Summary
Este protocolo describe la evaluación de la hipersensibilidad mecánica en un modelo de rata de dolor orofacial neuropático utilizando un dispositivo de evaluación del dolor orofacial basado en operantes.
Abstract
El dolor tiene componentes sensoriales y afectivos. A diferencia de los ensayos de dolor tradicionales basados en reflejos, los ensayos de dolor operantes pueden producir resultados clínicamente más relevantes al abordar los aspectos cognitivos y motivacionales del dolor en roedores. Este artículo presenta un protocolo para evaluar la hipersensibilidad mecánica después de la lesión por constricción crónica de los nervios infraorbitarios (CCI-ION) en ratas utilizando un sistema de dolor operante orofacial. Antes de la cirugía CCI-ION, las ratas fueron entrenadas en un dispositivo de evaluación del dolor orofacial (OPAD) para beber leche condensada endulzada mientras hacían contacto facial con las barras de metal con púas y el tubo de lamido.
En este ensayo, las ratas pueden elegir entre recibir leche como un refuerzo positivo o escapar de un estímulo mecánico aversivo que se produce por una fila vertical de pequeños picos en forma de pirámide a cada lado del orificio de acceso a la recompensa. Después de 2 semanas de entrenamiento en el OPAD y antes de la cirugía CCI-ION, se registraron datos basales de sensibilidad mecánica durante 5 días para cada rata durante una sesión de prueba de 10 minutos. Durante una sesión, el sistema operante registra automáticamente el número de activaciones de botellas de recompensa (lamidas) y contactos faciales, la duración del contacto y la latencia hasta la primera lamida, entre otras medidas.
Después de las mediciones iniciales, las ratas se sometieron a CCI-ION o cirugía simulada. En este protocolo, la hipersensibilidad mecánica se cuantificó midiendo el número de lamidos, la latencia hasta el primer lametón, el número de contactos y la relación de lamidos a contactos faciales (L/F). Los datos mostraron que CCI-ION resultó en una disminución significativa en el número de lamidos y la relación L / F y un aumento en la latencia hasta el primer lametón, lo que indica hipersensibilidad mecánica. Estos datos apoyan el uso de ensayos de dolor basados en operantes para evaluar la sensibilidad mecánica al dolor en la investigación preclínica del dolor.
Introduction
El dolor crónico afecta a millones de estadounidenses anualmente1. Desafortunadamente, el dolor crónico es difícil de tratar, ya que las terapias existentes son relativamente ineficaces para mitigar el dolor crónico y a menudo tienen efectos secundarios no deseados con el uso a largo plazo 2,3,4. Los ensayos preclínicos tradicionales del dolor, como el ensayo de von Frey, se basan en resultados reflexivos o respuestas estimuladas por el dolor5. Si bien el ensayo de von Frey se ha utilizado durante décadas para medir la alodinia mecánica, es susceptible a varios factores de confusión, especialmente el sesgo del experimentador6. El uso de la prueba de von Frey para evaluar el dolor orofacial también es problemático debido al grado de restricción necesario para asegurar la cabeza del animal para probar con éxito el área facial, lo que puede producir efectos de estrés no deseados, como aumentar el dolor o, por el contrario, analgesia inducida por el estrés.
Los comportamientos estimulados por el dolor también son susceptibles a resultados falsos positivos7 y no tienen en cuenta el componente afectivo del dolor, que es parte integral de la experiencia del dolor humano8. Por lo tanto, existe un creciente interés en el uso de modelos operantes de dolor que evalúan los comportamientos deprimidos por el dolor que abarcan los componentes sensoriales y afectivos del dolor para mejorar el contenido y la validez predictiva en las pruebas preclínicas. El ensayo operante de evaluación del dolor orofacial descrito aquí se basa en un paradigma de recompensa-conflicto 9,10,11. En este ensayo, el roedor puede elegir entre recibir un refuerzo positivo y someterse a un estímulo nociceptivo o renunciar a la recompensa y evitar el estímulo nociceptivo, controlando así la cantidad de dolor que experimenta. A diferencia de los ensayos de dolor tradicionales, el ensayo basado en operantes es independiente del experimentador y no es susceptible a resultados positivos falsos debido a los efectos sedantes adversos.
