Denne protokol beskriver vurderingen af mekanisk overfølsomhed i en rottemodel af neuropatisk orofacial smerte ved hjælp af en operantbaseret orofacial smertevurderingsenhed.
Smerter har sensoriske og affektive komponenter. I modsætning til traditionelle, refleksbaserede smerteassays kan operantsmerteassays producere mere klinisk relevante resultater ved at adressere de kognitive og motiverende aspekter af smerter hos gnavere. Dette papir præsenterer en protokol til vurdering af mekanisk overfølsomhed efter kronisk indsnævringsskade af infraorbitale nerver (CCI-ION) hos rotter ved hjælp af et orofacial operant smertesystem. Før CCI-ION-operationen blev rotter trænet i en orofacial pain assessment device (OPAD) til at drikke sødet kondenseret mælk, mens de fik ansigtskontakt med metalspidsede stænger og slikrør.
I dette assay kan rotter vælge mellem at modtage mælk som en positiv forstærker eller undslippe en aversiv mekanisk stimulus, der produceres af en lodret række af små pyramideformede pigge på hver side af belønningsadgangshullet. Efter 2 ugers træning i OPAD og før CCI-ION-operationen blev baseline mekaniske følsomhedsdata registreret i 5 dage for hver rotte under en 10 minutters testsession. Under en session registrerer det operante system automatisk antallet af belønningsflaskeaktiveringer (slik) og ansigtskontakter, kontaktvarighed og latenstid til det første slik, blandt andre foranstaltninger.
Efter baseline-målinger gennemgik rotter enten CCI-ION eller sham-kirurgi. I denne protokol blev mekanisk overfølsomhed kvantificeret ved at måle antallet af slik, latenstid til det første slik, antallet af kontakter og forholdet mellem slik og ansigtskontakter (L / F). Dataene viste, at CCI-ION resulterede i et signifikant fald i antallet af slik og L / F-forholdet og en stigning i latenstiden til det første slik, hvilket indikerer mekanisk overfølsomhed. Disse data understøtter brugen af operantbaserede smerteassays til at vurdere mekanisk smertefølsomhed i præklinisk smerteforskning.
Kroniske smerter påvirker millioner af amerikanere årligt1. Desværre er kroniske smerter udfordrende at behandle, da eksisterende terapier er relativt ineffektive til at afbøde kroniske smerter og ofte har uønskede bivirkninger ved langvarig brug 2,3,4. Traditionelle prækliniske smerteassays, såsom von Frey-analysen, er afhængige af refleksive resultater eller smertestimulerede reaktioner5. Mens von Frey-analysen er blevet brugt i årtier til at måle mekanisk allodyni, er den modtagelig for flere forvirrende faktorer, især eksperimentforstyrrelse6. Brugen af von Frey-test til evaluering af orofaciale smerter er også problematisk på grund af den grad af tilbageholdenhed, der er nødvendig for at sikre dyrets hoved for at kunne teste ansigtsområdet, hvilket kan give uønskede stresseffekter, såsom at øge smerten eller omvendt stressinduceret analgesi.
Smertestimuleret adfærd er også modtagelig for falsk-positive resultater7 og tager ikke højde for den affektive komponent af smerte, som er integreret i den menneskelige smerteoplevelse8. Derfor er der en stigende interesse for at bruge operant smertemodeller, der vurderer smerte-deprimeret adfærd, der omfatter både de sensoriske og affektive komponenter af smerte for at forbedre indholdet og prædiktiv validitet i præklinisk test. Det operative orofacial smertevurderingsassay, der er beskrevet her, er baseret på et belønningskonfliktparadigme 9,10,11. I dette assay kan gnaveren vælge mellem at modtage en positiv forstærker og udsætte sig for en nociceptiv stimulus eller give afkald på belønningen og undgå den nociceptive stimulus og derved kontrollere mængden af smerte, den oplever. I modsætning til traditionelle smerteassays er det operantbaserede assay eksperimentelt uafhængigt og er ikke modtageligt for falsk-positive resultater på grund af uheldige beroligende virkninger.
