Summary
Bu protokol, operant tabanlı bir orofasiyal ağrı değerlendirme cihazı kullanılarak nöropatik orofasiyal ağrının bir sıçan modelinde mekanik aşırı duyarlılığın değerlendirilmesini açıklar.
Abstract
Ağrının duyusal ve duygusal bileşenleri vardır. Geleneksel, refleks tabanlı ağrı tahlillerinin aksine, operant ağrı tahlilleri, kemirgenlerde ağrının bilişsel ve motivasyonel yönlerini ele alarak klinik olarak daha alakalı sonuçlar üretebilir. Bu yazıda, orofasiyal operant ağrı sistemi kullanan sıçanlarda infraorbital sinirlerin (CCI-ION) kronik daralma hasarını takiben mekanik aşırı duyarlılığın değerlendirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. CCI-ION ameliyatından önce, sıçanlar, metal çivili çubuklar ve yalama tüpü ile yüz teması kurarken tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt içmek için bir orofasiyal ağrı değerlendirme cihazında (OPAD) eğitildi.
Bu tahlilde, sıçanlar pozitif bir güçlendirici olarak süt almak veya ödül erişim deliğinin her iki tarafındaki küçük piramit şeklindeki sivri uçların dikey bir sırası tarafından üretilen engelleyici bir mekanik uyarandan kaçmak arasında seçim yapabilirler. OPAD'da 2 haftalık eğitimin ardından ve CCI-ION ameliyatından önce, 10 dakikalık bir test oturumu sırasında her sıçan için 5 gün boyunca temel mekanik duyarlılık verileri kaydedildi. Bir oturum sırasında, çalışma sistemi, diğer önlemlerin yanı sıra, ödül şişesi aktivasyonlarının (yalamaların) ve yüz temaslarının, temas süresinin ve gecikmenin ilk yalamanın sayısını otomatik olarak kaydeder.
Temel ölçümleri takiben, sıçanlara CCI-ION veya sahte cerrahi uygulandı. Bu protokolde, mekanik aşırı duyarlılık, yalama sayısını, ilk yalamaya gecikmeyi, temas sayısını ve yalamaların yüz temaslarına oranını (L / F) ölçerek ölçülmüştür. Veriler, CCI-ION'un yalama sayısında ve L / F oranında önemli bir azalmaya ve mekanik aşırı duyarlılığı gösteren ilk yalamaya gecikme süresinde bir artışa neden olduğunu göstermiştir. Bu veriler, klinik öncesi ağrı araştırmalarında mekanik ağrı duyarlılığını değerlendirmek için operant bazlı ağrı tahlillerinin kullanımını desteklemektedir.
Introduction
Kronik ağrı her yıl milyonlarca Amerikalıyı etkilemektedir1. Ne yazık ki, mevcut tedaviler kronik ağrıyı hafifletmede nispeten etkisiz olduğundan ve genellikle uzun süreli kullanımda istenmeyen yan etkilere sahip olduğundan kronik ağrının tedavisi zordur 2,3,4. Von Frey testi gibi geleneksel klinik öncesi ağrı tahlilleri, refleksif sonuçlara veya ağrı ile uyarılmış yanıtlara dayanır5. Von Frey testi, mekanik allodiniyi ölçmek için onlarca yıldır kullanılmış olsa da, özellikle deneyci önyargısı6 olmak üzere çeşitli kafa karıştırıcı faktörlere karşı hassastır. Orofasiyal ağrıyı değerlendirmek için von Frey testinin kullanılması, hayvanın başını yüz bölgesini başarılı bir şekilde test etmek için sabitlemek için gereken kısıtlama derecesi nedeniyle de sorunludur; bu, ağrıyı arttırmak veya tersine strese bağlı analjezi gibi istenmeyen stres etkileri üretebilir.
Ağrı uyarıcı davranışlar aynı zamanda yanlış pozitif sonuçlara karşı da hassastır7 ve insan acı deneyiminin ayrılmaz bir parçası olan ağrının duygusal bileşenini hesaba katmaz8. Bu nedenle, preklinik testlerde içeriği ve öngörücü geçerliliği iyileştirmek için ağrının hem duyusal hem de duygusal bileşenlerini kapsayan ağrı-depresif davranışları değerlendiren operant ağrı modellerinin kullanılmasına artan bir ilgi vardır. Burada açıklanan operant orofasiyal ağrı değerlendirme testi, ödül çatışması paradigması 9,10,11'e dayanmaktadır. Bu tahlilde, kemirgen pozitif bir güçlendirici almak ve kendisini nosiseptif bir uyarana maruz bırakmak veya ödülden vazgeçmek ve nosiseptif uyarandan kaçınmak arasında seçim yapabilir, böylece yaşadığı ağrı miktarını kontrol edebilir. Geleneksel ağrı tahlillerinin aksine, operant-bazlı tahlil deneyciden bağımsızdır ve istenmeyen yatıştırıcı etkiler nedeniyle yanlış pozitif sonuçlara duyarlı değildir.
