Summary
Denne protokol beskriver vurderingen af mekanisk overfølsomhed i en rottemodel af neuropatisk orofacial smerte ved hjælp af en operantbaseret orofacial smertevurderingsenhed.
Abstract
Smerter har sensoriske og affektive komponenter. I modsætning til traditionelle, refleksbaserede smerteassays kan operantsmerteassays producere mere klinisk relevante resultater ved at adressere de kognitive og motiverende aspekter af smerter hos gnavere. Dette papir præsenterer en protokol til vurdering af mekanisk overfølsomhed efter kronisk indsnævringsskade af infraorbitale nerver (CCI-ION) hos rotter ved hjælp af et orofacial operant smertesystem. Før CCI-ION-operationen blev rotter trænet i en orofacial pain assessment device (OPAD) til at drikke sødet kondenseret mælk, mens de fik ansigtskontakt med metalspidsede stænger og slikrør.
I dette assay kan rotter vælge mellem at modtage mælk som en positiv forstærker eller undslippe en aversiv mekanisk stimulus, der produceres af en lodret række af små pyramideformede pigge på hver side af belønningsadgangshullet. Efter 2 ugers træning i OPAD og før CCI-ION-operationen blev baseline mekaniske følsomhedsdata registreret i 5 dage for hver rotte under en 10 minutters testsession. Under en session registrerer det operante system automatisk antallet af belønningsflaskeaktiveringer (slik) og ansigtskontakter, kontaktvarighed og latenstid til det første slik, blandt andre foranstaltninger.
Efter baseline-målinger gennemgik rotter enten CCI-ION eller sham-kirurgi. I denne protokol blev mekanisk overfølsomhed kvantificeret ved at måle antallet af slik, latenstid til det første slik, antallet af kontakter og forholdet mellem slik og ansigtskontakter (L / F). Dataene viste, at CCI-ION resulterede i et signifikant fald i antallet af slik og L / F-forholdet og en stigning i latenstiden til det første slik, hvilket indikerer mekanisk overfølsomhed. Disse data understøtter brugen af operantbaserede smerteassays til at vurdere mekanisk smertefølsomhed i præklinisk smerteforskning.
Introduction
Kroniske smerter påvirker millioner af amerikanere årligt1. Desværre er kroniske smerter udfordrende at behandle, da eksisterende terapier er relativt ineffektive til at afbøde kroniske smerter og ofte har uønskede bivirkninger ved langvarig brug 2,3,4. Traditionelle prækliniske smerteassays, såsom von Frey-analysen, er afhængige af refleksive resultater eller smertestimulerede reaktioner5. Mens von Frey-analysen er blevet brugt i årtier til at måle mekanisk allodyni, er den modtagelig for flere forvirrende faktorer, især eksperimentforstyrrelse6. Brugen af von Frey-test til evaluering af orofaciale smerter er også problematisk på grund af den grad af tilbageholdenhed, der er nødvendig for at sikre dyrets hoved for at kunne teste ansigtsområdet, hvilket kan give uønskede stresseffekter, såsom at øge smerten eller omvendt stressinduceret analgesi.
Smertestimuleret adfærd er også modtagelig for falsk-positive resultater7 og tager ikke højde for den affektive komponent af smerte, som er integreret i den menneskelige smerteoplevelse8. Derfor er der en stigende interesse for at bruge operant smertemodeller, der vurderer smerte-deprimeret adfærd, der omfatter både de sensoriske og affektive komponenter af smerte for at forbedre indholdet og prædiktiv validitet i præklinisk test. Det operative orofacial smertevurderingsassay, der er beskrevet her, er baseret på et belønningskonfliktparadigme 9,10,11. I dette assay kan gnaveren vælge mellem at modtage en positiv forstærker og udsætte sig for en nociceptiv stimulus eller give afkald på belønningen og undgå den nociceptive stimulus og derved kontrollere mængden af smerte, den oplever. I modsætning til traditionelle smerteassays er det operantbaserede assay eksperimentelt uafhængigt og er ikke modtageligt for falsk-positive resultater på grund af uheldige beroligende virkninger.
