollig haar van de blootgestelde huid met tape.
- Weeg de muis voor het berekenen van de benodigde anesthetische en pijnstillende medicijndoses. Dien buprenorfine en meloxicam toe met respectievelijk 50 μg/kg en 1 mg/kg via subcutane injectie.
- Breng de muis over op een warme operatieplaat en bevestig de neuskegel met tape.
- Breng oculair glijmiddel aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Bevestig de muis voorzichtig door eerst de bovenste snijtanden te haken met draad die op de operatieplaat is geplakt, gevolgd door het vastplakken van de voor- en achterpoten. Deze stap verlengt het lichaam en houdt de nek recht tijdens de procedure.
- Voer preoperatieve huidvoorbereiding uit zoals hieronder beschreven.
- Veeg de nek af met actueel antisepticum (povidon-jodium) om de belasting van de microflora van de huid te verminderen en los haar te verwijderen. Reinig vanuit het midden van de huid en werk naar buiten om herbesmetting van de incisieplaats te voorkomen. Herhaal het proces met 70% ethanol. Voer drie afwisselende rondes jodium en ethanol uit voor desinfectie.
- Leg een chirurgisch gordijn over het dier. Dit wordt gesneden en gemaakt van een stuk steriel papieren handdoekje of autoclaafzak.
- Leg steriele papieren handdoeken of autoclaafzakken neer voor chirurgische hulpmiddelen.
- Controleer op reflex via 'Pinch test' om voldoende anesthesie te garanderen voordat u doorgaat met de procedure.
3. Interne halsslagaderinjectie
OPMERKING: In dit experiment werd een 31 G infusiecanule en voet-geactiveerde spuit-driver setup gebruikt om de injectieprocedure te vergemakkelijken (aanvullende figuur 1). Deze opstelling is optioneel en de gebruiker kan een insulinespuit van 31 G gebruiken en stap 3.11 en 3.12 overslaan. Om de infusiecanule te bereiden, trekt u het naaldgedeelte van een naald van een naald van 31 G met behulp van twee paar hechtklemmen en scheidt u het van het spuitgedeelte. Bevestig vervolgens het naaldgedeelte aan het ene uiteinde van een fijne infusieslang van ongeveer 10 cm lang.
- Plaats de dissectiemicroscoop op de muis.
- Maak met een schaar een verticale incisie van 15 mm langs de middellijn in het nekgebied vanaf 5 mm onder de kaak tot de thoracale inlaat.
- Gebruik twee paar schuine tangen, deel de huid en onderliggende speekselklieren en breng retractors aan om de luchtpijp bloot te houden. De volgende stap zal de halsslagaderschede blootleggen die parallel aan de luchtpijp ligt.
- Gebruik twee paar fijne schuine tangen om het spier- en vetweefsel naast de luchtpijp botweg te ontleden om de rechter halsslagaderschede bloot te leggen. De halsslagaderschede is de vezelige laag die de gemeenschappelijke halsslagader, ader en nervus vagus bedekt, en deze bundel kan worden gevisualiseerd door de felrode gemeenschappelijke halsslagader. In dit onderzoek werd de injectie uitgevoerd op de rechter halsslagader.
- Verwijder een segment van de gemeenschappelijke halsslagader caudaal naar de halsslagader bifurcatie van de omliggende fascia en scheid het van de nervus vagus en aderen.
- Isoleer en verwijder de carotis-bifurcatie (de overgang die de externe en interne halsslagaders verbindt) van de omliggende zenuwen en fascia. Plaats fijne tangen onder de externe halsslagader en passeer een zijden hechtdraad (5-0 dikte) onder de slagader. Knoop en span de hechting aan en knip overtollige lijn.