Baş ve yüzden gelen zararlı duyumlar, trigeminal sinirin oftalmik, maksiller ve mandibuler dalları tarafından taşınır. Trigeminal sinirin yaralanması veya iltihaplanması, duyusal nöronların termal veya mekanik uyaranlara duyarlılığını arttırır12,13,14,15. Rebrent bazlı orofasiyal ağrı testleri, kemirgenlerde trigeminal sinir tarafından iletilen termal veya mekanik orofasiyal ağrının otomatik bir ölçümünü sağlar 11,12,16,17,18. Zararlı olmayan ve zararlı uyaranlarla stimülasyon, orofasiyal bölgede termal ve mekanik allodinya ve hiperaljezi testi ile OPAD arasında önemli bir ayrımdır, çünkü farklı altta yatan mekanizmaların tezahürlerini temsil edebilirler.
Orofasiyal termal tahlilde, hayvanlar ödüle erişmek için yüzlerini pürüzsüz termodlara bastırırlar. Termodlar çeşitli soğuk, sıcak ve sıcak sıcaklıklara ayarlanabilir, böylece nötr veya nosiseptif koşullar altında davranışın değerlendirilmesine izin verilir. Orofasiyal mekanik tahlilde, hayvanlar çalışma testi sırasında yüzlerini çivili çubuklara bastırır; Bu sivri uçlar bir miktar rahatsızlığa neden olduğundan, kemirgenler yüzleri termodların pürüzsüz yüzeylerine karşı sivri uçlara dokunduğunda daha az içebilirler. Böylece, operant orofasiyal mekanik tahlil, değişen derecelerde mekanik nosiseptif stimülasyonun etkisini değerlendirebilir. OPAD'ın akut termal9'un yanı sıra akut mekanik19, nosiseptif ve hiperaljezi değerlendirmesinde yararlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu daha önce göstermiştik.
Bu yazıda mekanik nosiseptif ve aşırı duyarlılığı değerlendirmek için OPAD'ın yeni geliştirilmiş bir versiyonunun kullanımı bildirilmiştir. Ek olarak, doğrulama yoluyla, CCI-ION'un OPAD'da öngörülebilir bir yanıtla sonuçlanan kronik nöropatiyi indükleme yeteneğini gösteriyoruz. Ayrıca, kemirgen davranış verilerini hızlı bir şekilde elde etmek ve analiz etmek için OPAD ve ilişkili yazılımın nasıl kullanılacağı da ayrıntılıdır.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen standartlara uymuştur. Burada, OPAD kullanılarak mekanik aşırı duyarlılığın değerlendirilmesi, nöropatik orofasiyal ağrının bir sıçan modeli kullanılarak tanımlanmıştır. Etüde kullanılan zaman çizelgesinin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Tüm davranışsal değerlendirmeler kadın deneyciler tarafından yapıldı.
1. Hayvanlar
- Ev dişi Sprague-Dawley sıçanları (n = 8 / grup, 150-200 g) sıcaklık kontrollü bir odada (22 ° C ± 1 ° C) çiftler halinde 12 saat: 12 saat açık-karanlık döngüsüne sahip. Yiyecek ve su ad libitum sağlayın. Deneylerden önce sıçanları alışmak için 5 gün boyunca tesiste tutun.
- Operant ağrı tahlillerini haftanın aynı günü ve saatinde (9:00-11:00) yapın.
- Deneylerin sonunda, izofluran anestezisini takiben dekapitasyon yoluyla sıçanları ötenazi yapın.
2. OPAD'ın kurulması
- OPAD'ın üzerine süt damlama tepsileri, Pleksiglas kafesler ve metal döşeme ızgaraları yerleştirin. Kabloları kafeslere takın. Şişe tutucuyu cihazın arkasındaki metal direğe kaydırın.