Skadelige fornemmelser fra hovedet og ansigtet bæres af de oftalmiske, maksillære og mandibulære grene af trigeminusnerven. Skade eller betændelse i trigeminusnerven øger følsomheden af sensoriske neuroner til termiske eller mekaniske stimuli12,13,14,15. Operantbaserede orofaciale smerteassays giver en automatiseret måling af termisk eller mekanisk orofacial smerte overført af trigeminusnerven hos gnavere 11,12,16,17,18. Stimulering med ikke-skadelige og skadelige stimuli er en vigtig skelnen mellem test af termisk og mekanisk allodyni og hyperalgesi i den orofaciale region med OPAD, da de kan repræsentere manifestationer af forskellige underliggende mekanismer.
I det orofaciale termiske assay presser dyr deres ansigt mod glatte termoder for at få adgang til belønningen. Termoderne kan indstilles til forskellige kølige, varme og varme temperaturer, hvilket muliggør vurdering af adfærd under neutrale eller nociceptive forhold. I det orofaciale mekaniske assay presser dyr deres ansigt mod spidsede stænger under operanttest; Da disse pigge forårsager en vis grad af ubehag, kan gnavere drikke mindre, når deres ansigter rører piggene versus termodernes glatte overflader. Således kan det operant orofaciale mekaniske assay vurdere effekten af varierende grader af mekanisk nociceptiv stimulering. Vi har tidligere vist, at OPAD er en nyttig og pålidelig metode til vurdering af akut termisk9 samt akut mekanisk19, nociception og hyperalgesi.
Dette papir rapporterer brugen af en nyudviklet version af OPAD til at vurdere mekanisk nociception og overfølsomhed. Derudover demonstrerer vi ved validering CCI-ION’s evne til at inducere kronisk neuropati, der resulterer i et forudsigeligt respons i OPAD. Også detaljeret er, hvordan man bruger OPAD og dets tilhørende software til hurtigt at indhente og analysere gnaveradfærdsdata.
Smerter udløst af uskadelig mekanisk stimulering af ansigtet og intraoral slimhinde er et fremtrædende træk ved orofaciale smertetilstande, herunder trigeminusneuralgi og temporomandibulære ledforstyrrelser24,25. Selvom trigeminal neuropatisk smerte er klinisk velbeskrevet, er vurderingen af neuropatisk nociceptiv adfærd hos gnavere udfordrende. Smerteassays, der måler refleksiv adfærd, er de hyppigst anvendte metoder i præklinisk smerteforskning. Imidlertid giver testapparatrelateret stress, manglende evne til at vurdere den affektive tilstand og eksperimentforstyrrelse bekymring over nytten og gyldigheden af refleksassays26.
Denne undersøgelse introducerer vurderingen af mekanisk følsomhed i det orofaciale område hos rotter, hvilket viser dets følsomhed over for CCI-ION ved hjælp af et operantbaseret smerteassay. Det samme operantsystem kan også bruges til at teste musens mekaniske følsomhed. Det skal bemærkes, at muse- og rottestammer kan udvise variation i deres respons på CCI-ION, og dermed kan niveauerne af mekanisk overfølsomhed variere. Baseret på vores erfaring udvikler Sprague-Dawley rotter typisk en stabil mekanisk overfølsomhed 2 uger efter CCI-ION, de begynder at komme sig 4 uger efter CCI-ION, og efter 6 uger med CCI-ION ser vi bedring efter operationen.
I denne protokol blev mekanisk overfølsomhed kvantificeret ved at måle antallet af slik og kontakterne, L / F og latenstid til det første slik. Dataene viste, at CCI-ION resulterede i fald i L / F og antallet af slikkeresponser og stigninger i latenstiden til det første slikrespons, hvilket indikerer, at dyr ikke var villige til at presse deres ansigter mod spidsede stænger på grund af øget orofacial smertefølsomhed.