Las sensaciones nocivas de la cabeza y la cara son transportadas por las ramas oftálmica, maxilar y mandibular del nervio trigémino. La lesión o inflamación del nervio trigémino aumenta la sensibilidad de las neuronas sensoriales a estímulos térmicos o mecánicos12,13,14,15. Los ensayos de dolor orofacial basados en operantes proporcionan una medición automatizada del dolor orofacial térmico o mecánico transmitido por el nervio trigémino en roedores 11,12,16,17,18. La estimulación con estímulos nocivos y nocivos es una distinción importante entre probar la alodinia térmica y mecánica y la hiperalgesia en la región orofacial con el OPAD, ya que pueden representar manifestaciones de diferentes mecanismos subyacentes.
En el ensayo térmico orofacial, los animales presionan su cara contra termodos suaves para acceder a la recompensa. Los termodos se pueden ajustar a varias temperaturas frías, cálidas y calientes, lo que permite la evaluación del comportamiento en condiciones neutras o nociceptivas. En el ensayo mecánico orofacial, los animales presionan su cara contra barras con púas durante las pruebas operantes; Como estos picos causan cierto nivel de incomodidad, los roedores pueden beber menos cuando sus caras tocan los picos en comparación con las superficies lisas de los termodos. Por lo tanto, el ensayo mecánico orofacial operante puede evaluar el efecto de diversos grados de estimulación nociceptiva mecánica. Hemos demostrado previamente que el OPAD es un método útil y fiable para evaluar el calor agudo9, así como el agudomecánico 19, la nocicepción y la hiperalgesia.
Este documento informa sobre el uso de una versión recientemente desarrollada del OPAD para evaluar la nocicepción mecánica y la hipersensibilidad. Además, a modo de validación, demostramos la capacidad de CCI-ION para inducir neuropatía crónica que resulta en una respuesta predecible en el OPAD. También se detalla cómo usar el OPAD y su software asociado para obtener y analizar rápidamente los datos de comportamiento de los roedores.
Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida y cumplieron con los estándares establecidos en la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Aquí, la evaluación de la hipersensibilidad mecánica utilizando el OPAD se describe utilizando un modelo de rata de dolor orofacial neuropático. Un esquema de la línea de tiempo utilizada en el estudio se muestra en la Figura 1. Todas las evaluaciones de comportamiento fueron realizadas por experimentadoras femeninas.
1. Animales
- Alojar ratas hembras Sprague-Dawley (n = 8/grupo, 150-200 g) en parejas en una habitación con temperatura controlada (22 °C ± 1 °C) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h:12 h. Proporcionar alimentos y agua ad libitum. Mantenga a las ratas en la instalación durante 5 días para la aclimatación antes de los experimentos.
- Realice los ensayos de dolor operante el mismo día de la semana y la misma hora (9 a.m.-11 a.m.).
- Al final de los experimentos, sacrificar a las ratas por decapitación después de la anestesia con isoflurano.
2. Configuración del OPAD
- Coloque bandejas de goteo de leche, jaulas de plexiglás y rejillas metálicas para pisos en el OPAD. Conecte el cableado a las jaulas. Deslice el soporte de la botella en el poste de metal en la parte posterior del dispositivo.
- Prepare una proporción de 2: 1 de agua a leche condensada endulzada como solución de recompensa abriendo una lata de leche condensada endulzada y virtiéndolo en un vaso de precipitados de 1 L. Agregue ~ 600 ml de agua del grifo a 300 ml de leche. Inicialmente revuelva la solución con una cuchara, y luego use una barra de agitación y el agitador de placa caliente. A continuación, llene los biberones de recompensa con la solución láctea y mantenga la solución láctea madre a 4 °C.
NOTA: Cubra la solución de leche madre con una envoltura plástica para alimentos. Caliente la solución láctea antes de cada uso. La solución de leche madre en el refrigerador puede coagularse después de una semana. Cuando se coagula, puede ocluir el tubo de lamido. Por lo tanto, deséchelo y prepare una nueva solución de stock. - Coloque las botellas de leche de recompensa en el soporte de la botella y ajústelas para que el animal pueda alcanzar el pico. Apriete la perilla del lado izquierdo del soporte para asegurar la botella en su lugar.
- Encienda las jaulas con el interruptor del panel frontal.