- Bir kutu şekerli yoğunlaştırılmış süt açıp 1 L'lik bir beherin içine dökerek ödül çözeltisi olarak 2: 1 oranında su ile tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt hazırlayın. 300 mL süte ~ 600 mL musluk suyu ekleyin. Başlangıçta çözeltiyi bir kaşık kullanarak karıştırın ve ardından bir karıştırma çubuğu ve sıcak plaka karıştırıcı kullanın. Ardından, ödül şişelerini süt çözeltisiyle doldurun ve stok süt çözeltisini 4 ° C'de tutun.
NOT: Stok süt çözeltisini plastik gıda ambalajı ile örtün. Her kullanımdan önce süt çözeltisini ısıtın. Buzdolabındaki stok süt çözeltisi bir hafta sonra pıhtılaşabilir. Pıhtılaştığında, yalama tüpünü tıkayabilir. Bu nedenle, atın ve yeni bir stok çözümü hazırlayın. - Ödül süt şişelerini şişe tutucuya yerleştirin ve musluğa hayvan tarafından ulaşılabilecek şekilde ayarlayın. Şişeyi yerine sabitlemek için tutucunun sol tarafındaki düğmeyi sıkın.
- Ön paneldeki anahtarı kullanarak kafesleri açın.
3. Bir protokol oluşturma ve deneme dosyası oluşturma
NOT: İlk olarak, denemeyi çalıştırmak için protokolü ayarlayın. Protokol, ANY-labirent yazılımının deneyi nasıl gerçekleştirdiğini açıklar.
- Yazılımı açın. Parolayı yazın. Oturumumu aç'ı tıklayın veya Enter tuşuna basın.
- Yeni boş deneme |'e tıklayın Protokol menüsü.
- Bu protokolün kullanacağı modu seçin ve protokolü adlandırın. Aygıt'ın altında, Adsız Protokol'ü tıklatın, Bu protokolün kullanacağı modu seç bölümünü tıklatın ve Donanıma Özel Modlar altında OPAD mekanik kafes modu'nu seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, protokolü adlandırın (örneğin, OPAD mekanik).
- OPAD kafesleri ekleyin.
- Apparatus (Aygıt) altında, Apparatus | (Aygıt) seçeneğini tıklatın Protokol bölmesinin en üstünde bulunan öğeyi ekle | Yeni OPAD kafes | Bağlı tüm OPAD kafeslerini ekleyin.
NOT: Kafesleri eklemeden önce, tüm kafeslerin açık olduğundan emin olun.
- Apparatus (Aygıt) altında, Apparatus | (Aygıt) seçeneğini tıklatın Protokol bölmesinin en üstünde bulunan öğeyi ekle | Yeni OPAD kafes | Bağlı tüm OPAD kafeslerini ekleyin.
- Deneme testi aşamaları ekleyin.
- Test altında, Aşamalar |'nı tıklatın İlk aşama ve Aşama adı (örneğin, Temel Gün 1). Test süresi için 10 dakika yazın. Daha fazla aşama eklemek için, Protokol bölmesinin en üstünde bulunan Öğe ekle'yi tıklatın | Yeni Aşama.
NOT: Her aşama, bir tahlil yapıldığında yapılan oturumu ifade eder. Örneğin, 10 günlük eğitim için 10 aşamaya ihtiyaç vardır. Test süresi, deneysel tasarıma bağlı olarak arttırılabilir veya azaltılabilir.
- Test altında, Aşamalar |'nı tıklatın İlk aşama ve Aşama adı (örneğin, Temel Gün 1). Test süresi için 10 dakika yazın. Daha fazla aşama eklemek için, Protokol bölmesinin en üstünde bulunan Öğe ekle'yi tıklatın | Yeni Aşama.
- Tedavi grupları atayın.
- Ek Bilgiler altında, Tedavi grupları'na tıklayın. Kullanım tedavi grupları | Kullanıcı hayvanları gruplarına manuel olarak atar.
NOT: Referans verilen yazılım ( Malzeme Tablosuna bakınız) ayrıca hayvanların rastgele veya belirli bir sırayla atanmasına izin verir. Deneyler kör olarak çalıştırılabilir. Atanan tedavi gruplarını görmek için Denemeleri kör çalıştır seçeneğinin işaretini kaldırın.
- Ek Bilgiler altında, Tedavi grupları'na tıklayın. Kullanım tedavi grupları | Kullanıcı hayvanları gruplarına manuel olarak atar.
- Hayvan kimlikleri (ID) atayın.
- Protokol menüsünü tıklatın; Ek Bilgiler altında, Hayvan Kimliği'ni tıklatın ve Hayvanlara başvurmak için kimliklerimi kullan'ı işaretleyin.
- Deneme menüsünü tıklayın.
- Bir deneme başlığı yazın.
- Tedavileri görüntüle'ye tıklayarak tedavileri adlandırın ve tedavi adlarını yazın (örneğin; Tedavi 1: CCI-ION, Tedavi 2: sahte).
- Hayvanları görüntüle | tıklayarak hayvan ekleyin ve tedaviler ile hayvan kimlikleri atayın Hayvanları ekleyin, test edilecek hayvan sayısını girin ve Tamam'ı tıklatın. Hayvan listesinin görünmesini bekleyin ve her sıçan için hayvan kimlikleri ve tedavileri ekleyin.
NOT: Hayvan kimliğinin yanında görünen bir durum listesi , çalışmanın başında Normal olarak ayarlanacaktır. Hayvanlar daha sonra durumları Kullanımdan Kaldırıldı veya Silindi olarak değiştirilerek test programından çıkarılabilir.
- Protokol menü | tıklatarak protokolü kaydedin Protokol bölmesinin en üstünde bulunan protokolü kaydedin. Dosya adı ve yazılım (ANY-labirent) parolasını yazın ve Kaydet'i tıklatın.
NOT: Kaydedilen protokoller yeni deneyler için yeniden kullanılabilir. - Dosya |'ı tıklayarak deneme dosyasını kaydetme Kaydet, yazılım parolasını yazın ve Kaydet'i tıklatın.
4. Eğitim ve temel test oturumları
NOT: Davranışsal test odası aynı hayvan barınma tesisinde ise, testten en az 15 dakika önce sıçanları odaya getirin. Hayvan tesisinin dışındaki bir test odasına taşınırlarsa, sıçanlara odaya alışmaları için 1 saat verin.
- Temel kayıtlardan önce, OPAD'lerdeki sıçanları, süt çözeltisini almak için yüzlerini metal çivili çubuklara bastırmak için 2 hafta boyunca (5 gün / hafta, 10 dakika / gün) eğitin.
NOT: Çivili çubukların ve tahlili yapan bir sıçanın temsili bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmiştir. - OPAD ekipmanını kurun.
- Ön paneldeki anahtarı kullanarak kafesleri açın. Kafesteki yeşil ışığı arayın, bu da kafesin test etmeye hazır olduğu anlamına gelir.
- Açmak için kaydedilen deneme dosyasını çift tıklayın. Parolayı yazın. Oturumumu aç'ı tıklayın veya Enter tuşuna basın.
- Testler menüsünün görünmesini bekleyin. Ekranın sol tarafında, hayvan sayısını ve ilgili kafesi (örneğin, Hayvan 1, kafes 1'de test edilecektir), o gün çalıştırılacak aşamayı ve test durumunu ("hazır") not edin. Ekranın sağ tarafında, yalama ve temas sayılarını gösteren her hayvanın çizelgesini gözlemleyin.
- Test edilecek hayvanın kimliğini gösteren kafeslerin ekranını gözlemleyin. Her sıçanı ilgili kafese yerleştirin ve kafesteki düğmeye iki kez basın. Test başladıktan sonra yeşil ışığın turuncu ışığa dönüşeceğini ve test oturumu bittiğinde bir uyarı sesi duyulacağını unutmayın.
- Eğitimin ilk 2 günü boyunca, sıçanların uyaranla temas etmeden süt içmesine izin vermek için süt şişelerini tamamen kafese yerleştirin.
- Eğitimin 3-8. günlerinde, hayvanlar içmeye başladığında, fareleri yüzlerini çivili çubuklara bastırmaya teşvik etmek için şişeleri kademeli olarak geriye doğru hareket ettirin.
- Eğitimin 9-10. günlerinde, hayvanlar çivili çubuklara tamamen bastırdıklarında ve yalama sayıları tutarlı olduğunda (10 dakikalık test oturumları sırasında en az 500 yalama), her hayvan için süt şişesinin yerini not edin ve bu mesafeyi temel kayıtlar için kullanın.
- 2 haftalık eğitimin ardından, belirtilen süt şişesi mesafesinden 5 gün boyunca temel olarak veri toplayın (10 dakika / gün).
5. Orofasiyal nöropatik ağrının indüklenmesi ve mekanik aşırı duyarlılığın değerlendirilmesi
NOT: Temel ölçümleri takiben, sıçanlara, daha önce tarif edildiği gibi ION'un bilateral ligasyonunu içeren CCI-ION ameliyatı uygulandı20. Kontrol sıçanları sahte ameliyat geçirdi. Nöropatinin zaman seyrini değiştirebileceği için prosedürde ameliyat öncesi veya sonrası analjezi kullanılmadı. DİKKAT: Atık izofluran, kömür bidonlarından temizlenmelidir. Neşter bıçakları ve iğneleri biyolojik tehlike atıklarına atılmalıdır.
- İndüksiyon odasındaki sıçanıO2 (1 L / dak) ve% 4 izofluran karışımı ile anestezi altına alın ve ameliyat süresince özel bir burun konisi ile anestezik durumu koruyun.
- Anestezi uygulanan sıçanı cerrahi bir tezgaha yerleştirin ve kısıtlayın. Bir ısıtma yastığı kullanarak vücut ısısını 37 ° C'de tutun. Kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Ayak parmağını sıkıştırarak anestezik derinliği kontrol edin ve ayak parmağı çekilme refleksi artık gözlenmediğinde işleme başlayın.
- Cerrahi prosedürü stereo mikroskop altında gerçekleştirin. Retraktörler kullanarak ağzınızı açın ve küçük bir klips kullanarak dudağı geri çekin.
- Bir neşter bıçağı kullanarak sırt sakızı ve dudak arasında küçük bir kesi yapın (# 15). ION'un bir dalını ortaya çıkarmak için neşter bıçağının ucunu kullanarak yumuşak dokuyu yavaşça kesin.
- Künt, bükülmüş bir şırınga iğnesi kullanarak ION'un etrafına iki kromik bağırsak (# 5-0) ligatürü yerleştirin.
- Doku yapıştırıcısı kullanarak yarayı kapatın.
- Sahte cerrahi için, aynı prosedürü kullanarak ION'u açığa çıkarın, ancak siniri kandırmayın.
- Ameliyattan sonra, yemeyi teşvik etmek ve dehidrasyonu önlemek için 2 gün boyunca sütle yumuşatılmış kemirgen chow sağlayın.
- OPAD'daki sıçanları, ameliyattan sonraki gün art arda 3 gün ve daha sonra 3 gün / hafta (örneğin, her Salı, Perşembe ve Cuma) sonraki haftalarda, yalama sayıları temel değerlerine ulaşana kadar test edin.
NOT: CCI-ION kaynaklı mekanik hassasiyetin süresi, cinsiyete, kullanılan kemirgenin gerilmesine ve deneycinin performansına bağlı olabilir. Bu nedenle, hayvanları test etmek için belirli bir süreyi belirtmek doğru olmayabilir. Bu nedenle, yalama sayıları taban çizgisi değerlerine ulaşana kadar test etmek daha doğrudur.
6. Cihazın temizlenmesi
- Test tamamlandığında, sağ üst köşedeki x simgesine tıklayarak yazılımdan çıkın ve verilerin otomatik olarak kaydedilmesini bekleyin.
- Ön paneldeki anahtarı kullanarak kafesleri kapatın.
- Kabloları metal döşeme ızgaralarından çıkarın. Süt damlama tepsilerini, Pleksiglas kafesleri, metal döşeme ızgaralarını ve şişe tutucularını bulaşık sabunu ile çıkarın ve yıkayın. Her şeyi kurutma rafına koyun.
- Metal çivili çubukları, test cihazını ve laboratuvar tezgahlarını %70 izopropil alkol kullanarak silin.
NOT: Aletlerin dikkatli bir şekilde kullanılması gerekir. Süt şişelerini temizlerken ve tüpleri yalarken yumuşak fırçalar kullanın. Kirli ekipman bakteri birikimine neden olabilir.
7. Veri analizi
- Denemek dosyasını açmak için üzerine çift tıklayın.
- Sonuçlar menüsüne tıklayın. Hangi hesaplamaların (ör. yalama, temas kurma) veya test günlerinin görüleceğini seçin.
- Bir metin, grafik veya istatistiksel analiz raporu görmek için Sonuçlar panelinin üst kısmındaki Metin veya Grafik ya da İstatistik bulundu'yu tıklayın.
- Ham verileri görmek için, Veri menüsüne tıklayın. Verileri elektronik tablo olarak kaydetmek için Veri panelinin üst kısmındaki Kaydet'i tıklatın veya e-posta yoluyla almak için Gönder'i tıklatın.
- Görülecek değişkenleri değiştirmek veya daha fazla değişken eklemek için Veri seç'i tıklayın, hesaplamaları seçin ve E-tabloyu görüntüle'yi tıklayın.
- İstatistiksel analiz
- Yalama ve kişi sayısını ve ilk yalamaya kadar olan gecikmeyi yazılımdan otomatik olarak türetin ve verileri yazılımdan bir elektronik tabloya aktarın.
- L / F oranını, yalama sayısını21,22,23 temas sayısına bölerek aşırı duyarlılık indeksi olarak hesaplayın.
NOT: Bu çalışmada, sahte gruptaki sıçanlardan biri, ameliyattan önce düşük yalama sayıları (<500 yalama) nedeniyle çalışmanın dışında bırakılmıştır. - L / F arasındaki farkların istatistiksel önemini, yalama sayısını ve kontakları ve ilk yalamanın gecikmesini iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ile analiz edin, ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırmaları veya uygun olduğunda Šídák'ın çoklu karşılaştırma testleri izleyin.
NOT: 0.05 < P istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Veriler ortalamanın standart hatası (SEM) ± olarak sunuldu.
Representative Results
Tek bir sıçanın ödül şişesi üzerindeki yalamalarının ve başlangıçta ve ameliyattan 2 hafta, 4 hafta ve 6 hafta sonra metal çivili çubuklarla temas etmesinin bir örneği Şekil 3'te sunulmuştur. Zararlı olmayan dönemlerde, sıçanlar genellikle uzun içme seanslarına sahiptir (örneğin, CCI-ION'dan sonra başlangıçta ve iyileşmede: görüntüde 6. hafta) ve CCI-ION'u takiben, çivili çubuklarla yüz temasını uzun süre koruyamadıkları için yalama sayıları azalır (Şekil 3A), sahte gruptaki içme dönemlerinde önemli bir değişiklik olmaz (Şekil 3B).
CCI-ION'lu sıçanlar, ameliyattan 4 hafta sonrasına kadar yalama sayısında önemli bir azalmaya ve ameliyat haftasında (0. hafta) ve ameliyattan 1 hafta sonra ilk yalama gecikmesinde başlangıca göre bir artışa sahipti. Sahte grupta anlamlı bir değişiklik saptanmadı (Şekil 4A,B). CCI-ION, kontak sayısında bir azalmaya neden oldu, ancak bu fark anlamlı değildi (Şekil 4C). CCI-ION ayrıca L / F'de önemli bir azalmaya neden olmuştur ve CCI-ION grubu için düşüş, sahte grup için düşüşten daha büyüktü (Şekil 4D).
Bu sonuçlar, CCI-ION'u takiben, sıçanların daha az ödül süt içme davranışı gösterdiğini ve ilk yalamayı yapmalarının biraz zaman aldığını ve nosifensif bir davranışı gösterdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, CCI-ION süte ulaşma isteklerini etkilemez. Ek olarak, CCI-ION'lu sıçanların L / F'sindeki azalma, ağrılı olmayan koşullar sırasında L / F daha yüksek olduğu için mekanik aşırı duyarlılığı gösterir.
Şekil 1: Çalışma tasarımının şematik gösterimi. Kısaltmalar: OPAD = orofasiyal ağrı değerlendirme cihazı; CCI-ION = infraorbital sinirlerin kronik daralma yaralanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çivili çubukların temsili görüntüsü ve tahlili yapan bir sıçan. Çivili çubuklar paslanmaz çelik metalden yapılmıştır. Tüm çubuğun uzunluğu 7 cm'dir. Sivri uçların yüksekliği 0,3 cm'dir. Sivri uçlar arasındaki mesafe 0,5 cm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Başlangıçta ve ameliyattan 2 hafta, 4 hafta ve 6 hafta sonra standart 10 dakikalık test oturumu sırasında tek bir CCI-ION ve sahte ameliyat edilen sıçanın temsili temas girişimleri ve yalama verileri. Kısaltmalar: CCI-ION = infraorbital sinirlerin kronik daralma yaralanması; AS = ameliyattan sonra. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sprague-Dawley sıçanlarında CCI-ION'u takiben mekanik aşırı duyarlılık gelişimi. (A) CCI-ION'lu sıçanlarda (n = 8) ameliyattan 4 hafta sonrasına kadar yalama sayısında anlamlı bir azalma ve (B) ameliyat haftasında (0. hafta) ve ameliyattan 1 hafta sonra ilk yalama gecikmesinde bir artış (**p < 0.01, *p < 0.05: ameliyat haftalarından sonra başlangıç çizgisine göre. #p < 0.05: CCI-ION vs. sahte). Sahte grupta anlamlı bir azalma saptanmadı (n=7, p > 0.05). (C) CCI-ION veya sahte cerrahi, temas sayısında önemli bir değişiklik yaratmadı. (D) KKI-ION'lu sıçanlar, ameliyat haftasında ve 3 hafta sonra L / F'de anlamlı bir düşüş gösterdi ve ameliyattan 2 hafta sonra azalan bir eğilim sergiledi. Sahte grup sıçanlarla karşılaştırıldığında, bu azalma CCI-ION sıçanlarında anlamlı olarak daha yüksekti ve ameliyattan 1 hafta sonra başladı ve ameliyattan 3 hafta sonrasına kadar devam etti. Sahte grupta anlamlı bir fark yoktu (**p < 0.01, *p < 0.05: ameliyat haftalarından sonra başlangıç çizgisine karşı. # p < 0.05: CCI-ION vs sahte). Grafiklerde, kırmızı çizgi CCI-ION grubunu ve mavi çizgi sahte grubu temsil eder. Önemli farklılıklar±, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ve ardından Šídák veya Dunnett'in çoklu karşılaştırma testleri ile analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Yüzün ve ağız içi mukozanın zararsız mekanik stimülasyonu ile tetiklenen ağrı, trigeminal nevralji ve temporomandibuler eklem bozuklukları da dahil olmak üzere orofasiyal ağrı durumlarının belirgin bir özelliğidir24,25. Trigeminal nöropatik ağrı klinik olarak iyi tanımlanmış olmasına rağmen, kemirgenlerde nöropatik nosiseptif davranışların değerlendirilmesi zordur. Refleksif davranışları ölçen ağrı tahlilleri, klinik öncesi ağrı araştırmalarında en sık kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, cihazla ilgili stresin test edilmesi, duygusal durumun değerlendirilememesi ve deneyci önyargısı, refleks tahlillerinin yararlılığı ve geçerliliği ile ilgili endişeleri artırmaktadır26.
Bu çalışma, sıçanların orofasiyal bölgesindeki mekanik duyarlılığın değerlendirilmesini tanıtmakta ve operant bazlı bir ağrı testi kullanarak CCI-ION'a duyarlılığını göstermektedir. Aynı çalışma sistemi, farelerin mekanik hassasiyetini test etmek için de kullanılabilir. Fare ve sıçan suşlarının CCI-ION'a yanıtlarında farklılıklar gösterebileceği ve dolayısıyla mekanik aşırı duyarlılık seviyelerinin farklılık gösterebileceği belirtilmelidir. Deneyimlerimize dayanarak, Sprague-Dawley sıçanları tipik olarak CCI-ION'dan 2 hafta sonra stabil bir mekanik aşırı duyarlılık geliştirir, CCI-ION'dan 4 hafta sonra iyileşmeye başlarlar ve 6 haftalık CCI-ION'dan sonra ameliyattan iyileşme görürüz.
Bu protokolde, mekanik aşırı duyarlılık, yalama sayısını ve ilk yalamaya temasları, L / F'yi ve gecikmeyi ölçerek ölçüldü. Veriler, CCI-ION'un L / F'de azalmaya ve yalama yanıtlarının sayısında azalmaya ve ilk yalama tepkisine gecikme süresinde artışa neden olduğunu gösterdi; bu, hayvanların artan orofasiyal ağrı duyarlılığı nedeniyle yüzlerini çivili çubuklara bastırmak istemediklerini gösterdi.
OPAD, hayvanların lezzetli bir ödüle erişmek için nosiseptif uyaranlara katlanması gereken bir ödül çatışması testidir. Tahlildeki yalama davranışı iştah açıcı davranıştan etkilenebilir. Ek olarak, bu çalışmada, yüz kılları olan fareleri kullandık. Operant ağrı tahlilleri ile ilgili önceki deneyimlere dayanarak, kemirgenler arasında, tüysüz suşlar yüz temaslarını tespit etmek için daha iyidir16; Bununla birlikte, yayın sırasında, tüysüz sıçan suşları artık ticari olarak mevcut değildi. Bu, çalışmanın bir sınırlaması olarak düşünülebilir. Ayrıca sadece dişi Sprague-Dawley sıçanlarını kullandığımız için, ağrı yanıtlarında cinsiyet ve suşla ilgili farklılıklar öngörülmelidir.