OPMERKING: Deze ligatuur (L1) voorkomt dat injectaat door de uitwendige halsslagader gaat. - Plaats fijne tangen onder de gemeenschappelijke halsslagader en passeer een zijden hechtdraad (5-0 dikte) onder de slagader. Bind een knoop en span de hechting aan op een positie proximaal aan de voorgestelde injectieplaats. Snijd de overtollige hechting en laat ongeveer 10 mm lijn achter.
OPMERKING: Deze tweede ligatuur (L2) zal de bloedstroom en bloedingen na injectie beperken. Het wordt ook gebruikt om de halsslagader tijdens de injectie te positioneren en vast te houden. - Snijd en bevochtig een strook (geautoclaveerde) wegwerpwissers met weinig pluisjes (zie Materiaaltabel) ongeveer 10 mm x 5 mm. Vouw de strip in 4 mm x 5 mm, 2-3 mm dik en plaats deze onder de halsslagader op de voorgestelde injectieplaats. Dit zal het vat ondersteunen tijdens de injectie.
- Plaats op de gemeenschappelijke halsslagader rostral naar de voorgestelde injectieplaats een derde ligatie (L3) met een losse knoop. Dit wordt pas na de injectie aangescherpt (bij stap 3.16).
- Roer de celsuspensie voorzichtig en trek 200 μL celsuspensie in een insulinespuit (met een naald van 31 G).
- Plaats de spuit in de spuitdriver die is aangesloten op een activerend voetpedaal.
- Bevestig een fijne canule met een naald van 31 G aan de spuit en prime de lijn.
- Controleer of de halsslagader goed gepositioneerd en onder druk staat.
- Gebruik twee fijne schuine tangen, waarvan de ene zachtjes op het uiteinde van de eerste ligatuur spant en de andere de naald van 31 G vasthoudt, steekt u de naald langzaam met schuine kant omhoog in het lumen van het bloedvat en zorgt u ervoor dat deze niet wordt doorboord.
- Injecteer langzaam 100 μL celsuspensie (vanaf stap 1.13) in de gemeenschappelijke halsslagader met 10 μL/s. Dit levert 2,5 x 105 cellen in het bloedvat. Succesvolle injectie wordt gevisualiseerd via het verwijderen van bloed uit het carotisbloedvat.
- Til de losse ligatuur (L3) (vanaf stap 3.9) onmiddellijk na het terugtrekken van de naald voorzichtig op en span deze aan om terugstroming en bloedingen te voorkomen. Snijd overtollige hechting bij.
OPMERKING: Het is normaal om een kleine hoeveelheid bloedspurt te observeren na het terugtrekken van de naald. Er mag echter geen actieve bloeding zijn nadat de derde ligatuur is aangespannen. - Verwijder het stuk bevochtigde wegwerpwissers met weinig pluisjes.
- Spoel de operatieholte met behulp van een P200-pipet tweemaal met 150-200 μL steriel water of zoutoplossing.
- Controleer opnieuw op bloedingen en verwijder vervolgens de oprolmechanismen.
- Verplaats het zachte weefsel, de speekselklieren en de huid over de halsslagader en luchtpijp.
- Sluit de huidlaag van de incisie met behulp van een hechtnaaldhouder, een tang en een absorbeerbare of niet-absorbeerbare 6/0 monofilament hechting in een continu patroon.
- Gooi de canule naaldspuit weg en bereid een nieuwe opstelling voor de volgende muis voor. Het gebruik van een nieuwe spuit zorgt ervoor dat het aantal cellen dat in elke muis wordt geïnjecteerd consistent is.
OPMERKING: Representatieve momentopnamen van de procedure staan in aanvullende figuur 2. Als het vat wordt doorboord of gescheurd door de naald, aangegeven door het lekken van injectaat of bloeding, wordt de procedure als niet succesvol beschouwd. Hierna moet de naald worden teruggetrokken en moet de derde ligatuur onmiddellijk worden aangespannen om verdere bloedingen te voorkomen. Als het bloeden aanhoudend is na het aanspannen van de hechting, moet het dier worden geëuthanaseerd met pentobarbital.
4. Herstel na injectie
- Injecteer buprenorfine (50 μg/kg) en meloxicam (1 mg/kg) via subcutane injectie als postoperatieve pijnverlichting.
- Verplaats het dier naar een warme en schone kooi om te herstellen van de anesthesie. Het is normaal dat een dier na het ontwaken een ingetogen activiteit heeft (ineengedoken en inactief of langzaam bewegen).
- Breng na 30-45 minuten muizen over naar een langdurige bewaarfaciliteit.
- Geef muizen een zacht dieet (dieetgel, hydrogel, puree) gedurende ten minste een week na de operatie en controleer de fysieke status dagelijks met speciale aandacht voor tekenen van beroerte, infectie, bloeding rond de wondplaats.
- Twee dagen na de operatie is het typisch voor het dier om verminderde activiteit, milde gegolfde vacht te hebben en 15% van het pre-operatieve lichaamsgewicht te verliezen. Dien analgeticum (meloxicam) dagelijks toe gedurende 2-3 dagen na de operatie om pijn te beheersen en het herstel te bevorderen.
- Vanaf dag 3 moeten dieren weer activiteit hebben, de voedings- en verzorgingsfrequentie hebben verhoogd en weer op gewicht komen. Euthanaseer dieren met aanhoudende fysieke conditiestoornissen (pijn, ineengedoken, inactief, gewichtsverlies) na 4 dagen na de operatie door natriumpentobarbital van 200 mg/kg te injecteren via intraperitoneale injectie.
- Tumortransplantatie en progressie kunnen worden gecontroleerd met behulp van anesthesie en beeldvormingsmodaliteit naar keuze, zoals bioluminescente beeldvorming, MRI of PET / MRI. De vereiste en het vermogen om dergelijke beeldvorming uit te voeren, zal inherent afhankelijk zijn van de individuele projectdoelen en -faciliteit waarbinnen het wordt uitgevoerd, en afhankelijk van het type reporter dat de gebruikte cellijnen tagt, de toegankelijkheid van relevante radiochemische en nucleaire beeldvormingsfaciliteiten36,37
OPMERKING: Sommige dieren reageren mogelijk niet goed en ervaren een beroerte ondanks een succesvolle procedure. Na de procedure moeten dieren die symptomen van neurologische nood vertonen (hoofd draaien en naar één kant trekken, cirkelgedrag, rollen, gooien, verlies van motorische functie) onmiddellijk worden geëuthanaseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vergelijking van gemeenschappelijke injectie van de halsslagader met of zonder ligatie van de uitwendige halsslagader
Wanneer kankercellen werden geïnjecteerd via de gemeenschappelijke halsslagader zonder eerst de externe halsslagader te bruinen24, werden gezichtstumoren gevonden bij 77,8% van de getransplanteerde muizen (n = 7/9 dieren). Een voorbeeld van een gezichtstumor wordt geïllustreerd in aanvullende figuur 3. De methode die in dit protocol wordt beschreven, voorkomt onbedoelde gezichtsmetastasen door de externe halsslagader vóór de gemeenschappelijke halsslagader te plaatsen.
Om de twee methoden te vergelijken, werd lectine geïnjecteerd in de gemeenschappelijke halsslagader van geruimde muizen met of zonder externe ligatie van de halsslagader. Vervolgens werden het gezichtsweefsel en de hersenen gefixeerd, verwerkt en geobserveerd onder een fluorescerende microscoop. Een vermindering van lectine werd waargenomen bij immunofluorescentieanalyse in de wangweefsels wanneer de uitwendige halsslagader werd geligeerd (figuur 2A-B). De resultaten tonen ook aan dat externe ligatie van de halsslagader geen invloed had op de hersenafgifte, omdat lectine kan worden waargenomen in het hersenweefsel van muizen die een gemeenschappelijke halsslagaderinjectie met externe halsslagaderligatie ondergingen (figuur 2C-D). Daarom kan deze extra stap de levering van kankercellen via de interne halsslagader in de hersenen leiden met minimale zaaiing naar gezichtsweefsel.
Figuur 2: Intracarotide transplantaatafgifte met en zonder uitwendige halsslagaderligatie. Fluorescerende beeldvorming van de rechter wangspier (A,B) en hersenen (C,D) van muizen met lectine (groen) afgeleverd in de gemeenschappelijke halsslagader, hetzij met (A,C) of zonder (B,D) externe carotisligatie. Wang en hersenen werden afgebeeld bij 20x en 5x vergroting en schaalbalken vertegenwoordigen respectievelijk 50 en 200 μm. Kernen (blauw) waren gekleurd met DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bioluminescente monitoring
Een HER2-versterkte borstkankercellijn, BT474, die genetisch was gemodificeerd om luciferase tot expressie te brengen, werd in deze studie gebruikt om wekelijkse monitoring van tumorprogressie mogelijk te maken door luciferine toe te dienen en in vivo bioluminescente beeldvorming uit te voeren. In dit BT474-hersenmetastasemodel kunnen bioluminescente signalen worden waargenomen vanaf week 5 na interne carotisinjectie en geleidelijk in intensiteit toenemen in de loop van de tijd (figuur 3).
Figuur 3: Bioluminescente monitoring en kwantificering van bioluminescentiesignaal. Representatieve wekelijkse bioluminescente beelden van week 0 tot week 7 die een toenemende intensiteit van het hoofd laten zien. De grafiek toont de kwantificering van bioluminescente signalen bij muizen. Gegevens zijn middelen ± standaardfout (n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Magnetische resonantie beeldvorming (MRI)
Het diermodel met metastase in de hersenen werd in week 2, 5 en 8 in beeld gebracht met behulp van T2-gewogen MRI om de progressie van intracraniële tumoren te beoordelen. Van week 5 tot week 8 kan een gebied met heterogene signaalintensiteit worden waargenomen, wat wijst op een intracraniale tumor met complexe vloeistofperfusie, vermoedelijk van verstoorde tumorvasculatuur (figuur 4A). De bloed-hersenbarrière in het hersenmetastasemodel is verstoord en lijkt op die van klinische hersenmetastasen. Dit werd geëvalueerd met behulp van gadoliniumcontrastverbetering gevolgd door een T1-gewogen MRI-sequentie. De gadoliniumconcentratie in het tumorgebied neemt toe naarmate het uit de bloedcirculatie in tumorweefsel lekt. Dit wordt geïllustreerd door het verduisterde gebied dat de verkorting van de T1-relaxatietijd vertegenwoordigt (figuur 4B). Verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om de toegang van geneesmiddelen te correleren met de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière. Bovendien kunnen het volume en het oppervlak van de intracraniële tumor worden afgeleid door volumetrische segmentatie uit te voeren met behulp van de 3D Slicer-beeldanalysesoftware (figuur 4C). Dit kan worden uitgezet op een grafiek tegen de tijd om de groei van hersentumoren te volgen.
Figuur 4: Karakterisering van het diermodel van de hersenmetastase met behulp van magnetische resonantie beeldvorming. (A) T2-gewogen transversale, coronale en sagittale scans van het model in week 1, 5 en 8. In week 5 is een vaag fragmentarisch gebied te zien op de sagittale weergave (rode pijl), die in week 8 evolueerde naar een hyperintense en heterogeen gebied. (B) Dynamische contrastversterkte T1-gewogen MRI die een hersentumor (rood gebied) toont bij voor en na injectie van gadoliniumcontrastverbeteringsmiddel (CE). Donkere gebieden wijzen op gadoliniumlekkage en -opname. (C) Tumor gevisualiseerd op de coronale, transversale en sagittale vlakken werd geannoteerd en gesegmenteerd met behulp van de 3D Slicer-beeldanalysesoftware om het intracraniale tumorvolume af te leiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
PET/MR beeldvorming om de biodistributie van nanogeneeskunde te bepalen
De combinatie van verstoorde bloed-hersenbarrière en de lekkende tumorvasculatuur vergemakkelijkt de passieve opname en accumulatie van therapieën op nanoschaal, via verbeterde permeabiliteit en retentie-effect36,37. Terwijl het BT474-hersenmetastasemodel HER2 overexpressie geeft, werd de opname in de hersenen van een zirkonium-89-gelabelde HER2-gerichte nanogeneeskunde uitgevoerd met behulp van positronemissietomografie / magnetische resonantie (PET / MR) beeldvorming (figuur 5). In een cohort van BT474 BM-muizen was de nanogeneeskunde die in het tumorgebied werd gedetecteerd hoger dan die in niet-betrokken hersengebieden, wat de accumulatie van nanogeneeskunde in hersenmetastasen bevestigde.
Figuur 5: Representatieve PET/MR-afbeelding van zirkonium-89 gelabeld ALS HER2-gerichte nanogeneeskunde (89Zr-HER2-NM) bij BT474 hersenmetastase muizen. (A) De linker afbeelding toont T2-gewicht MRI (coronale weergave) met hersentumor (rood gebied) en niet-betrokken hersenen (blauw gebied). De twee aangrenzende afbeeldingen tonen MRI-beelden (coronale en transversale weergave) gesuperponeerd met PET-overlay. De gekleurde PET-overlay laat zien dat het tumorgebied een hogere opname van de nanogeneeskunde heeft (wit, rood, geel) in vergelijking met de niet-betrokken regio's (blauw / groen). (B) De grafiek illustreert de toename van de PET-signaalintensiteit en opname van nanogeneeskunde (geïnjecteerde dosis per gram, ID / g) in hersentumoren ten opzichte van de niet-betrokken hersenen (n = 12). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Overleving en fysieke status van BM-modellen
Het BT474 hersenmetastasemodel overleefde een mediaan van 9 weken na injectie (figuur 6). Naarmate de hersenmetastasen vorderden, begonnen dieren tot 20% lichaamsgewicht te verliezen, waarvoor vervolgens euthanasie nodig was (tussen week 6-9). In een laat stadium van hersenmetastasen omvatten de meest voorkomende presentaties gegolfde vacht en uitpuilende en koepelvormige schedels. De dieren waren vaak inactief, ineengedoken en vertoonden functionele tekorten in motoriek en kracht.
Figuur 6: Kaplan Meier curve van BT474 hersenmetastase muismodel. De mediane overleving was 9 weken na injectie (n = 18). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Histologie
Na euthanasie werden de dieren doordrenkt met een 4% paraformaldehyde-oplossing om de histologie van de hersenen te behouden40. Vervolgens werden de hersenen en andere organen verwerkt, gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E). In dit hersenmetastasemodel bevonden de tumoren zich eenzijdig, overeenkomend met de zijkant van de halsslagaderinjectie (figuur 7A). De BT474-tumoren verschenen meestal als vaste solitaire massa's, waarbij in sommige gevallen bijna de helft van de hersenhelft betrokken was (figuur 7B). Pockets met lege ruimten werden vaak waargenomen en bestonden uit necrotische cellen (figuur 7C). Bij sommige dieren waren ook kleinere uitlopers aanwezig (figuur 7E). Immunohistochemische kleuring toont aan dat BT474-hersenmetastasen sterke HER2 en HER3 tot expressie brengen, wat suggereert dat dit model geschikt is voor HER2- en HER3-gerichte therapieën (figuur 7F).