Skadelige fornemmelser fra hovedet og ansigtet bæres af de oftalmiske, maksillære og mandibulære grene af trigeminusnerven. Skade eller betændelse i trigeminusnerven øger følsomheden af sensoriske neuroner til termiske eller mekaniske stimuli12,13,14,15. Operantbaserede orofaciale smerteassays giver en automatiseret måling af termisk eller mekanisk orofacial smerte overført af trigeminusnerven hos gnavere 11,12,16,17,18. Stimulering med ikke-skadelige og skadelige stimuli er en vigtig skelnen mellem test af termisk og mekanisk allodyni og hyperalgesi i den orofaciale region med OPAD, da de kan repræsentere manifestationer af forskellige underliggende mekanismer.
I det orofaciale termiske assay presser dyr deres ansigt mod glatte termoder for at få adgang til belønningen. Termoderne kan indstilles til forskellige kølige, varme og varme temperaturer, hvilket muliggør vurdering af adfærd under neutrale eller nociceptive forhold. I det orofaciale mekaniske assay presser dyr deres ansigt mod spidsede stænger under operanttest; Da disse pigge forårsager en vis grad af ubehag, kan gnavere drikke mindre, når deres ansigter rører piggene versus termodernes glatte overflader. Således kan det operant orofaciale mekaniske assay vurdere effekten af varierende grader af mekanisk nociceptiv stimulering. Vi har tidligere vist, at OPAD er en nyttig og pålidelig metode til vurdering af akut termisk9 samt akut mekanisk19, nociception og hyperalgesi.
Dette papir rapporterer brugen af en nyudviklet version af OPAD til at vurdere mekanisk nociception og overfølsomhed. Derudover demonstrerer vi ved validering CCI-ION's evne til at inducere kronisk neuropati, der resulterer i et forudsigeligt respons i OPAD. Også detaljeret er, hvordan man bruger OPAD og dets tilhørende software til hurtigt at indhente og analysere gnaveradfærdsdata.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee og overholdt de standarder, der er angivet i National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr. Her beskrives vurderingen af mekanisk overfølsomhed ved hjælp af OPAD ved hjælp af en rottemodel af neuropatisk orofacial smerte. Figur 1 viser et skema over den tidslinje, der er anvendt i undersøgelsen. Alle adfærdsmæssige vurderinger blev udført af kvindelige eksperimenter.
1. Dyr
- Hushunrotter i Sprague-Dawley (n = 8/gruppe, 150-200 g) parvis i et temperaturkontrolleret rum (22 °C ± 1 °C) med en 12 h:12 h lys-mørk cyklus. Sørg for mad og vand ad libitum. Hold rotterne i anlægget i 5 dage til akklimatisering før forsøgene.
- Udfør de operante smerteanalyser på samme ugedag og tidspunkt (kl. 9-11).
- Ved afslutningen af forsøgene aflives rotterne ved halshugning efter isofluranbedøvelse.
2. Opsætning af OPAD
- Placer mælkedrypbakker, plexiglasbure og metalgulvriste på OPAD. Fastgør ledninger til burene. Slip flaskeholderen på metalstangen bag på enheden.
- Forbered et 2:1 forhold mellem vand og sødet kondenseret mælk som belønningsopløsning ved at åbne en dåse sødet kondenseret mælk og hælde den i et 1 L bægerglas. Tilsæt ~ 600 ml ledningsvand til 300 ml mælk. Rør først opløsningen ved hjælp af en ske, og brug derefter en rørestang og kogepladeomrøreren. Fyld derefter belønningsflaskerne med mælkeopløsningen, og hold stammælksopløsningen ved 4 °C.
BEMÆRK: Dæk lagermælksopløsningen med plastfolie. Varm mælkeopløsningen før hver brug. Lagermælkopløsning i køleskabet kan koagulere efter en uge. Når det koagulerer, kan det okkludere slikrøret. Kassér det derfor og forbered en ny lageropløsning. - Placer belønningsmælkeflaskerne på flaskeholderen, og juster dem, så tuden kan nås af dyret. Spænd holderens venstre sideknap for at fastgøre flasken på plads.
- Tænd burene ved hjælp af kontakten på frontpanelet.
3. Opsætning af en protokol og oprettelse af en eksperimentfil
BEMÆRK: Først skal du konfigurere protokollen til at køre eksperimentet. Protokollen beskriver, hvordan ANY-labyrint-software udfører eksperimentet.
- Åbn softwaren. Indtast adgangskoden. Klik på Log mig på, eller tryk på Enter.
- Klik på Nyt tomt eksperiment | Menuen Protokol .
- Vælg den tilstand, denne protokol vil bruge, og navngiv protokollen. Klik på Unavngiven protokol under Apparatus, klik på afsnittet Vælg den tilstand, som denne protokol vil bruge, og vælg OPAD's mekaniske burtilstand under Udstyrsspecifikke tilstande, og klik på OK. Navngiv derefter protokollen (f.eks. OPAD-mekanisk).
- Tilføj OPAD-bure.
- Under Apparatur skal du klikke på Apparatur | Tilføj element, der findes øverst i protokolruden | Nyt OPAD-bur | Tilføj alle tilsluttede OPAD-bure.
BEMÆRK: Før du tilføjer burene, skal du sikre dig, at alle burene er tændt.
- Under Apparatur skal du klikke på Apparatur | Tilføj element, der findes øverst i protokolruden | Nyt OPAD-bur | Tilføj alle tilsluttede OPAD-bure.
- Tilføj eksperimenttestfaser.
- Under Test skal du klikke på Faser | Første fase og navn Stage (f.eks. Baseline Day 1). Skriv 10 minutter for testens varighed. Hvis du vil tilføje flere faser, skal du klikke på Tilføj element , der findes øverst i protokolruden | Ny fase.
BEMÆRK: Hvert trin refererer til sessionen, når der udføres et assay. For eksempel er der brug for 10 dages træning 10 faser. Testens varighed kan øges eller formindskes baseret på det eksperimentelle design.
- Under Test skal du klikke på Faser | Første fase og navn Stage (f.eks. Baseline Day 1). Skriv 10 minutter for testens varighed. Hvis du vil tilføje flere faser, skal du klikke på Tilføj element , der findes øverst i protokolruden | Ny fase.
- Tildel behandlingsgrupper.
- Under Yderligere oplysninger skal du klikke på Behandlingsgrupper. Tjek Brug behandlingsgrupper | Brugeren tildeler manuelt dyrene til deres grupper.
BEMÆRK: Den refererede software (se materialetabellen) gør det også muligt at tildele dyr tilfældigt eller i en bestemt rækkefølge. Eksperimenter kan køres blinde. For at se de tildelte behandlingsgrupper skal du fjerne markeringen af Kør eksperimenter blinde.
- Under Yderligere oplysninger skal du klikke på Behandlingsgrupper. Tjek Brug behandlingsgrupper | Brugeren tildeler manuelt dyrene til deres grupper.
- Tildel dyreidentifikationer (ID).
- Klik på menuen Protokol; Klik på Dyre-id under Yderligere oplysninger, og markér Brug mine id'er til at henvise til dyr.
- Klik på menuen Eksperiment .
- Skriv en eksperimenttitel.
- Navngiv behandlingerne ved at klikke på Vis behandlinger, og skriv behandlingsnavnene (f.eks. Behandling 1: CCI-ION, Behandling 2: fup).
- Tilføj dyr, og tildel behandlinger og dyre-id'er ved at klikke på Vis dyr | Tilføj dyr, angiv antallet af dyr, der skal testes, og klik på OK. Vent på, at listen over dyr vises, og tilføj dyre-id'er og behandlinger for hver rotte.
BEMÆRK: En statusliste , der vises ved siden af dyre-ID, indstilles til Normal i begyndelsen af undersøgelsen. Dyr kan senere fjernes fra testplanen ved at ændre deres status til enten Udgået eller Slettet.
- Gem protokollen ved at klikke på protokolmenuen | Gem protokol , der findes øverst i protokolruden . Skriv Filnavn og softwareadgangskoden (ANY-maze), og klik på Gem.
BEMÆRK: Gemte protokoller kan genbruges til nye eksperimenter. - Gem eksperimentfilen ved at klikke på Filer | Gem, skriv softwareadgangskoden, og klik på Gem.
4. Træning og baseline testsessioner
BEMÆRK: Medbring rotter til rummet mindst 15 minutter før testen, hvis adfærdstestrummet er på samme dyrestald. Hvis de transporteres til et testrum uden for dyreanlægget, skal du give rotterne 1 time til at akklimatisere sig til rummet.
- Før baseline-optagelser skal du træne rotterne i OPAD'erne i 2 uger (5 dage / uge, 10 min / dag) for at presse deres ansigter mod de metalspidsede stænger for at modtage mælkeopløsningen.
BEMÆRK: Et repræsentativt billede af piggede stænger og en rotte, der udfører analysen, er vist i figur 2. - Opsæt OPAD-udstyret.
- Tænd burene ved hjælp af kontakten på frontpanelet. Se efter grønt lys på buret, hvilket betyder, at buret er klar til test.
- Dobbeltklik på den gemte eksperimentfil for at åbne. Indtast adgangskoden. Klik på Log mig på, eller tryk på Enter.
- Vent på, at menuen Test vises. På venstre side af skærmen skal du notere antallet af dyr og det tilsvarende bur (f.eks. vil dyr 1 blive testet i bur 1), det stadium, der køres den dag, og teststatus ("klar"). På højre side af skærmen skal du observere diagrammet for hvert dyr, der viser antallet af slik og kontakter.
- Overhold skærmen på burene, der viser ID for det dyr, der skal testes. Placer hver rotte i det tilsvarende bur og tryk to gange på knappen på buret. Bemærk, at det grønne lys bliver til et orange lys, når testen starter, og der høres en advarselslyd, når testsessionen er slut.
- I de første 2 dages træning skal du placere mælkeflasker helt ind i buret for at give rotterne mulighed for at drikke mælk uden at kontakte stimulansen.
- På træningsdage 3-8, når dyrene begynder at drikke, skal du flytte flaskerne gradvist baglæns for at tilskynde rotterne til at presse deres ansigter mod de piggede stænger.
- På dag 9-10 af træning, når dyrene presser fuldt ud mod de spidsede stænger, og slikketallene er konsistente (mindst 500 slik i løbet af 10 minutters testsessioner), skal du notere placeringen af mælkeflasken for hvert dyr og bruge denne afstand til baseline-optagelser.
- Efter 2 ugers træning indsamles data fra den noterede mælkeflaskeafstand i 5 dage som basislinje (10 min/dag).
5. Induktion af orofaciale neuropatiske smerter og evaluering af mekanisk overfølsomhed
BEMÆRK: Efter baseline-målinger gennemgik rotter CCI-ION-kirurgi, som involverede bilateral ligering af ION, som tidligere beskrevet20. Kontrolrotter havde falsk kirurgi. Ingen præ- eller postoperativ analgesi blev brugt i proceduren, da det kan ændre neuropatiens tidsforløb. FORSIGTIG: Affaldsisofluran skal renses gennem kulbeholdere. Skalpelblade og nåle skal bortskaffes i biofarligt affald.
- Anæstetiser rotten i induktionskammeret med en blanding afO2 (1 L/min) og 4% isofluran og oprethold bedøvelsestilstanden med en specialiseret næsekegle i løbet af operationen.
- Placer den bedøvede rotte på et kirurgisk arbejdsbord og begræns den. Hold kropstemperaturen ved 37 °C ved hjælp af en varmepude. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at forhindre dem i at tørre ud. Kontroller bedøvelsesdybden ved at klemme tåen og start proceduren, når tåudtagningsrefleksen ikke længere observeres.
- Udfør den kirurgiske procedure under et stereomikroskop. Åbn munden ved hjælp af retraktorer og træk læben tilbage ved hjælp af et lille klip.
- Lav et lille snit mellem dorsalgummiet og læben ved hjælp af et skalpelblad (# 15). Skær forsigtigt blødt væv væk ved hjælp af spidsen af skalpelbladet for at afsløre en gren af ION.
- Placer to kromiske tarm (# 5-0) ligaturer omkring ION ved hjælp af en stump, bøjet sprøjtenål.
- Luk såret ved hjælp af vævslim.
- For den falske operation skal du udsætte ION ved hjælp af den samme procedure, men ikke ligate nerven.
- Efter operationen skal du give mælkeblødgjort gnaver chow i 2 dage for at tilskynde til at spise og forhindre dehydrering.
- Test rotterne i OPAD dagen efter operationen i 3 på hinanden følgende dage og derefter 3 dage / uge (f.eks. Hver tirsdag, torsdag og fredag) i de følgende uger, indtil sliktallene når deres baselineværdier.
BEMÆRK: Varigheden af den CCI-ION-inducerede mekaniske følsomhed kan afhænge af kønnet, stammen af den anvendte gnaver og eksperimentatorens ydeevne. Det er således muligvis ikke korrekt at angive en vis varighed for forsøgsdyr. Derfor er det mere præcist at teste, indtil sliktallene når baseline-værdierne.
6. Oprydning af enheden
- Når testen er færdig, skal du afslutte softwaren ved at klikke på x-ikonet i øverste højre hjørne og vente på, at dataene gemmes automatisk.
- Sluk for burene ved hjælp af kontakten på frontpanelet.
- Tag ledningerne ud af metalgulvristene. Fjern og vask mælkedrypbakker, plexiglasbure, metalgulvriste og flaskeholdere med opvaskemiddel. Læg alt på tørrestativet.
- Tør metalspidsede stænger, testenhed og laboratoriebænke af med 70% isopropylalkohol.
BEMÆRK: Instrumenterne skal håndteres med omhu. Brug bløde børster, mens du rengør mælkeflaskerne og slikkerørene. Beskidt udstyr kan føre til bakterieopbygning.
7. Analyse af data
- Dobbeltklik på eksperimentfilen for at åbne den.
- Klik på menuen Resultater . Vælg hvilke mål (dvs. slik, kontakt) eller testdage der skal ses.
- Klik på Tekst eller Graf eller Statistik , der findes øverst i panelet Resultater , for at se en tekst, graf eller statistisk analyserapport.
- For at se de rå data skal du klikke på menuen Data . Klik på Gem øverst i panelet Data for at gemme dataene som et regneark, eller klik på Send for at modtage dem via e-mail.
- Hvis du vil ændre eller tilføje flere variabler, der skal vises, skal du klikke på Vælg data, vælge målingerne og klikke på Vis regneark.
- Statistisk analyse
- Udled automatisk antallet af slik og kontakter og latenstiden til det første slik fra softwaren og eksporter dataene fra softwaren til et regneark.
- Beregn L / F-forholdet som et indeks for overfølsomhed ved at dividere antallet af slik med antallet af kontakter21,22,23.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev en af rotterne i skingruppen udelukket fra undersøgelsen på grund af lavt slikkeantal (<500 slik) før operationen. - Analyser den statistiske signifikans af forskellene mellem L/F, antallet af slik og kontakterne og latenstiden til det første slik via tovejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af Dunnetts flere sammenligninger eller Šídáks multiple sammenligningstest, hvor det er relevant.
BEMÆRK: P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Data blev præsenteret som middel ± standardfejl for middelværdien (SEM).
Representative Results
Et eksempel på en enkelt rottes slik på belønningsflasken og kontakter med metalspidsstængerne ved baseline og 2 uger, 4 uger og 6 uger efter operationen er vist i figur 3. I de ikke-skadelige perioder har rotter generelt lange drikkesessioner (f.eks. ved baseline og genopretning efter CCI-ION: uge 6 på billedet), og efter CCI-ION falder sliktallene, da de ikke kan opretholde ansigtskontakt med de piggede stænger i lang tid (figur 3A) uden signifikante ændringer i drikkeperioderne i skingruppen (figur 3B).
Rotter med CCI-ION havde et signifikant fald i antallet af slik indtil 4 uger efter operationen og en stigning i latenstiden til første slik på kirurgi uge (uge 0) og 1 uge efter operationen sammenlignet med baseline. Der var ingen signifikant ændring i fupgruppen (figur 4A, B). CCI-ION medførte et fald i antallet af kontakter, men denne forskel var ikke signifikant (figur 4C). CCI-ION forårsagede også et signifikant fald i L/F, og faldet for CCI-ION-gruppen var større end faldet for skingruppen (figur 4D).
Disse resultater indikerer, at rotter efter CCI-ION viser mindre belønning mælkedrikningsadfærd, og det tager dem et stykke tid at lave det første slik, hvilket indikerer en nocifensiv adfærd. CCI-ION påvirker dog ikke deres ønske om at nå mælken. Derudover indikerer faldet i L / F af rotter med CCI-ION mekanisk overfølsomhed, da L / F er højere under ikke-smertefulde tilstande.
Figur 1: Skematisk gengivelse af undersøgelsesdesignet. Forkortelser: OPAD = orofacial smertevurderingsenhed; CCI-ION = kronisk indsnævringsskade på de infraorbitale nerver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativt billede af piggede stænger og en rotte, der udfører analysen. Spiked stænger er lavet af rustfrit stål metal. Længden af hele stangen er 7 cm. Piggens højde er 0,3 cm. Afstanden mellem piggene er 0,5 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative kontaktforsøg og slikkedata for en enkelt CCI-ION- og sham-opereret rotte under standard 10 minutters testsession ved baseline og 2 uger, 4 uger og 6 uger efter operationen. Forkortelser: CCI-ION = kronisk indsnævringsskade af de infraorbitale nerver; AS = efter operationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Udvikling af mekanisk overfølsomhed efter CCI-ION hos Sprague-Dawley rotter. (A) Rotter med CCI-ION (n = 8) havde et signifikant fald i slikkeantal indtil 4 uger efter operationen og (B) en stigning i latenstid til første slik på kirurgi uge (uge 0) og 1 uge efter operationen (**p < 0,01, *p < 0,05: efter operation uger vs. baseline. #p < 0,05: CCI-ION vs. fup). Der var ikke noget signifikant fald i skingruppen (n = 7, p > 0,05). (C) CCI-ION eller skinkirurgi medførte ingen væsentlig ændring i antallet af kontakter. (D) Rotter med CCI-ION viste et signifikant fald i L / F på kirurgi uge og 3 uger efter og udviste en faldende tendens 2 uger efter operationen. Sammenlignet med skingruppen rotter var dette fald signifikant højere hos CCI-ION rotter og startede 1 uge efter operationen og fortsatte indtil 3 uger efter operationen. Der var ingen signifikant forskel i skingruppen (**p < 0,01, *p < 0,05: efter operationsuger vs. baseline. # p < 0,05: CCI-ION vs. sham). I graferne repræsenterer den røde linje CCI-ION-gruppen, og den blå linje repræsenterer skingruppen. ±Signifikante forskelle blev analyseret ved tovejs gentagne mål ANOVA efterfulgt af Šídáks eller Dunnetts multiple sammenligningstest, alt efter hvad der var relevant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Smerter udløst af uskadelig mekanisk stimulering af ansigtet og intraoral slimhinde er et fremtrædende træk ved orofaciale smertetilstande, herunder trigeminusneuralgi og temporomandibulære ledforstyrrelser24,25. Selvom trigeminal neuropatisk smerte er klinisk velbeskrevet, er vurderingen af neuropatisk nociceptiv adfærd hos gnavere udfordrende. Smerteassays, der måler refleksiv adfærd, er de hyppigst anvendte metoder i præklinisk smerteforskning. Imidlertid giver testapparatrelateret stress, manglende evne til at vurdere den affektive tilstand og eksperimentforstyrrelse bekymring over nytten og gyldigheden af refleksassays26.
Denne undersøgelse introducerer vurderingen af mekanisk følsomhed i det orofaciale område hos rotter, hvilket viser dets følsomhed over for CCI-ION ved hjælp af et operantbaseret smerteassay. Det samme operantsystem kan også bruges til at teste musens mekaniske følsomhed. Det skal bemærkes, at muse- og rottestammer kan udvise variation i deres respons på CCI-ION, og dermed kan niveauerne af mekanisk overfølsomhed variere. Baseret på vores erfaring udvikler Sprague-Dawley rotter typisk en stabil mekanisk overfølsomhed 2 uger efter CCI-ION, de begynder at komme sig 4 uger efter CCI-ION, og efter 6 uger med CCI-ION ser vi bedring efter operationen.
I denne protokol blev mekanisk overfølsomhed kvantificeret ved at måle antallet af slik og kontakterne, L / F og latenstid til det første slik. Dataene viste, at CCI-ION resulterede i fald i L / F og antallet af slikkeresponser og stigninger i latenstiden til det første slikrespons, hvilket indikerer, at dyr ikke var villige til at presse deres ansigter mod spidsede stænger på grund af øget orofacial smertefølsomhed.
OPAD er et belønningskonfliktassay, hvor dyr skal udholde nociceptive stimuli for at få adgang til en velsmagende belønning. Slikkeadfærd i analysen kan blive påvirket af appetitlig adfærd. Derudover brugte vi i denne undersøgelse rotter, der havde ansigtshår. Baseret på tidligere erfaring med operant smerte assays, blandt gnavere, hårløse stammer er bedre til at detektere ansigtskontakter16; På tidspunktet for offentliggørelsen var hårløse rottestammer imidlertid ikke længere kommercielt tilgængelige. Dette kan betragtes som en begrænsning af undersøgelsen. Da vi også kun brugte hunrotter fra Sprague-Dawley, bør der forventes køns- og stammerelaterede forskelle i smerterespons.
Der er også nogle kritiske trin for at sikre optimale resultater med analysen. Nøjagtige slik- og kontaktdata skal vises som solide røde og hvide blokke i henholdsvis den refererede software (se figur 3). Afstanden mellem piggene og mælkeflasken er afgørende for eksperimentets succes. Hvis spidsen af mælkeflasken er for langt frem, vil dyret ikke komme i kontakt med piggene, og softwaren registrerer ikke kontakter eller sliknumre korrekt. Omvendt, hvis mælkeflasken er for langt tilbage, registreres kontakter, men dyret vil ikke være i stand til at nå mælken. Under træningssessioner kan slikdata fremstå som solide hvide blokke, da spidsen af mælkeflasken er for langt fremme. Det skifter til røde faste blokke, når mælkeflasken skubbes baglæns. Af en eller anden grund, hvis slikdata begynder at fremstå som hvide blokke fra den afstand, der blev noteret, kan det hjælpe at skubbe flasken lidt og flytte mælkeholderen lidt nedad / opad.
Flere punkter kan også betragtes som begrænsninger i det orofaciale operantsmertesystem, der er beskrevet her. Uddannelsen af gnavere er nødvendig og tager uger. Før hver testsession er fødevarebegrænsning nødvendig hos mus, men ikke hos rotter. Unfasted mus har vist sig at have lave og inkonsekvente slikketal sammenlignet med fastende mus27. Da OPAD-systemet er en belønningskonfliktmodel, kan det blive påvirket af dyrenes appetitfulde adfærd eller af et lægemiddel, der påvirker appetitten. At have flere apparater er også fordelagtigt for at reducere den samlede tid til at teste dyrene, hvilket kan øge omkostningerne. Imidlertid er orofaciale operantsmerteassays stadig fordelagtige i forhold til konventionelle refleksbaserede assays, da de tillader test af flere dyr på samme tid og begrænser interaktion mellem dyr og eksperimenter.
Operant konditionering under smertetilstande ændrer menneskers og dyrs adfærd i henhold til deres konsekvenser28. Brug af en belønningskonfliktmodel er derfor fordelagtig til evaluering af smerteforhold, fordi det giver dyrene mulighed for at udføre operantresponser. Dette er mere klinisk relevant, fordi egenskaberne ved operant adfærd involverer hensigt, motivation og typisk kortikal behandling29. Når dyr frivilligt nærmer sig belønningsflasken og frit kan trække sig tilbage fra de spidsede stænger til enhver tid, integrerer dette højere centre i hjernen og giver mulighed for evaluering af de affektive motiverende tilstande relateret til smerte10. Således giver operant smerte assays overlegne data, når man vurderer smerte og analgetika in vivo. De hjælper også med at forstå de nociceptive processer i trigeminalsystemet og derved bidrage til udviklingen af det orofaciale smertefelt.
Disclosures
John K. Neubert og Robert M. Caudle er opfinderne af OPAD. Stoelting Co. er producent af OPAD, og Richard Mills er ansat hos Stoelting. Publikationsgebyret er blevet betalt af Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert og Robert M. Caudle er tidligere ejere af Velocity Laboratories, et firma, der leverer gebyr-for-service adfærdstest ved hjælp af operant smerte assays.
Acknowledgments
Denne undersøgelse er finansieret af Facial Pain Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