Tahlil ile optimum sonuçların sağlanması için bazı kritik adımlar da vardır. Doğru yalama ve temas verileri, referans verilen yazılımda sırasıyla düz kırmızı ve beyaz bloklar olarak görünmelidir (bkz. Şekil 3). Sivri uçlar ve süt şişesi arasındaki mesafe, deneyin başarısı için çok önemlidir. Süt şişesinin ucu çok ilerideyse, hayvan sivri uçlarla temas etmeyecek ve yazılım temasları doğru şekilde kaydetmez veya sayıları yalar. Tersine, süt şişesi çok gerideyse, temaslar kaydolacaktır, ancak hayvan süte ulaşamayacaktır. Eğitim seansları sırasında, süt şişesinin ucu çok ileride olduğu için yalama verileri düz beyaz bloklar olarak görünebilir. Süt şişesi geriye doğru itildikten sonra kırmızı katı bloklara dönüşür. Bazı nedenlerden dolayı, yalama verileri belirtilen mesafeden beyaz bloklar olarak görünmeye başlarsa, şişeyi biraz itmek ve süt tutucuyu hafifçe aşağı / yukarı doğru hareket ettirmek yardımcı olabilir.
Burada tarif edilen orofasiyal operant ağrı sisteminin sınırlamaları olarak da birkaç nokta düşünülebilir. Kemirgenlerin eğitimi gereklidir ve haftalar sürer. Her test seansından önce, farelerde gıda kısıtlaması gereklidir, ancak sıçanlarda gerekli değildir. Açsız farelerin, oruç tutan farelere kıyasla düşük ve tutarsız yalama sayılarına sahip olduğu gösterilmiştir27. OPAD sistemi bir ödül-çatışma modeli olduğundan, hayvanların iştah açıcı davranışlarından veya iştahı etkileyen bir ilaçtan etkilenebilir. Birden fazla aparata sahip olmak, hayvanları test etmek için toplam süreyi azaltmak için de avantajlıdır, bu da maliyetleri artırabilir. Bununla birlikte, orofasiyal operant ağrı testleri, aynı anda birden fazla hayvanın test edilmesine izin verdiği ve hayvan-deneyci etkileşimini sınırladığı için geleneksel refleks tabanlı testlere göre hala avantajlıdır.
Ağrı durumları sırasında edimsel koşullanma, insan ve hayvan davranışlarını sonuçlarına göre değiştirir28. Bu nedenle, bir ödül-çatışma modeli kullanmak, ağrı koşullarını değerlendirmek için avantajlıdır, çünkü hayvanların operant tepkiler vermesine izin verir. Bu klinik olarak daha önemlidir, çünkü operant davranışların özellikleri niyet, motivasyon ve tipik olarak kortikal işlemeyi içerir29. Hayvanlar gönüllü olarak ödül şişesine yaklaştıklarından ve herhangi bir zamanda çivili çubuklardan serbestçe çekilebildiklerinden, bu beynin daha yüksek merkezlerini bütünleştirir ve ağrı10 ile ilgili duygusal-motivasyonel durumların değerlendirilmesine izin verir. Bu nedenle, operant ağrı tahlilleri, ağrı ve analjezikleri in vivo olarak değerlendirirken üstün veriler sağlar. Ayrıca trigeminal sistemdeki nosiseptif süreçleri anlamaya yardımcı olurlar, böylece orofasiyal ağrı alanının ilerlemesine katkıda bulunurlar.
Disclosures
John K. Neubert ve Robert M. Caudle, OPAD'ın mucitleridir. Stoelting Co., OPAD'ın üreticisidir ve Richard Mills, Stoelting'in bir çalışanıdır. Yayın ücreti Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert ve Robert M. Caudle tarafından ödenmiştir, operant ağrı tahlilleri kullanarak hizmet için ücretli davranış testi sağlayan bir şirket olan Velocity Laboratories'in önceki sahipleridir.
Acknowledgments
Bu çalışma Yüz Ağrısı Araştırma Vakfı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