3. Configuración de un protocolo y creación de un archivo de experimento
Nota : en primer lugar, configure el protocolo para ejecutar el experimento. El protocolo describe cómo el software ANY-maze realiza el experimento.
- Abra el software. Escriba la contraseña. Haga clic en Iniciar sesión o presione Enter.
- Haga clic en Nuevo experimento vacío | Menú de protocolo .
- Seleccione el modo que utilizará este protocolo y asigne un nombre al protocolo. En Aparato, haga clic en Protocolo sin nombre, haga clic en la sección Seleccione el modo que utilizará este protocolo y, en Modos específicos del equipo, seleccione Modo de jaula mecánica OPAD y haga clic en Aceptar. Luego, nombre el protocolo (por ejemplo, OPAD mecánico).
- Añadir jaulas OPAD.
- En Aparato, haga clic en Aparato | Agregar elemento que se encuentra en la parte superior del panel Protocolo | Nueva jaula OPAD | Agregue todas las jaulas OPAD conectadas.
NOTA: Antes de agregar las jaulas, asegúrese de que todas las jaulas estén encendidas.
- En Aparato, haga clic en Aparato | Agregar elemento que se encuentra en la parte superior del panel Protocolo | Nueva jaula OPAD | Agregue todas las jaulas OPAD conectadas.
- Agregar etapas de prueba de experimento.
- En Pruebas, haga clic en Etapas | Primera etapa y nombre Etapa (por ejemplo, Día de referencia 1). Escriba 10 min para la duración de la prueba. Para agregar más etapas, haga clic en Agregar elemento que se encuentra en la parte superior del panel Protocolo | Nueva etapa.
NOTA: Cada etapa se refiere a la sesión en la que se realiza un ensayo. Por ejemplo, para 10 días de entrenamiento, se necesitan 10 etapas. La duración de la prueba se puede aumentar o disminuir según el diseño experimental.
- En Pruebas, haga clic en Etapas | Primera etapa y nombre Etapa (por ejemplo, Día de referencia 1). Escriba 10 min para la duración de la prueba. Para agregar más etapas, haga clic en Agregar elemento que se encuentra en la parte superior del panel Protocolo | Nueva etapa.
- Asigne grupos de tratamiento.
- En Información adicional, haga clic en Grupos de tratamiento. Comprobar Usar grupos de tratamiento | El usuario asignará manualmente los animales a sus grupos.
NOTA: El software de referencia (consulte la Tabla de materiales) también permite asignar animales al azar o en un orden específico. Los experimentos se pueden realizar a ciegas. Para ver los grupos de tratamiento asignados, desactive Ejecutar experimentos a ciegas.
- En Información adicional, haga clic en Grupos de tratamiento. Comprobar Usar grupos de tratamiento | El usuario asignará manualmente los animales a sus grupos.
- Asigne identificaciones de animales (ID).
- Haga clic en el menú Protocolo ; en Información adicional, haz clic en ID de animal y marca Usar mis identificadores para hacer referencia a los animales.
- Haga clic en el menú Experimento .
- Escriba un título de experimento.
- Asigne un nombre a los tratamientos haciendo clic en Ver tratamientos y escriba los nombres de los tratamientos (por ejemplo, Tratamiento 1: CCI-ION, Tratamiento 2: simulado).
- Agregue animales y asigne tratamientos e identificaciones de animales haciendo clic en Ver animales | Agregue animales, ingrese el número de animales que se probarán y haga clic en Aceptar. Espere a que aparezca la lista de animales y agregue identificaciones de animales y tratamientos para cada rata.
NOTA: Una lista de estado que aparece junto a la identificación del animal se establecerá en Normal al comienzo del estudio. Los animales pueden ser eliminados más tarde del programa de pruebas cambiando su estado a Retirado o Eliminado.
- Guarde el protocolo haciendo clic en el menú Protocolo | Guardar protocolo que se encuentra en la parte superior del panel Protocolo . Escriba Nombre de archivo y contraseña del software (ANY-maze) y haga clic en Guardar.
NOTA: Los protocolos guardados se pueden reutilizar para nuevos experimentos. - Guarde el archivo de experimento haciendo clic en Archivo | Guardar, escriba la contraseña del software y haga clic en Guardar.
4. Sesiones de entrenamiento y pruebas de referencia
NOTA: Lleve ratas a la habitación al menos 15 minutos antes de la prueba si la sala de pruebas de comportamiento está en la misma instalación de alojamiento de animales. Si son transportadas a una sala de pruebas fuera de la instalación para animales, dé a las ratas 1 h para aclimatarse a la habitación.
- Antes de los registros de referencia, entrene a las ratas en los OPAD durante 2 semanas (5 días / semana, 10 minutos / día) para presionar sus caras contra las barras de metal con púas para recibir la solución láctea.
NOTA: En la Figura 2 se muestra una imagen representativa de barras con púas y una rata realizando el ensayo. - Configure el equipo OPAD.
- Encienda las jaulas con el interruptor del panel frontal. Busque la luz verde en la jaula, lo que significa que la jaula está lista para probar.
- Haga doble clic en el archivo de experimento guardado para abrirlo. Escriba la contraseña. Haga clic en Iniciar sesión o presione Enter.
- Espere a que aparezca el menú Pruebas . En el lado izquierdo de la pantalla, anote el número de animales y la jaula correspondiente (por ejemplo, el animal 1 se probará en la jaula 1), la etapa que se ejecutará ese día y el estado de la prueba ("listo"). En el lado derecho de la pantalla, observe la tabla de cada animal que muestra el número de lamidos y contactos.
- Observe la pantalla de las jaulas que muestra la identificación del animal a probar. Coloque cada rata en la jaula correspondiente y presione el botón de la jaula dos veces. Tenga en cuenta que la luz verde se convertirá en una luz naranja una vez que comience la prueba, y se escuchará un sonido de advertencia cuando finalice la sesión de prueba.
- Durante los primeros 2 días de entrenamiento, coloque las botellas de leche completamente en la jaula para permitir que las ratas beban leche sin entrar en contacto con el estímulo.
- En los días 3-8 de entrenamiento, una vez que los animales comienzan a beber, mueva las botellas progresivamente hacia atrás para alentar a las ratas a presionar sus caras contra las barras con púas.
- En los días 9-10 de entrenamiento, una vez que los animales presionan completamente contra las barras con púas y los números de lamido son consistentes (un mínimo de 500 lamidos durante las sesiones de prueba de 10 minutos), anote la ubicación de la botella de leche para cada animal y use esta distancia para los registros de referencia.
- Después de 2 semanas de entrenamiento, recopile datos de la distancia indicada en la botella de leche durante 5 días como línea de base (10 minutos / día).
5. Inducción del dolor neuropático orofacial y evaluación de la hipersensibilidad mecánica
NOTA: Después de las mediciones basales, las ratas se sometieron a cirugía CCI-ION, que involucró la ligadura bilateral del ION, como se describió anteriormente20. Las ratas de control se sometieron a una cirugía simulada. No se utilizó analgesia pre o postoperatoria en el procedimiento, ya que puede cambiar el curso temporal de la neuropatía. PRECAUCIÓN: El isoflurano residual debe ser eliminado a través de botes de carbón. Las hojas y agujas de bisturí deben eliminarse en los desechos de riesgo biológico.
- Anestesiar a la rata en la cámara de inducción con una mezcla deO2 (1 L/min) e isoflurano al 4% y mantener el estado anestésico con un cono nasal especializado durante la cirugía.
- Coloque la rata anestesiada en un banco de trabajo quirúrgico y conténgala. Mantener la temperatura corporal a 37 °C con una almohadilla térmica. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie y comience el procedimiento cuando ya no se observe el reflejo de retirada del dedo del pie.
- Realice el procedimiento quirúrgico bajo un microscopio estereoscópico. Abra la boca con retractores y retraiga el labio con un pequeño clip.
- Haga una pequeña incisión entre la encía dorsal y el labio con una hoja de bisturí (#15). Corte suavemente el tejido blando con la punta de la hoja de bisturí para revelar una rama del ION.
- Coloque dos ligaduras de tripa crómica (# 5-0) alrededor del ION usando una aguja de jeringa doblada y roma.
- Cierre la herida con adhesivo tisular.
- Para la cirugía simulada, exponga el ION usando el mismo procedimiento, pero no liga el nervio.
- Después de la cirugía, proporcione comida de roedor ablandada con leche durante 2 días para estimular la alimentación y prevenir la deshidratación.
- Pruebe las ratas en el OPAD el día después de la cirugía durante 3 días consecutivos y luego 3 días / semana (por ejemplo, todos los martes, jueves y viernes) durante las siguientes semanas hasta que los números de lamido alcancen sus valores basales.
NOTA: La duración de la sensibilidad mecánica inducida por CCI-ION puede depender del sexo, la cepa del roedor utilizado y el rendimiento del experimentador. Por lo tanto, podría no ser exacto indicar una cierta duración para probar animales. Por lo tanto, las pruebas hasta que los números de lamido alcancen los valores de referencia son más precisas.
6. Limpieza del dispositivo
- Cuando finalicen las pruebas, salga del software haciendo clic en el icono x en la esquina superior derecha y espere a que los datos se guarden automáticamente.
- Apague las jaulas con el interruptor del panel frontal.
- Desenchufe los cables de las rejillas metálicas del piso. Retire y lave las bandejas de goteo de leche, las jaulas de plexiglás, las rejillas metálicas para pisos y los portabotellas con jabón para platos. Coloque todo en la rejilla de secado.
- Limpie las barras con púas de metal, el dispositivo de prueba y los bancos de laboratorio con alcohol isopropílico al 70%.
NOTA: Los instrumentos deben manejarse con cuidado. Use cepillos suaves mientras limpia las botellas de leche y lamer los tubos. El equipo sucio puede provocar la acumulación de bacterias.
7. Análisis de datos
- Haga doble clic en el archivo del experimento para abrirlo.
- Haga clic en el menú Resultados . Seleccione qué medidas (es decir, lamer, contactar) o días de prueba ver.
- Haga clic en Texto, gráfico o Estadística que se encuentra en la parte superior del panel Resultados para ver un informe de texto, gráfico o análisis estadístico.
- Para ver los datos sin procesar, haga clic en el menú Datos . Haga clic en Guardar en la parte superior del panel Datos para guardar los datos como una hoja de cálculo o haga clic en Enviar para recibirlos por correo electrónico.
- Para cambiar o agregar más variables para ver, haz clic en Seleccionar datos, selecciona las medidas y haz clic en Ver hoja de cálculo.
- Análisis estadístico
- Deriva automáticamente el número de licks y contactos y la latencia al primer lick del software y exporta los datos del software a una hoja de cálculo.
- Calcule la relación L/F como un índice de hipersensibilidad dividiendo el número de lamidos por el número de contactos21,22,23.
NOTA: En este estudio, una de las ratas en el grupo simulado fue excluida del estudio debido al bajo número de lamidos (<500 lamidos) antes de la cirugía. - Analizar la significación estadística de las diferencias entre L/F, el número de lamidos y los contactos, y la latencia al primer lamido a través de ANOVA de medidas repetidas bidireccionales seguidas de comparaciones múltiples de Dunnett o pruebas de comparaciones múltiples de Šídák cuando corresponda.
NOTA: P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los datos se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM).
Representative Results
En la Figura 3 se presenta un ejemplo de lamidos de una sola rata en la botella de recompensa y contactos con las barras de metal con púas al inicio y 2 semanas, 4 semanas y 6 semanas después de la cirugía. Durante los períodos no nocivos, las ratas generalmente tienen largas sesiones de consumo de alcohol (por ejemplo, al inicio y la recuperación después de CCI-ION: semana 6 en la imagen) y, después de CCI-ION, el número de lamidos disminuye ya que no pueden mantener contacto facial con las barras con púas durante mucho tiempo (Figura 3A), sin cambios significativos en los períodos de consumo en el grupo simulado (Figura 3B).
Las ratas con CCI-ION tuvieron una disminución significativa en el número de lamidos hasta 4 semanas después de la cirugía y un aumento en la latencia hasta el primer lamido en la semana de la cirugía (semana 0) y 1 semana después de la cirugía en comparación con el valor inicial. No hubo cambios significativos en el grupo simulado (Figura 4A, B). CCI-ION produjo una disminución en el número de contactos, pero esta diferencia no fue significativa (Figura 4C). CCI-ION también causó una disminución significativa en el L/F, y la disminución para el grupo CCI-ION fue mayor que la disminución para el grupo simulado (Figura 4D).
Estos resultados indican que, después de CCI-ION, las ratas muestran un comportamiento de consumo de leche menos gratificante, y les lleva un tiempo hacer la primera lamida, lo que indica un comportamiento nocifensivo. Sin embargo, CCI-ION no afecta su deseo de llegar a la leche. Además, la disminución de L/F de ratas con CCI-ION indica hipersensibilidad mecánica, ya que L/F es mayor durante condiciones no dolorosas.
Figura 1: Representación esquemática del diseño del estudio. Abreviaturas: OPAD = dispositivo de evaluación del dolor orofacial; CCI-ION = lesión crónica por constricción de los nervios infraorbitarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen representativa de barras con púas y una rata realizando el ensayo. Las barras con púas están hechas de metal de acero inoxidable. La longitud de toda la barra es de 7 cm. La altura de las espigas es de 0,3 cm. La distancia entre las espigas es de 0,5 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Intentos de contacto representativos y datos de lamido de una sola rata operada con CCI-ION y simulada durante la sesión de prueba estándar de 10 minutos al inicio y 2 semanas, 4 semanas y 6 semanas después de la cirugía. Abreviaturas: CCI-ION = lesión crónica por constricción de los nervios infraorbitarios; AS = después de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desarrollo de hipersensibilidad mecánica después de CCI-ION en ratas Sprague-Dawley. (A) Las ratas con CCI-ION (n = 8) tuvieron una disminución significativa en el número de lamidos hasta 4 semanas después de la cirugía y (B) un aumento en la latencia hasta el primer lamido en la semana de la cirugía (semana 0) y 1 semana después de la cirugía (**p < 0.01, *p < 0.05: después de las semanas de cirugía vs. línea de base. #p < 0,05: CCI-ION vs. simulado). No hubo disminución significativa en el grupo simulado (n = 7, p > 0,05). (C) CCI-ION o cirugía simulada no produjo ningún cambio significativo en el número de contactos. (D) Las ratas con CCI-ION mostraron una disminución significativa en L/F en la semana de la cirugía y 3 semanas después y mostraron una tendencia decreciente 2 semanas después de la cirugía. En comparación con las ratas del grupo simulado, esta disminución fue significativamente mayor en ratas CCI-ION y comenzó 1 semana después de la cirugía y continuó hasta 3 semanas después de la cirugía. No hubo diferencia significativa en el grupo simulado (**p < 0,01, *p < 0,05: semanas después de la cirugía vs. línea de base. # p < 0,05: CCI-ION vs. simulado). En los gráficos, la línea roja representa el grupo CCI-ION, y la línea azul representa el grupo simulado. Los datos se presentan como media ± SEM. Las diferencias significativas se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de pruebas de comparación múltiple de Šídák o Dunnett, según correspondiera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El dolor desencadenado por la estimulación mecánica inocua de la cara y la mucosa intraoral es una característica prominente de las condiciones de dolor orofacial, incluyendo la neuralgia del trigémino y los trastornos de la articulación temporomandibular24,25. Aunque el dolor neuropático del trigémino está clínicamente bien descrito, la evaluación de los comportamientos nociceptivos neuropáticos en roedores es un desafío. Los ensayos de dolor que miden los comportamientos reflejos son los métodos más utilizados en la investigación preclínica del dolor. Sin embargo, probar el estrés relacionado con el aparato, la incapacidad de evaluar el estado afectivo y el sesgo del experimentador plantean preocupaciones sobre la utilidad y validez de los ensayos reflejos26.
Este estudio introduce la evaluación de la sensibilidad mecánica en la región orofacial de ratas, demostrando su sensibilidad a CCI-ION utilizando un ensayo de dolor basado en operantes. El mismo sistema operante también se puede utilizar para probar la sensibilidad mecánica de los ratones. Cabe señalar que las cepas de ratón y rata pueden presentar variación en su respuesta a CCI-ION y, por lo tanto, los niveles de hipersensibilidad mecánica pueden diferir. Según nuestra experiencia, las ratas Sprague-Dawley suelen desarrollar una hipersensibilidad mecánica estable 2 semanas después de CCI-ION, comienzan a recuperarse 4 semanas después de CCI-ION y, después de 6 semanas de CCI-ION, vemos la recuperación de la cirugía.
En este protocolo, la hipersensibilidad mecánica se cuantificó midiendo el número de lamidos y los contactos, L/F y latencia hasta el primer lamido. Los datos demostraron que CCI-ION resultó en disminuciones en L / F y el número de respuestas de lamido y aumentos en la latencia a la primera respuesta de lamido, lo que indica que los animales no estaban dispuestos a presionar sus caras contra barras con púas debido al aumento de la sensibilidad al dolor orofacial.