OPAD er et belønningskonfliktassay, hvor dyr skal udholde nociceptive stimuli for at få adgang til en velsmagende belønning. Slikkeadfærd i analysen kan blive påvirket af appetitlig adfærd. Derudover brugte vi i denne undersøgelse rotter, der havde ansigtshår. Baseret på tidligere erfaring med operant smerte assays, blandt gnavere, hårløse stammer er bedre til at detektere ansigtskontakter16; På tidspunktet for offentliggørelsen var hårløse rottestammer imidlertid ikke længere kommercielt tilgængelige. Dette kan betragtes som en begrænsning af undersøgelsen. Da vi også kun brugte hunrotter fra Sprague-Dawley, bør der forventes køns- og stammerelaterede forskelle i smerterespons.
Der er også nogle kritiske trin for at sikre optimale resultater med analysen. Nøjagtige slik- og kontaktdata skal vises som solide røde og hvide blokke i henholdsvis den refererede software (se figur 3). Afstanden mellem piggene og mælkeflasken er afgørende for eksperimentets succes. Hvis spidsen af mælkeflasken er for langt frem, vil dyret ikke komme i kontakt med piggene, og softwaren registrerer ikke kontakter eller sliknumre korrekt. Omvendt, hvis mælkeflasken er for langt tilbage, registreres kontakter, men dyret vil ikke være i stand til at nå mælken. Under træningssessioner kan slikdata fremstå som solide hvide blokke, da spidsen af mælkeflasken er for langt fremme. Det skifter til røde faste blokke, når mælkeflasken skubbes baglæns. Af en eller anden grund, hvis slikdata begynder at fremstå som hvide blokke fra den afstand, der blev noteret, kan det hjælpe at skubbe flasken lidt og flytte mælkeholderen lidt nedad / opad.
Flere punkter kan også betragtes som begrænsninger i det orofaciale operantsmertesystem, der er beskrevet her. Uddannelsen af gnavere er nødvendig og tager uger. Før hver testsession er fødevarebegrænsning nødvendig hos mus, men ikke hos rotter. Unfasted mus har vist sig at have lave og inkonsekvente slikketal sammenlignet med fastende mus27. Da OPAD-systemet er en belønningskonfliktmodel, kan det blive påvirket af dyrenes appetitfulde adfærd eller af et lægemiddel, der påvirker appetitten. At have flere apparater er også fordelagtigt for at reducere den samlede tid til at teste dyrene, hvilket kan øge omkostningerne. Imidlertid er orofaciale operantsmerteassays stadig fordelagtige i forhold til konventionelle refleksbaserede assays, da de tillader test af flere dyr på samme tid og begrænser interaktion mellem dyr og eksperimenter.
Operant konditionering under smertetilstande ændrer menneskers og dyrs adfærd i henhold til deres konsekvenser28. Brug af en belønningskonfliktmodel er derfor fordelagtig til evaluering af smerteforhold, fordi det giver dyrene mulighed for at udføre operantresponser. Dette er mere klinisk relevant, fordi egenskaberne ved operant adfærd involverer hensigt, motivation og typisk kortikal behandling29. Når dyr frivilligt nærmer sig belønningsflasken og frit kan trække sig tilbage fra de spidsede stænger til enhver tid, integrerer dette højere centre i hjernen og giver mulighed for evaluering af de affektive motiverende tilstande relateret til smerte10. Således giver operant smerte assays overlegne data, når man vurderer smerte og analgetika in vivo. De hjælper også med at forstå de nociceptive processer i trigeminalsystemet og derved bidrage til udviklingen af det orofaciale smertefelt.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse er finansieret af Facial Pain Research Foundation.
ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
Dish sponge | ANY | ANY | |
GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
Oxygen tank | Medical | ||
Paper towel | ANY | ANY | |
Plastic food wrap | ANY | ANY | |
Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
Spoon | ANY | ANY | |
Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |