Summary
该协议描述了使用基于操作者的口面部疼痛评估装置在神经性口面部疼痛大鼠模型中评估机械超敏反应。
Abstract
疼痛有感觉和情感成分。与传统的基于反射的疼痛测定不同，操作性疼痛测定可以通过解决啮齿动物疼痛的认知和动机方面来产生更具临床相关性的结果。本文提出了一种使用口面部操作性疼痛系统评估大鼠眶下神经慢性收缩损伤（CCI-ION）后机械超敏反应的方案。在CCI-ION手术之前，在口面部疼痛评估装置（OPAD）中训练大鼠饮用加糖炼乳，同时与金属尖刺棒和舔管进行面部接触。
在该测定中，大鼠可以选择接受牛奶作为正强化剂或逃避由奖励通路孔两侧的垂直一排小金字塔形尖刺产生的厌恶性机械刺激。在OPAD中训练2周后和CCI-ION手术之前，在10分钟的测试过程中记录每只大鼠5天的基线机械敏感性数据。在会话期间，操作系统会自动记录奖励瓶激活（舔）和面部接触的次数、接触持续时间和第一次舔舐的延迟等。
基线测量后，大鼠接受CCI-ION或假手术。在该协议中，通过测量舔次数，第一次舔的潜伏期，接触次数以及舔与面部接触的比率（L / F）来量化机械超敏反应。数据显示，CCI-ION导致舔次数和L/F比显著减少，并增加到第一次舔的潜伏期，表明机械超敏反应。这些数据支持在临床前疼痛研究中使用基于操作的疼痛测定来评估机械疼痛敏感性。
Introduction
慢性疼痛每年影响数百万美国人1。不幸的是，慢性疼痛很难治疗，因为现有的疗法在减轻慢性疼痛方面相对无效，并且长期使用往往会产生不希望的副作用2，3，4。传统的临床前疼痛测定，如冯弗雷测定，依赖于反射性结果或疼痛刺激反应5。虽然冯弗雷测定法几十年来一直用于测量机械异常性疼痛，但它容易受到几个混杂因素的影响，特别是实验者偏差6。使用von Frey测试来评估口面部疼痛也是有问题的，因为需要一定程度的约束来固定动物的头部以成功测试面部区域，这可能会产生不希望的压力效应，例如增强疼痛或相反，压力诱导的镇痛。
疼痛刺激的行为也容易受到假阳性结果的影响7，并且不考虑疼痛的情感成分，这是人类疼痛体验不可或缺的一部分8。因此，人们越来越有兴趣使用操作性疼痛模型来评估包括疼痛的感觉和情感成分的疼痛抑郁行为，以提高临床前测试的内容和预测有效性。此处描述的操作性口面部疼痛评估测定基于奖励冲突范式9，10，11。在该测定中，啮齿动物可以选择接受积极的强化剂并让自己受到伤害性刺激，或者放弃奖励并避免伤害性刺激，从而控制其经历的疼痛量。与传统的疼痛测定不同，基于操作物的测定独立于实验者，并且由于不良的镇静作用，不容易受到假阳性结果的影响。
来自头部和面部的有害感觉由三叉神经的眼支、上颌支和下颌支携带。三叉神经的损伤或炎症会增加感觉神经元对热或机械刺激的敏感性12，13，14，15。基于操作性的口面部疼痛测定可自动测量啮齿动物11，12，16，17，18 中三叉神经传递的热或机械口面部疼痛。使用非有害和有害刺激进行刺激是使用 OPAD 检测口面部热和机械异常性疼痛和痛觉过敏的重要区别，因为它们可能代表不同潜在机制的表现。
在口面部热测定中，动物将脸按在光滑的热像上以获得奖励。可以将温度计设置为各种冷、热和热温度，从而允许评估中性或伤害性条件下的行为。在口面部机械测定中，动物在操作测试期间将脸压在带刺的棒上;由于这些尖峰会引起一定程度的不适，因此当啮齿动物的脸接触尖峰而不是热敷物的光滑表面时，它们可能会喝得更少。因此，操作性口面部机械测定可以评估不同程度的机械伤害性刺激的效果。我们之前已经证明OPAD是评估急性热9以及急性机械19，伤害感受和痛觉过敏的有用且可靠的方法。
本文报告了使用新开发的OPAD版本来评估机械伤害感受和超敏反应。此外，通过验证，我们证明了CCI-ION诱导慢性神经病变的能力，从而在OPAD中产生可预测的反应。还详细介绍了如何使用OPAD及其相关软件快速获取和分析啮齿动物行为数据。
Protocol
所有实验程序均由佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中规定的标准。在这里，使用OPAD评估机械超敏反应是使用神经性口面部疼痛的大鼠模型描述的。研究中使用的时间线示意图如图 1所示。所有行为评估均由女性实验者进行。
1. 动物
- 在温控室（22°C ± 1°C）中成对地将雌性Sprague-Dawley大鼠（n = 8 /组，150-200g）成对地进行12小时：12小时的明暗循环。 随意提供食物和水。在实验前将大鼠留在设施中5天以进行适应。
- 在一周的同一天和时间（上午9点至上午11点）进行操作性疼痛测定。
- 在实验结束时，在异氟烷麻醉后通过斩首对大鼠实施安乐死。
2. 设置操作程序
- 将滴漏牛奶托盘、Plexiglas笼和金属地板炉排放在 OPAD 上。将电线连接到笼子上。将瓶架滑到设备背面的金属杆上。
- 打开一罐加糖炼乳并将其倒入 1 L 烧杯中，准备 2：1 比例的水与加糖炼乳作为奖励溶液。将 ~600 mL 自来水加入 300 mL 牛奶中。最初用勺子搅拌溶液，然后使用搅拌棒和热板搅拌器。然后，用牛奶溶液填充奖励瓶，并将牛奶溶液保持在4°C。
注意：用塑料食品包装覆盖牛奶溶液。每次使用前加热牛奶溶液。冰箱中的牛奶溶液可以在一周后凝结。当它凝固时，它可能会阻塞舔管。因此，丢弃它并准备新的储备溶液。 - 将奖励奶瓶放在瓶架上并调整它们，以便动物可以接触到喷嘴。拧紧支架的左侧旋钮，将瓶子固定到位。
- 使用前面板上的开关打开固定架。
3. 设置实验方案和创建实验文件
注意：首先，设置协议以运行实验。该协议描述了ANY-maze软件如何执行实验。
- 打开软件。键入密码。单击“ 登录我 ”或按 回车键。
- 点击 新建空实验|协议 菜单。
- 选择此协议将使用的模式并命名该协议。在“设备”下，单击“未命名协议”，单击“选择此协议将使用的模式”部分，然后在“设备特定模式”下，选择“OPAD 机械笼模式”，然后单击“确定”。然后，将协议命名为机械协议（例如，OPAD 机械）。
- 添加OPAD笼子。
- 在“设备”下，单击“设备|添加在“协议”窗格顶部找到的项目|新型OPAD笼|添加所有连接的 OPAD 笼子。
注意：在添加保持架之前，请确保所有保持架都已打开。
- 在“设备”下，单击“设备|添加在“协议”窗格顶部找到的项目|新型OPAD笼|添加所有连接的 OPAD 笼子。
- 添加实验测试阶段。
- 在“测试”下，单击“阶段|第一阶段和名称阶段（例如，基线第 1 天）。键入 10 分钟作为测试持续时间。要添加更多阶段，请单击协议窗格顶部的添加项目|新舞台。
注意：每个阶段是指执行测定的会话。例如，对于 10 天的培训，需要 10 个阶段。测试持续时间可以根据实验设计增加或减少。
- 在“测试”下，单击“阶段|第一阶段和名称阶段（例如，基线第 1 天）。键入 10 分钟作为测试持续时间。要添加更多阶段，请单击协议窗格顶部的添加项目|新舞台。
- 分配治疗组。
- 在 “其他信息”下，单击 “处理组”。选中 使用治疗组|用户将手动将动物分配到他们的组。
注意：参考的软件（见 材料表）还允许随机或按特定顺序分配动物。实验可以盲目进行。要查看分配的治疗组，请取消选中 盲运行实验。
- 在 “其他信息”下，单击 “处理组”。选中 使用治疗组|用户将手动将动物分配到他们的组。
- 分配动物标识 （ID）。
- 单击 协议 菜单;在“ 其他信息”下，单击“ 动物 ID ”，然后选中 “使用我的 ID 来指代动物”。
- 点击 实验 菜单。
- 键入实验标题。
- 通过单击查看治疗来命名治疗，然后键入治疗名称（例如， 治疗 1：CCI-ION，治疗 2：假治疗）。
- 添加动物并通过点击查看动物|来分配治疗和 动物 ID添加动物，输入要测试的动物数量 ，然后单击确定。等待动物列表出现，并为每只大鼠添加动物ID和治疗方法。
注意：在研究开始时，动物ID旁边显示 的状态列表 将设置为 正常 。稍后可以通过将动物的状态更改为“ 已停用 ”或 “已删除”来将其从测试计划中删除。
- 通过单击协议菜单保存 协议 | 保存 协议位于“ 协议 ”窗格顶部。键入 文件名 和软件（ANY-迷宫）密码，然后单击 保存。
注意：保存的方案可以重新用于新实验。 - 通过单击“文件|”保存实验 文件保存，键入软件密码，然后单击 保存。
4. 培训和基线测试课程
注意：如果行为测试室位于同一动物饲养设施中，则在测试前至少 15 分钟将大鼠带到房间。如果将它们运送到动物设施外的测试室，给大鼠1小时以适应房间。
- 在基线记录之前，训练OPAD中的大鼠2周（5天/周，10分钟/天），将它们的脸压在金属尖刺棒上以接受牛奶溶液。
注意：加标棒和执行测定的大鼠的代表性图像如图 2所示。 - 设置 OPAD 设备。
- 使用前面板上的开关打开固定架。寻找笼子上的绿灯，这意味着笼子已准备好进行测试。
- 双击保存的实验文件以打开。键入密码。单击“ 登录我 ”或按 回车键。
- 等待 “测试 ”菜单出现。在屏幕左侧，记下动物的数量和相应的笼子（例如，动物 1 将在笼子 1 中进行测试）、当天将运行的阶段以及测试状态（“就绪”）。在屏幕的右侧，观察每只动物的图表，其中显示了舔舐和接触的数量。
- 观察显示待测动物ID的笼子屏幕。将每只老鼠放入相应的笼子中，然后按两次笼子上的按钮。请注意，测试开始后，绿灯将变为橙色指示灯，测试会话结束时将听到警告声。
- 在训练的前两天，将牛奶瓶完全放入笼子中，让大鼠在不接触刺激物的情况下喝牛奶。
- 在训练的第3-8天，一旦动物开始喝水，将瓶子逐渐向后移动，以鼓励老鼠将脸压在带刺的棒上。
- 在训练的第9-10天，一旦动物完全压在带刺的棒上并且舔舐次数一致（在10分钟的测试过程中至少舔500次），记下每只动物的奶瓶位置，并使用此距离进行基线记录。
- 训练 2 周后，从记录的牛奶瓶距离收集 5 天的数据作为基线（10 分钟/天）。
5.口面部神经性疼痛的诱导和机械超敏反应的评估
注意：基线测量后，大鼠接受了CCI-ION手术，该手术涉及离子的双侧结扎，如前所述20。对照大鼠进行了假手术。手术中没有使用术前或术后镇痛，因为它可以改变神经病变的时间进程。注意：废物异氟烷必须通过木炭罐清除。手术刀刀片和针头必须丢弃在生物危害废物中。
- 用O2 （1L / min）和4%异氟醚的混合物在诱导室中麻醉大鼠，并在手术期间用专门的鼻锥维持麻醉状态。
- 将麻醉的大鼠放在手术工作台上并约束它。使用加热垫将体温保持在37°C。在眼睛上涂抹眼药膏，以防止它们变干。通过捏住脚趾检查麻醉深度，并在不再观察到脚趾撤回反射时开始手术。
- 在体视显微镜下进行外科手术。使用牵开器打开嘴巴，然后用小夹子收回嘴唇。
- 使用手术刀刀片在牙龈背侧和嘴唇之间做一个小切口（#15）。使用手术刀刀片的尖端轻轻切开软组织，露出离子的分支。
- 使用钝的弯曲注射器针头在离子周围放置两个铬肠 （#5-0） 结扎。
- 使用纸巾粘合剂闭合伤口。
- 对于假手术，使用相同的程序暴露离子，但不要结扎神经。
- 手术后，提供牛奶软化的啮齿动物食物2天，以鼓励进食并防止脱水。
- 手术后第二天在OPAD中测试大鼠连续3天，然后每周3天（例如，每周二，周四和周五）在接下来的几周内测试，直到舔数量达到其基线值。
注意：CCI-ION诱导的机械敏感性的持续时间可能取决于性别，所用啮齿动物的应变以及实验者的表现。因此，指出测试动物的一定持续时间可能不准确。因此，直到舔数量达到基线值进行测试更准确。
6. 清理设备
- 测试完成后，单击右上角的 x 图标退出软件，然后等待数据自动保存。
- 使用前面板上的开关关闭固定架。
- 从金属地板格栅上拔下电线。取出并清洗滴牛奶托盘、Plexiglas笼、金属地板格栅和用洗洁精的瓶架。把所有东西都放在晾衣架上。
- 使用 70% 异丙醇擦拭金属加标棒、测试设备和实验室工作台。
注意：仪器需要小心处理。清洁牛奶瓶和舔管时使用软刷。肮脏的设备会导致细菌积聚。
7. 数据分析
- 双击实验文件将其打开。
- 单击 结果 菜单。选择要查看的度量（即舔、接触）或测试天数。
- 单击“结果”面板顶部的“文本”、“图形”或“统计”以查看文本、图形或统计分析报告。
- 要查看原始数据，请单击“ 数据 ”菜单。单击“数据”面板顶部的 “保存 ”将数据另存为电子表格，或单击 “发送 ”通过电子邮件接收数据。
- 要更改或添加更多变量以查看，请单击选择 数据，选择度量，然后单击 查看电子表格。
- 统计分析
- 自动从软件中获取舔和接触的数量以及第一次舔的延迟，并将数据从软件导出到电子表格。
- 通过将舔次数除以接触次数21，22，23，计算 L/F 比率作为超敏反应指数。
注意：在这项研究中，假手术组中的一只大鼠由于手术前舔舐次数少（<500次舔）而被排除在研究之外。 - 通过双向重复测量方差分析分析L/F、舔次数和接触点之间差异的统计意义，以及第一次舔舔的潜伏期，然后在适当的情况下进行邓内特多重比较或Šídák多重比较检验。
注：P < 0.05被认为具有统计学意义。数据以平均值±平均值的标准误差（SEM）表示。
Representative Results
图3显示了一只大鼠在奖励瓶上的舔舐以及基线和手术后2周，4周和6周与金属尖刺棒接触的示例。在非有害期间，大鼠通常长时间饮酒（例如，在基线和CCI-ION后的恢复：图像中的第6周），并且在CCI-ION之后，舔次数减少，因为它们无法长时间与尖刺棒保持面部接触（图3A），假手术组的饮酒期没有显着变化（图3B）。
与基线相比，CCI-ION大鼠在手术后4周前的舔次数显着减少，并且在手术周（第0周）和手术后1周首次舔舔的潜伏期增加。假手术组没有显著变化（图4A，B）。CCI-ION使触点数量减少，但这种差异并不显着（图4C）。CCI-ION也导致L/F显著降低，CCI-ION组的下降幅度大于假组的下降（图4D）。
这些结果表明，在CCI-ION之后，大鼠表现出较少的奖励喝牛奶行为，并且它们需要一段时间才能进行第一次舔舐，表明一种伤害行为。但是，CCI-ION 不会影响他们获得牛奶的愿望。此外，CCI-ION大鼠L/F的降低表明机械超敏反应，因为在非疼痛条件下L/F较高。
图1：研究设计的示意图。 缩写：OPAD = 口面部疼痛评估设备;CCI-ION = 眶下神经的慢性收缩性损伤。 请点击此处查看此图的大图。
图2：加标棒和执行测定的大鼠的代表性图像。 尖刺棒由不锈钢金属制成。整个酒吧的长度为7厘米。尖刺的高度为0.3厘米。尖刺之间的距离为0.5厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：在基线标准 10 分钟测试期间以及手术后 2 周、4 周和 6 周期间，单个 CCI-ION 和假手术大鼠的代表性接触尝试和舔数据。 缩写：CCI-ION = 眶下神经的慢性收缩性损伤;AS = 手术后。 请点击此处查看此图的大图。
图4：Sprague-Dawley大鼠CCI-ION后机械超敏反应的发展 。 （A）具有CCI-ION的大鼠（n = 8）在手术后4周之前舔舐数量显着减少，并且（B）手术周（第0周）和手术后1周首次舔舐的潜伏期增加（**p < 0.01，*p < 0.05：手术后周数与基线。 #p < 0.05： CCI-ION 与假）。假手术组无显著下降（n = 7，p > 0.05）。（C）CCI-ION或假手术未对接触人数产生任何显着变化。（D）CCI-ION大鼠术后一周和术后3周L/F明显降低，术后2周呈下降趋势。与假鼠组大鼠相比，CCI-ION大鼠的这种减少显着更高，并且在手术后1周开始，并持续到手术后3周。假手术组没有显著差异（**p < 0.01，*p < 0.05：手术后几周与基线。 # p < 0.05：CCI-ION 与假手术）。在图表中，红线代表CCI-ION组，蓝线代表假组。数据以平均± SEM 表示。 通过双向重复测量方差分析分析显著差异，然后酌情分析Šídák或Dunnett的多重比较检验。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
由面部和口内粘膜的无害机械刺激引发的疼痛是口面部疼痛状况的突出特征，包括三叉神经痛和颞下颌关节疾病24，25。尽管三叉神经性疼痛在临床上得到了很好的描述，但对啮齿动物神经性伤害性行为的评估具有挑战性。测量反射行为的疼痛测定是临床前疼痛研究中最常用的方法。然而，测试与器械相关的压力、无法评估情感状态和实验者偏见引起了对反射测定的有效性和有效性的担忧26。
本研究介绍了大鼠口面部区域机械敏感性的评估，使用基于操作的疼痛测定证明了其对CCI-ION的敏感性。相同的操作系统也可用于测试小鼠的机械灵敏度。应该注意的是，小鼠和大鼠品系对CCI-ION的反应可能表现出变化，因此，机械超敏反应的水平可以不同。根据我们的经验，Sprague-Dawley大鼠通常在CCI-ION后2周出现稳定的机械超敏反应，它们在CCI-ION后4周开始恢复，并且在CCI-ION6周后，我们看到手术恢复。
在该协议中，通过测量舔舐次数和接触次数，L / F和第一次舔的潜伏期来量化机械超敏反应。数据显示，CCI-ION导致L/F和舔舐反应数量减少，并增加第一次舔舐反应的潜伏期，表明由于口面部疼痛敏感性增加，动物不愿意将脸压在尖刺棒上。
OPAD是一种奖励冲突测定，其中动物必须忍受伤害性刺激才能获得可口的奖励。测定中的舔行为可能会受到食欲行为的影响。此外，在这项研究中，我们使用了有面部毛发的大鼠。根据先前的操作性疼痛测定经验，在啮齿动物中，无毛菌株更适合检测面部接触16;然而，在发表时，无毛大鼠品系不再商业化。这可以被认为是研究的局限性。由于我们也只使用雌性Sprague-Dawley大鼠，因此应该预料到疼痛反应的性别和应变相关差异。
还有一些关键步骤可以确保测定的最佳结果。准确的舔舐和接触数据必须分别在参考软件中显示为红色和白色实心块（见 图3）。尖峰和奶瓶之间的距离对于实验的成功至关重要。如果牛奶瓶的尖端太靠前，动物将无法与尖刺接触，并且软件将无法正确记录接触或舔号码。相反，如果牛奶瓶太靠后，联系人会记录，但动物将无法接触到牛奶。在训练期间，舔数据可能显示为纯白色块，因为牛奶瓶的尖端太靠前。一旦牛奶瓶向后推，它就会变成红色的实心块。出于某种原因，如果舔数据开始显示为所记录距离的白色块，稍微推动瓶子并将牛奶架稍微向下/向上移动可能会有所帮助。
有几点也可以被认为是这里描述的口面部操作性疼痛系统的局限性。啮齿动物的训练是必要的，需要数周时间。在每次测试之前，小鼠需要限制食物，但大鼠不需要。与禁食小鼠相比，未禁食的小鼠已被证明具有低且不一致的舔数量27.由于OPAD系统是一种奖励冲突模型，因此它可能受到动物的食欲行为或影响食欲的药物的影响。拥有多个设备也有利于减少测试动物的总时间，这可能会增加成本。然而，口面部操作性疼痛测定仍然比传统的基于反射的测定更具优势，因为它们允许同时测试多种动物并限制动物与实验者的互动。
疼痛状态下的操作性条件反射根据其后果改变人类和动物的行为28.因此，使用奖励冲突模型对于评估疼痛状况是有利的，因为它允许动物执行操作性反应。这在临床上更具相关性，因为操作行为的特征涉及意图，动机和典型的皮质处理29。当动物自愿接近奖励瓶并可以随时自由退出带刺的条时，这整合了大脑的更高中心，并允许评估与疼痛相关的情感动机状态10。因此，操作性疼痛测定在评估 体内疼痛和镇痛药时提供了更好的数据。它们还有助于了解三叉神经系统中的伤害感受过程，从而有助于口面部疼痛领域的发展。
Disclosures
John K. Neubert和Robert M. Caudle是OPAD的发明者。Stoelting Co.是OPAD的制造商，Richard Mills是Stoelting的员工。出版费由Stoelting Co.支付。 Richard Mills，John K. Neubert和Robert M. Caudle是Velocity Laboratories的前所有者，该公司使用操作性疼痛测定提供收费服务行为测试。
Acknowledgments
这项研究由面部疼痛研究基金会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
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