OPAD es un ensayo de conflicto de recompensa en el que los animales deben soportar estímulos nociceptivos para acceder a una recompensa aceptable. El comportamiento de lamer en el ensayo podría verse afectado por el comportamiento apetitivo. Además, en este estudio, utilizamos ratas que tenían vello facial. Con base en la experiencia previa con ensayos de dolor operante, entre los roedores, las cepas sin pelo son mejores para detectar contactos faciales16; Sin embargo, en el momento de la publicación, las cepas de ratas sin pelo ya no estaban disponibles comercialmente. Esto puede considerarse una limitación del estudio. Como también solo se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley, se deben anticipar diferencias relacionadas con el sexo y la cepa en las respuestas al dolor.
También hay algunos pasos críticos para garantizar resultados óptimos con el ensayo. Los datos precisos de lamido y contacto deben aparecer como bloques rojos y blancos sólidos en el software al que se hace referencia, respectivamente (consulte la Figura 3). La distancia entre los picos y la botella de leche es crucial para el éxito del experimento. Si la punta de la botella de leche está demasiado adelante, el animal no hará contacto con los picos y el software no registrará correctamente los contactos ni los números de lamer. Por el contrario, si la botella de leche está demasiado atrás, los contactos se registrarán, pero el animal no podrá alcanzar la leche. Durante las sesiones de entrenamiento, los datos de lamido pueden aparecer como bloques blancos sólidos, ya que la punta de la botella de leche está demasiado adelante. Se convierte en bloques sólidos rojos una vez que la botella de leche se empuja hacia atrás. Por alguna razón, si los datos de lamer comienzan a aparecer como bloques blancos desde la distancia que se observó, empujar un poco la botella y mover el soporte de leche ligeramente hacia abajo / hacia arriba podría ayudar.
Varios puntos también podrían considerarse como limitaciones del sistema de dolor operante orofacial descrito aquí. El entrenamiento de los roedores es necesario y lleva semanas. Antes de cada sesión de prueba, la restricción de alimentos es necesaria en ratones, pero no en ratas. Se ha demostrado que los ratones sin ayuno tienen números de lamido bajos e inconsistentes en comparación con los ratones en ayunas27. Dado que el sistema OPAD es un modelo de conflicto de recompensa, podría verse afectado por el comportamiento apetitivo de los animales o por un medicamento que afecta el apetito. Tener múltiples aparatos también es ventajoso para reducir el tiempo total para probar a los animales, lo que podría aumentar los costos. Sin embargo, los ensayos de dolor operante orofacial siguen siendo ventajosos sobre los ensayos convencionales basados en reflejos, ya que permiten probar múltiples animales al mismo tiempo y limitan la interacción animal-experimentador.
El condicionamiento operante durante los estados de dolor modifica el comportamiento humano y animal de acuerdo con sus consecuencias28. El uso de un modelo de recompensa-conflicto es, por lo tanto, ventajoso para evaluar las condiciones de dolor porque permite a los animales realizar respuestas operantes. Esto es más clínicamente relevante porque las características de los comportamientos operantes involucran intención, motivación y, típicamente, procesamiento cortical29. Como los animales se acercan voluntariamente a la botella de recompensa y pueden retirarse libremente de las barras con púas en cualquier momento, esto integra los centros superiores del cerebro y permite la evaluación de los estados afectivo-motivacionales relacionados con el dolor10. Por lo tanto, los ensayos de dolor operante proporcionan datos superiores al evaluar el dolor y los analgésicos in vivo. También ayudan a comprender los procesos nociceptivos en el sistema trigémino, contribuyendo así al avance del campo del dolor orofacial.
Disclosures
John K. Neubert y Robert M. Caudle son los inventores de la OPAD. Stoelting Co. es el fabricante del OPAD, y Richard Mills es un empleado de Stoelting. Richard Mills, John K. Neubert y Robert M. Caudle son propietarios anteriores de Velocity Laboratories, una compañía que ofrece pruebas de comportamiento de pago por servicio utilizando ensayos de dolor operante.
Acknowledgments
Este estudio está financiado por la Facial Pain Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
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