Figuur 7: Hersenhistologie van BT474 hersenmetastasemodel. (A) Representatief hersengedeelte van een BT474 BM-muis; gekleurde vakken gemarkeerd vergrote gebieden van belang. Schaalbalk = 2 mm. (B) Vaste tumor bestaande uit een massa epithelioïde cellen. (C) Necrotische cellen in een ruimte. (D) Tumor-herseninterface (E) Kleine uitwassen bekend als micrometastasen. (B-E Schaalbalk = 200 μm). (F) Immunohistochemische beelden met HER2- en HER3-positiviteit en gematchte hematoxyline en eosine (H&E). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Systemische betrokkenheid
Er werden geen tumoren waargenomen in weefselsecties van andere organen (figuur 8). Deze bevinding komt overeen met de bioluminescente gegevens, waarbij bioluminescentie alleen werd gedetecteerd uit de hoofden van de dieren. Samen toonden de resultaten aan dat dit model geassocieerd is met geen detecteerbare systemische tumoren.
Figuur 8: Histologie van andere organen. Er was geen duidelijke tumorbetrokkenheid in de gescreende organen: bot, lever, nier, pancreas, long, hart, milt, darm en eierstok. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Canule-spuit voor injectie van de inwendige halsslagader. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Momentopnamen van het injectieproces van de inwendige halsslagader. De beschrijving van de afbeelding is opgenomen in aanvullende tabel 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: T2-gewogen MRI met een grote intramusculaire tumor in het rechter gezichtsweefsel (rood omlijnd). H &e-gekleurd weefsel sectie onthult dicht opeengepakte tumorcellen. Schaalbalk = 2 mm (midden) en 100 μm (rechts). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Stapsgewijze beschrijving van de injectie van de inwendige halsslagader in aanvullende figuur 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hersenmetastase is een complex proces van kankercellen die zich verspreiden van hun primaire plaats naar de hersenen. Er zijn verschillende diermodellen beschikbaar die bepaalde stadia van dit meerstappenproces weerspiegelen en er zijn fysiologische en praktische overwegingen voor het ontwerpen van preklinische metastasestudies41,42. De meeste gepubliceerde studies die het gebruik van nanogeneeskunde voor de behandeling van hersenmetastase onderzoeken, hebbenintracardiale 43,44- en intracraniale 45,46,47,48,49-modellen gebruikt. Het transplanteren van kankercellen via de halsslagader kan het metastatische proces en de pathobiologie van de hersenmetastase beter samenvatten.
Uit ervaring bleek echter dat de gebruikelijke carotisinjectietechniek ertoe leidde dat verschillende dieren zich op vroege tijdstippen presenteerden met significante gezichtstumoren. Bij dieren met zowel actieve hersen- als gezichtstumoren werden gezichtstumoren waargenomen die sneller in omvang groeiden dan de hersentumoren. Dit kan te wijten zijn aan de meer gevasculariseerde micro-omgeving die tumorgroei ondersteunt (aanvullende figuur 3).
De gemeenschappelijke halsslagader levert bloed aan het gezichtsgebied en de hersenen via respectievelijk de externe en halsslagaders. Vandaar dat, in overeenstemming met anderen25, het injecteren van kankercellen via de gemeenschappelijke halsslagader zou leiden tot zaaien in beide regio's. Het is mogelijk om gezichtstumoren te voorkomen door eerst de externe halsslagader te bruinen voorafgaand aan een gemeenschappelijke injectie van de halsslagader.
De hier beschreven interne halsslagaderinjectiemethode simuleert hersenmetastase door de kankercellen in het primaire bloedvat te brengen dat de hersenen levert. Dit model vat de verblijf van circulerende kankercellen in het vaatbed van de hersenen samen, waardoor hun transmigratie en vorming van gemetastaseerde hersenuitgroei mogelijk wordt. De resultaten tonen aan dat injectie van de halsslagader het zaaien van kanker beperkt tot andere organen die verband houden met methoden zoals de intracardiale injectie.
Er zijn enkele kritieke overwegingen en informatie over het oplossen van problemen voor het protocol. Ten eerste kunnen celklonters intracraniale bloedvaten afsluiten en een beroerte veroorzaken. Dit kan worden verzacht door de celsuspensie door een celzeef te laten gaan om een klompvrije celsuspensie te garanderen. Vervolgens kan het injecteren van overtollig vocht in de hersenen leiden tot inflammatoir oedeem en vasculaire lateralisatie belemmeren. Dit kan worden vermeden door gebruik te maken van een injectievolume van minder dan 100 μL. Het gebruik van een hechtdraad met gerafelde uiteinden en de aanwezigheid van fascia of fibrovetweefsel kan het lusen van de hechting rond de uitwendige halsslagader belemmeren. Het wordt aanbevolen om eerst fascia- of fibrofatty-weefsel te verwijderen door een zachte veegbeweging langs de slagader met de tang aan te brengen en rafeleinden te verwijderen door het uiteinde van de hechtdraad te snijden. Ten slotte hebben kankercellijnen unieke groeisnelheden en daarom is het essentieel om de celconcentratie voor injectie te optimaliseren. Uit ervaring, in long- en melanoom hersenmetastasemodellen waarbij de agressieve menselijke kankercellijnen NCI-H1975 en A2058 betrokken waren, werden minder cellen (1 x 105 cellen in 100 μL) geïnjecteerd om snelle ziekteprogressie te voorkomen.
De meest uitdagende stap in dit protocol is het inbrengen van naald in de halsslagader en injectie van cellen. Het wordt aanbevolen om per dier een nieuwe naald te gebruiken voor steriliteit, omdat het gebruik van stompe naalden het risico op het prikken of scheuren van bloedvaten verhoogt. Het wordt ook aanbevolen om een spuitdriver te gebruiken voor de procedure om de eerste spurt van injectaat en wankele naald tijdens injectie te verminderen. De spuitdriver heeft ook het extra voordeel om de injectiesnelheid af te stemmen op de fysiologische bloedstroomsnelheid.
Dit protocol is niet zonder beperkingen. De procedure is technisch veeleisend en er is het risico dat dieren bezwijken aan een beroerte door lateralisatiefalen ondanks het ondergaan van een succesvolle procedure. Uit onze ervaring is het percentage beroertes 11,4% (n = 21/168 dieren). Daarom moet de beginsteekproefgrootte rekening houden met deze dieren die zullen sterven aan een beroerte. Omdat deze methode kankercellen rechtstreeks naar de hersenen aflevert, heeft het de systemische tumorlast verminderd en is het dus niet ideaal voor het bestuderen van systemische verspreiding.
Samenvattend zal het protocol het mogelijk maken om een muismodel voor hersenmetastasen te genereren dat geschikt is voor het screenen van geneesmiddelen en het evalueren van het therapeutische profiel van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript, of bij de beslissing om het artikel te publiceren.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC), subsidienummer APP1162560. ML werd gefinancierd door een UQ postdoctorale onderzoeksbeurs. We willen iedereen bedanken die heeft geholpen met het houden van dieren en in vivo beeldvorming van de dieren. We bedanken het Royal Brisbane and Women's Hospital voor het doneren van aliquots zirkonium voor deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance needle | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
| Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
| Animal heat mat | |||
| Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Autoclave bags | |||
| BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
| Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
| Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| Dissection microscope | |||
| Ear puncher | |||
| Electric clippers | |||
| Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
| Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| Isoflurane | |||
| Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| Mashed mouse chow | |||
| Meloxicam (METACAM) | |||
| Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
| PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
| PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
| Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
| Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| Sticky tape | |||
| Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
| Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
| Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
| Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
| Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Thread | |||
| Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
| Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
- Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
- Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
- Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
- Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
- Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
- Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
- Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
- Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
- Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
- Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
- Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
- Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
- Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
- Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
- Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
- Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
- Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
- Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
- Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
- Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
- Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
- Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
- Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
- Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
- Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
- Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
- Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
- Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
- Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
- Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
- He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
- Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
- Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).
