Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של רגישות יתר מכנית במודל חולדה של כאב אורופציאלי נוירופתי באמצעות מכשיר הערכת כאב אורופציאלי מבוסס אופרנט.
Abstract
לכאב יש מרכיבים חושיים ורגשיים. שלא כמו מבחני כאב מסורתיים המבוססים על רפלקסים, מבחני כאב אופרנטיים יכולים להפיק תוצאות רלוונטיות יותר מבחינה קלינית על ידי התייחסות להיבטים הקוגניטיביים והמוטיבציוניים של כאב במכרסמים. מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת רגישות יתר מכנית בעקבות פגיעה כרונית בהתכווצות העצבים האינפרא-אורביטליים (CCI-ION) בחולדות באמצעות מערכת כאב אופרנטית אורופציאלית. לפני ניתוח CCI-ION, חולדות אומנו במכשיר להערכת כאב אורופציאלי (OPAD) לשתות חלב מרוכז ממותק תוך כדי מגע פנים עם מוטות המתכת המרופדים וצינור הליקוק.
בבדיקה זו, חולדות יכולות לבחור בין קבלת חלב כחיזוק חיובי או בריחה מגירוי מכני מרתיע המיוצר על ידי שורה אנכית של קוצים קטנים בצורת פירמידה בכל צד של חור הגישה לתגמול. לאחר שבועיים של אימונים ב-OPAD ולפני ניתוח CCI-ION, נתוני הרגישות המכנית הבסיסית נרשמו במשך 5 ימים עבור כל חולדה במהלך בדיקת 10 דקות. במהלך הפעלה, מערכת האופרנט מתעדת באופן אוטומטי את מספר הפעלות בקבוק התגמול (ליקוקים) ומגעי הפנים, משך הקשר וההשהיה לליקוק הראשון, בין שאר האמצעים.
בעקבות מדידות בסיסיות, חולדות עברו ניתוח CCI-ION או ניתוח. בפרוטוקול זה כומתה רגישות יתר מכנית על ידי מדידת מספר הליקוקים, ההשהיה לליקוק הראשון, מספר המגעים והיחס בין ליקוקים למגעי פנים (L/F). הנתונים הראו כי CCI-ION הביא לירידה משמעותית במספר הליקוקים וביחס L/F ולעלייה בהשהיה לליקוק הראשון, מה שמעיד על רגישות יתר מכנית. נתונים אלה תומכים בשימוש במבחני כאב מבוססי אופרנטים להערכת רגישות מכנית לכאב במחקרי כאב פרה-קליניים.
Introduction
כאב כרוני משפיע על מיליוני אמריקאים מדי שנה1. למרבה הצער, כאב כרוני הוא מאתגר לטיפול, שכן הטיפולים הקיימים אינם יעילים יחסית בהקלה על כאב כרוני ולעתים קרובות יש להם תופעות לוואי לא רצויות עם שימוש ארוך טווח 2,3,4. מבחני כאב פרה-קליניים מסורתיים, כגון מבחן פון פריי, מסתמכים על תוצאות רפלקסיביות או תגובות מעוררות כאב5. בעוד שמבחן פון פריי שימש במשך עשרות שנים למדידת אלודיניה מכנית, הוא רגיש למספר גורמים מבלבלים, בעיקר הטיית הניסוי6. השימוש בבדיקות פון פריי להערכת כאבים אורופציאליים הוא בעייתי גם בשל מידת האיפוק הדרושה כדי לאבטח את ראשו של בעל החיים כדי לבחון בהצלחה את אזור הפנים, מה שעלול לייצר השפעות לחץ לא רצויות, כגון שיפור הכאב או להפך, משכך כאבים הנגרם על ידי מתח.
התנהגויות מעוררות כאב רגישות גם לתוצאות חיוביות כוזבות7 ואינן מביאות בחשבון את המרכיב הרגשי של הכאב, שהוא חלק בלתי נפרד מחוויית הכאב האנושית8. לכן, יש עניין גובר בשימוש במודלים אופרנטיים של כאב המעריכים התנהגויות מדוכאות כאב המקיפות הן את המרכיבים החושיים והן את המרכיבים הרגשיים של הכאב כדי לשפר את התוכן ואת תוקף הניבוי בבדיקות פרה-קליניות. מבחן הערכת הכאב האורפציאלי האופרנטי המתואר כאן מבוסס על פרדיגמת תגמול-קונפליקט 9,10,11. בבדיקה זו, המכרסם יכול לבחור בין קבלת חיזוק חיובי לבין הכפפת עצמו לגירוי nociceptive או לוותר על הפרס ולהימנע מגירוי nociceptive, ובכך לשלוט על כמות הכאב שהוא חווה. שלא כמו מבחני כאב מסורתיים, הבדיקה המבוססת על אופרנט היא בלתי תלויה בניסוי ואינה רגישה לתוצאות חיוביות שגויות עקב השפעות הרגעה לא רצויות.
תחושות רעילות מהראש ומהפנים נישאות על ידי הענפים האופטלמיים, המקסילריים והמנדיבולריים של העצב הטריגמינלי. פציעה או דלקת של העצב הטריגמינלי מגבירה את הרגישות של נוירונים חושיים לגירויים תרמיים או מכניים12,13,14,15. מבחני כאב אורופציאליים מבוססי אופרנט מספקים מדידה אוטומטית של כאב אורופציאלי תרמי או מכני המועבר על ידי העצב הטריגמינלי במכרסמים 11,12,16,17,18. גירוי עם גירויים לא מזיקים ומזיקים הוא הבחנה חשובה בין בדיקת אלודיניה תרמית ומכנית והיפראלמגרסיה באזור האורופאציאלי עם OPAD, מכיוון שהם עשויים לייצג ביטויים של מנגנונים בסיסיים שונים.
בבדיקה התרמית האורופציאלית, בעלי חיים לוחצים על פניהם כנגד תרמודות חלקות כדי לגשת לתגמול. ניתן לכוון את התרמודות לטמפרטורות קרירות, חמות וחמות שונות, ובכך לאפשר הערכה של התנהגות בתנאים ניטרליים או נוסיצפטיביים. בבדיקה המכנית האורופציאלית, בעלי חיים לוחצים את פניהם כנגד מוטות מחודדים במהלך ניסויים אופרנטיים; מכיוון שקוצים אלה גורמים לרמה מסוימת של אי נוחות, מכרסמים עשויים לשתות פחות כאשר פניהם נוגעות בקוצים לעומת המשטחים החלקים של התרמודות. לפיכך, הבדיקה המכנית האורופציאלית האופרנטית יכולה להעריך את ההשפעה של דרגות שונות של גירוי נוסיצפטיבי מכני. הוכחנו בעבר כי OPAD היא שיטה שימושית ואמינה להעריך תרמיתחריפה 9, כמו גם מכניחריף 19, nociception ו hyperalgesia.
מאמר זה מדווח על שימוש בגרסה חדשה שפותחה של OPAD כדי להעריך תפיסה מכנית ורגישות יתר. בנוסף, באמצעות אימות, אנו מדגימים את היכולת של CCI-ION לגרום לנוירופתיה כרונית שמביאה לתגובה צפויה ב-OPAD. כמו כן מפורט כיצד להשתמש OPAD ואת התוכנה המשויכת אליו כדי להשיג ולנתח במהירות נתונים התנהגותיים מכרסמים.
Protocol
כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פלורידה ועמדו בתקנים הקבועים במדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כאן, ההערכה של רגישות יתר מכנית באמצעות OPAD מתוארת באמצעות מודל חולדה של כאב נוירופתי אורופציאלי. שרטוט של ציר הזמן שבו נעשה שימוש במחקר מוצג באיור 1. כל ההערכות ההתנהגותיות בוצעו על ידי נסיינים.
1. בעלי חיים
- נקבות בית חולדות ספראג-דאולי (n = 8/קבוצה, 150-200 גרם) בזוגות בחדר מבוקר טמפרטורה (22 °C ± 1 °C) עם מחזור אור-חושך של 12 שעות:12. לספק מזון ומים ad libitum. השאירו את החולדות במתקן למשך 5 ימים לצורך התאקלמות לפני הניסויים.
- בצע את מבחני הכאב האופרנטי באותו יום בשבוע ובאותו שעה (9:00-11:00).
- בסוף הניסויים, מרדימים את החולדות על ידי עריפת ראשים לאחר הרדמה איזופלורן.
2. הגדרת OPAD
- הניחו מגשי טפטוף חלב, כלובי פרספקס וסורגים לריצוף מתכת על ה-OPAD. הצמידו חיווט לכלובים. החלק את מחזיק הבקבוק על מוט המתכת בגב המכשיר.
- הכינו יחס של 2:1 בין מים לחלב מרוכז ממותק כתמיסת התגמול על ידי פתיחת פחית חלב מרוכז ממותק ומזיגה לתוך של 1 ליטר. הוסף ~ 600 מ"ל של מי ברז ל 300 מ"ל של חלב. בתחילה מערבבים את הפתרון באמצעות כף, ולאחר מכן להשתמש בר ערבוב ואת מערבל צלחת חמה. לאחר מכן, מלאו את בקבוקי התגמול בתמיסת החלב ושמרו על תמיסת החלב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: כסו את תמיסת החלב בניילון נצמד מזון. יש לחמם את תמיסת החלב לפני כל שימוש. מלאי תמיסת חלב במקרר יכול להקריש לאחר שבוע. כאשר הוא מתקרש, הוא עלול לסתום את צינור הליקוק. לכן, להשליך אותו ולהכין פתרון מלאי חדש. - הניחו את בקבוקי החלב על מחזיק הבקבוק והתאימו אותם כך שהפיה תוכל להגיע לבעל החיים. הדקו את הידית השמאלית של המחזיק כדי להצמיד את הבקבוק למקומו.
- הפעל את הכלובים באמצעות המתג בלוח הקדמי.
3. הגדרת פרוטוקול ויצירת קובץ ניסוי
הערה: תחילה, הגדר את הפרוטוקול להפעלת הניסוי. הפרוטוקול מתאר כיצד תוכנת ANY-maze מבצעת את הניסוי.
- פתח את התוכנה. הקלד את הסיסמה. לחץ על רשום אותי או לחץ על Enter.
- לחץ על ניסוי ריק חדש | תפריט פרוטוקול .
- בחר את המצב שבו פרוטוקול זה ישתמש ותן שם לפרוטוקול. תחת מכשיר, לחץ על פרוטוקול ללא שם, לחץ על המקטע בחר את המצב שבו פרוטוקול זה ישתמש , ותחת מצבים ספציפיים לציוד, בחר מצב כלוב מכני OPAD ולחץ על אישור. לאחר מכן, תן שם לפרוטוקול (לדוגמה, OPAD מכני).
- הוסף כלובי OPAD.
- תחת מכשיר, לחץ על מנגנון | הוספת פריט שנמצא בחלק העליון של חלונית הפרוטוקול | כלוב OPAD חדש | הוסף את כל כלובי OPAD המחוברים.
הערה: לפני הוספת הכלובים, ודא שכל הכלובים מופעלים.
- תחת מכשיר, לחץ על מנגנון | הוספת פריט שנמצא בחלק העליון של חלונית הפרוטוקול | כלוב OPAD חדש | הוסף את כל כלובי OPAD המחוברים.
- הוסף שלבי בדיקת ניסוי.
- תחת בדיקה, לחץ על שלבים | שלב ראשון ושם שלב (לדוגמה, יום בסיס 1). הקלד 10 דקות למשך הבדיקה. כדי להוסיף שלבים נוספים, לחץ על הוסף פריט שנמצא בחלק העליון של חלונית הפרוטוקול | שלב חדש.
הערה: כל שלב מתייחס להפעלה כאשר מתבצעת בדיקה. לדוגמה, במשך 10 ימים של אימון, 10 שלבים נדרשים. ניתן להגדיל או להקטין את משך הבדיקה בהתאם לתכנון הניסוי.
- תחת בדיקה, לחץ על שלבים | שלב ראשון ושם שלב (לדוגמה, יום בסיס 1). הקלד 10 דקות למשך הבדיקה. כדי להוסיף שלבים נוספים, לחץ על הוסף פריט שנמצא בחלק העליון של חלונית הפרוטוקול | שלב חדש.
- הקצה קבוצות טיפול.
- תחת מידע נוסף, לחץ על קבוצות טיפול. סמן את האפשרות השתמש בקבוצות טיפול | המשתמש יקצה ידנית את בעלי החיים לקבוצות שלהם.
הערה: התוכנה המופנית (ראה טבלת החומרים) מאפשרת גם להקצות בעלי חיים באופן אקראי או בסדר מסוים. ניסויים יכולים להיות עיוורים. כדי לראות את קבוצות הטיפול שהוקצו, בטל את הסימון של הפעל ניסויים עיוורים.
- תחת מידע נוסף, לחץ על קבוצות טיפול. סמן את האפשרות השתמש בקבוצות טיפול | המשתמש יקצה ידנית את בעלי החיים לקבוצות שלהם.
- הקצה מזהי בעלי חיים (ID).
- לחץ על תפריט פרוטוקול ; תחת מידע נוסף, לחץ על מזהה בעלי חיים וסמן את האפשרות השתמש בתעודות המזהות שלי כדי להתייחס לבעלי חיים.
- לחץ על תפריט ניסוי .
- הקלד כותרת של ניסוי.
- תן שם לטיפולים על ידי לחיצה על הצג טיפולים, והקלד את שמות הטיפולים (לדוגמה, טיפול 1: CCI-ION, טיפול 2: sham).
- הוסף בעלי חיים והקצה טיפולים ומזהי בעלי חיים על-ידי לחיצה על הצג בעלי חיים | הוסיפו בעלי חיים, הזינו את מספר בעלי החיים שייבדקו ולחצו על הלחצן 'אשר'. המתן עד שרשימת בעלי החיים תופיע והוסף תעודות זהות וטיפולים של בעלי חיים לכל חולדה.
הערה: רשימת מצב המופיעה לצד מזהה בעל החיים תוגדר כרגיל בתחילת המחקר. מאוחר יותר ניתן להסיר בעלי חיים מלוח הזמנים של הניסויים על-ידי שינוי הסטטוס שלהם ל'הוצא משימוש ' או 'נמחק'.
- שמור את הפרוטוקול על-ידי לחיצה על תפריט פרוטוקול | שמור פרוטוקול שנמצא בחלק העליון של חלונית הפרוטוקול . הקלד את שם הקובץ ואת סיסמת התוכנה (ANY-maze) ולחץ על שמור.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפרוטוקולים שמורים לניסויים חדשים. - שמור את קובץ הניסוי על-ידי לחיצה על קובץ | שמור, הקלד את סיסמת התוכנה ולחץ על שמור.
4. אימונים ובדיקות בסיסיות
הערה: הביאו חולדות לחדר לפחות 15 דקות לפני הבדיקה אם חדר הבדיקה ההתנהגותי נמצא באותו מתקן דיור לבעלי חיים. אם הם מועברים לחדר ניסויים מחוץ למתקן בעלי החיים, תנו לחולדות שעה אחת להתאקלם לחדר.
- לפני ההקלטות הבסיסיות, אימנו את החולדות ב-OPADs במשך שבועיים (5 ימים בשבוע, 10 דקות ביום) ללחוץ את פניהן על מוטות המתכת המחורצים כדי לקבל את תמיסת החלב.
הערה: תמונה מייצגת של מוטות מחודדים וחולדה המבצעת את הבדיקה מוצגת באיור 2. - הגדר את ציוד OPAD.
- הפעל את הכלובים באמצעות המתג בלוח הקדמי. חפשו את האור הירוק על הכלוב, מה שאומר שהכלוב מוכן לבדיקה.
- לחץ פעמיים על קובץ הניסוי שנשמר כדי לפתוח אותו. הקלד את הסיסמה. לחץ על רשום אותי או לחץ על Enter.
- המתן עד שתפריט הבדיקות יופיע. בצד שמאל של המסך, רשום לעצמך את מספר בעלי החיים ואת הכלוב המתאים (לדוגמה, Animal 1 ייבדק בכלוב 1), השלב שיופעל באותו יום ומצב הבדיקה ("מוכן"). בצד ימין של המסך, התבונן בתרשים של כל חיה המציג את מספרי הליקוקים והמגעים.
- שימו לב למסך הכלובים המציג את תעודת הזהות של החיה הנבדקת. הכניסו כל חולדה לכלוב המתאים ולחצו פעמיים על הכפתור בכלוב. שימו לב שהנורית הירוקה תהפוך לאור כתום ברגע שהבדיקה תתחיל, וצליל אזהרה יישמע בסיום הבדיקה.
- במשך היומיים הראשונים של האימון, הכניסו את בקבוקי החלב לחלוטין לכלוב כדי לאפשר לחולדות לשתות חלב מבלי ליצור מגע עם הגירוי.
- בימים 3-8 של האילוף, ברגע שהחיות מתחילות לשתות, הזיזו את הבקבוקים בהדרגה לאחור כדי לעודד את החולדות ללחוץ את פניהן על הסורגים המחורצים.
- בימים 9-10 של האילוף, לאחר שהחיות לוחצות באופן מלא על הפסים המחוררים ומספרי הליקוקים עקביים (מינימום של 500 ליקוקים במהלך 10 דקות הניסוי), שימו לב למיקום בקבוק החלב של כל חיה והשתמשו במרחק זה להקלטות בסיסיות.
- לאחר שבועיים של אימונים, אספו נתונים ממרחק בקבוק החלב שצוין במשך 5 ימים כנקודת ההתחלה (10 דקות ביום).
5. אינדוקציה של כאב נוירופתי אורופציאלי והערכה של רגישות יתר מכנית
הערה: לאחר מדידות בסיסיות, חולדות עברו ניתוח CCI-ION, שכלל קשירה דו-צדדית של ה-ION, כפי שתואר קודםלכן 20. חולדות ההדברה עברו ניתוח בושה. לא נעשה שימוש במשכך כאבים לפני או אחרי הניתוח בהליך מכיוון שהוא יכול לשנות את מהלך הזמן של הנוירופתיה. אזהרה: יש לנטרל פסולת איזופלורן דרך מכלי פחם. יש להשליך את להבי האזמל והמחטים לפסולת ביולוגית.
- מרדימים את החולדה בחדר האינדוקציה בתערובת של O2 (1 L/min) ו-4% איזופלוראן ושומרים על מצב ההרדמה עם חרוט אף מיוחד למשך הניתוח.
- הניחו את החולדה המורדמת על שולחן עבודה כירורגי וריסנו אותה. שמור על טמפרטורת הגוף ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום. יש למרוח משחת עיניים על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטה של הבוהן והתחל את ההליך כאשר רפלקס נסיגת הבוהן כבר לא נצפה.
- בצע את ההליך הכירורגי תחת מיקרוסקופ סטריאו. פתח את הפה באמצעות retractors ולחזור את השפה באמצעות קליפס קטן.
- בצע חתך קטן בין המסטיק הגבי לשפה באמצעות להב אזמל (#15). חותכים בעדינות רקמות רכות באמצעות קצה להב האזמל כדי לחשוף ענף של ה-ION.
- הניחו שתי ליגטורות של המעי הכרומי (#5-0) סביב ה-ION בעזרת מחט מזרק קהה וכפופה.
- סגור את הפצע באמצעות דבק רקמות.
- עבור ניתוח sham, לחשוף את ION באמצעות אותו הליך אבל לא ligate את העצב.
- לאחר הניתוח, יש לספק צ'או מכרסם מרוכך בחלב למשך יומיים כדי לעודד אכילה ולמנוע התייבשות.
- בדקו את החולדות ב-OPAD יום לאחר הניתוח במשך 3 ימים רצופים ולאחר מכן 3 ימים בשבוע (למשל, כל שלישי, חמישי ושישי) במשך השבועות הבאים עד שמספרי הליקוק יגיעו לערכי הבסיס שלהם.
הערה: משך הרגישות המכנית המושרה על-ידי CCI-ION יכול להיות תלוי במין, במתח של המכרסם שבו נעשה שימוש ובביצועי הנסיין. לכן, ייתכן שלא יהיה זה מדויק לציין משך זמן מסוים לניסויים בבעלי חיים. לפיכך, בדיקה עד שמספרי ליקוק מגיעים לערכי בסיס היא מדויקת יותר.
6. ניקוי המכשיר
- בסיום הבדיקה, צא מהתוכנה על ידי לחיצה על סמל x בפינה השמאלית העליונה והמתן עד שהנתונים יישמרו באופן אוטומטי.
- כבה את הכלובים באמצעות המתג בלוח הקדמי.
- נתקו את החוטים מסורגי ריצוף המתכת. הסירו ושטפו את מגשי טפטוף החלב, כלובי הפרספקס, סורגי ריצוף המתכת ומחזיקי הבקבוקים בסבון כלים. שים הכל על מתלה הייבוש.
- נגבו את מוטות המתכת, את מכשיר הבדיקה ואת ספסלי המעבדה באמצעות 70% אלכוהול איזופרופיל.
הערה: המכשירים צריכים להיות מטופלים בזהירות. השתמשו במברשות רכות בזמן שאתם מנקים את בקבוקי החלב ומלקקים את הצינורות. ציוד מלוכלך יכול להוביל להצטברות חיידקים.
7. ניתוח נתונים
- לחץ פעמיים על קובץ הניסוי כדי לפתוח אותו.
- לחץ על תפריט התוצאות . בחר אילו אמצעים (כלומר, ללקק, ליצור קשר) או ימי בדיקה לראות.
- לחצו על 'טקסט' או 'גרף' או 'סטטיסטי' שנמצאים בראש החלונית 'תוצאות' כדי לראות מלל, גרף או דוח ניתוח סטטיסטי.
- כדי לראות את הנתונים הגולמיים, לחץ על תפריט נתונים . לחץ על שמור בחלק העליון של החלונית Data כדי לשמור את הנתונים כגיליון אלקטרוני או לחץ על שלח כדי לקבל אותם בדואר אלקטרוני.
- כדי לשנות או להוסיף משתנים נוספים לתצוגה, לחץ על בחר נתונים, בחר את המידות ולחץ על הצג גיליון אלקטרוני.
- ניתוח סטטיסטי
- גזור באופן אוטומטי את מספר הליקוקים והמגעים ואת ההשהיה לליקוק הראשון מהתוכנה וייצא את הנתונים מהתוכנה לגיליון אלקטרוני.
- חשב את יחס L/F כמדד של רגישות יתר על-ידי חלוקת מספר הליקוקים במספר המגעים21,22,23.
הערה: במחקר זה, אחת החולדות בקבוצת ה-sham לא נכללה במחקר בשל מספרי ליקוקים נמוכים (<500 ליקוקים) לפני הניתוח. - נתחו את המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בין L/F, את מספר הליקוקים והמגעים, ואת ההשהיה לליקוק הראשון באמצעות מדידות דו-כיווניות חוזרות ANOVA ולאחר מכן את ההשוואות המרובות של Dunnett או את מבחני ההשוואות המרובות של Šídák במידת הצורך.
הערה: P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. הנתונים הוצגו כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
Representative Results
דוגמה לליקוקים של חולדה בודדת על בקבוק התגמול ולמגעים עם מוטות המתכת המחורצים בנקודת ההתחלה ושבועיים, 4 שבועות ו-6 שבועות לאחר הניתוח מוצגת באיור 3. במהלך התקופות שאינן מזיקות, חולדות בדרך כלל מקיימות אימונים ארוכים של שתייה (למשל, בנקודת ההתחלה ובהתאוששות לאחר CCI-ION: שבוע 6 בתמונה), ובעקבות CCI-ION, מספרי הליקוקים יורדים מכיוון שהן לא יכולות לשמור על מגע פנים עם הסורגים המסולסלים במשך זמן רב (איור 3A), ללא שינויים משמעותיים בתקופות השתייה בקבוצת הבושה (איור 3B).
אצל חולדות עם CCI-ION הייתה ירידה משמעותית במספר הליקוקים עד 4 שבועות לאחר הניתוח ועלייה בחביון לליקוק ראשון בשבוע הניתוח (שבוע 0) ושבוע לאחר הניתוח בהשוואה לנקודת ההתחלה. לא היה שינוי משמעותי בקבוצת הבושה (איור 4A,B). CCI-ION הביא לירידה במספר המגעים, אך הבדל זה לא היה משמעותי (איור 4C). CCI-ION גם גרם לירידה משמעותית ב-L/F, והירידה בקבוצת ה-CCI-ION הייתה גדולה יותר מהירידה בקבוצת ה-sham (איור 4D).
התוצאות האלה מצביעות על כך שבעקבות CCI-ION, חולדות מראות פחות התנהגות של שתיית חלב מתגמלת, ולוקח להן זמן לבצע את הליקוק הראשון, מה שמעיד על התנהגות נוסיפנסיבית. עם זאת, CCI-ION אינו משפיע על הרצון שלהם להגיע לחלב. בנוסף, הירידה ב-L/F של חולדות עם CCI-ION מצביעה על רגישות יתר מכנית, שכן L/F גבוה יותר במצבים שאינם כואבים.
איור 1: ייצוג סכמטי של תכנון המחקר. קיצורים: OPAD = מכשיר להערכת כאב; CCI-ION = פגיעה כרונית בהתכווצות של העצבים האינפרא-אורביטליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונה מייצגת של מוטות מחודדים וחולדה המבצעת את הבדיקה. מוטות מחודדים עשויים מתכת נירוסטה. אורך הבר כולו 7 ס"מ. גובה הקוצים הוא 0.3 ס"מ. המרחק בין הקוצים הוא 0.5 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניסיונות מגע מייצגים ונתוני ליקוק של חולדה אחת המנותחת על ידי CCI-ION ו-sham במהלך סשן הבדיקה הסטנדרטי של 10 דקות בנקודת ההתחלה ושבועיים, 4 שבועות ו-6 שבועות לאחר הניתוח. קיצורים: CCI-ION = פגיעה כרונית בהתכווצות של העצבים האינפרא-אורביטליים; AS = לאחר ניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: התפתחות רגישות יתר מכנית בעקבות CCI-ION בחולדות ספראג-דאולי. (A) בחולדות עם CCI-ION (n = 8) הייתה ירידה משמעותית במספר הליקוקים עד 4 שבועות לאחר הניתוח ו-(B) עלייה בהשהיה לליקוק ראשון בשבוע הניתוח (שבוע 0) ושבוע לאחר הניתוח (**p < 0.01, *p < 0.05: שבועות לאחר הניתוח לעומת נקודת ההתחלה. #p < 0.05: CCI-ION לעומת בושה). לא נרשמה ירידה משמעותית בקבוצת ה-sham (n = 7, p > 0.05). (C) ניתוח CCI-ION או sham לא הביא לשינוי משמעותי במספר המגעים. (D) חולדות עם CCI-ION הראו ירידה משמעותית ב-L/F בשבוע הניתוח ו-3 שבועות לאחר הניתוח והפגינו מגמת ירידה שבועיים לאחר הניתוח. בהשוואה לחולדות מקבוצת ה-sham, ירידה זו הייתה גבוהה משמעותית בחולדות CCI-ION והחלה שבוע לאחר הניתוח ונמשכה עד 3 שבועות לאחר הניתוח. לא היה הבדל משמעותי בקבוצת הבושה (**p < 0.01, *p < 0.05: לאחר ניתוח שבועות לעומת קו בסיס. # p < 0.05: CCI-ION לעומת sham). בתרשימים, הקו האדום מייצג את קבוצת CCI-ION, והקו הכחול מייצג את קבוצת הבושה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. הבדלים משמעותיים נותחו על ידי מדדים חוזרים דו-כיווניים ANOVA ואחריהם מבחני ההשוואה המרובים של Šídák או Dunnett, לפי הצורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
כאב המופעל על ידי גירוי מכני מזיק של הפנים ושל הרירית התוך-אוראלית הוא מאפיין בולט של מצבי כאב אורופציאליים, כולל נוירלגיה טריגמינלית והפרעות מפרקים טמפורומנדיבולריות24,25. למרות שכאב נוירופתי טריגמינלי מתואר היטב מבחינה קלינית, ההערכה של התנהגויות נוירופתיות נוסיצפטיביות במכרסמים היא מאתגרת. מבחני כאב המודדים התנהגויות רפלקסיביות הן השיטות הנפוצות ביותר במחקרי כאב פרה-קליניים. עם זאת, בדיקת מתח הקשור למכשירים, חוסר היכולת להעריך את המצב הרגשי והטיית הניסוי מעלים חששות לגבי התועלת והתוקף של מבחני רפלקס26.
מחקר זה מציג את הערכת הרגישות המכנית באזור האורופציאלי של חולדות, ומדגים את רגישותו ל- CCI-ION באמצעות בדיקת כאב מבוססת אופרנט. אותה מערכת אופרנטית יכולה לשמש גם לבדיקת הרגישות המכנית של עכברים. יש לציין כי זני עכברים וחולדות יכולים להפגין שונות בתגובתם ל- CCI-ION, ולכן, רמות הרגישות המכנית יכולות להיות שונות. בהתבסס על הניסיון שלנו, חולדות Sprague-Dawley בדרך כלל מפתחות רגישות יתר מכנית יציבה שבועיים לאחר CCI-ION, הן מתחילות להתאושש 4 שבועות לאחר CCI-ION, ולאחר 6 שבועות של CCI-ION, אנו רואים התאוששות מהניתוח.
בפרוטוקול זה, רגישות יתר מכנית כומתה על ידי מדידת מספר הליקוקים והמגעים, L/F, וההשהיה לליקוק הראשון. הנתונים הראו כי CCI-ION הביא לירידה ב-L/F ולמספר תגובות הליקוק ולעלייה בהשהיה לתגובת הליקוק הראשונה, מה שמצביע על כך שבעלי חיים לא היו מוכנים ללחוץ את פניהם כנגד מוטות מחודדים עקב רגישות מוגברת לכאב אורופציאלי.
OPAD הוא מבחן תגמול-קונפליקט שבו בעלי חיים חייבים לסבול גירויים nociceptive כדי לגשת לתגמול טעים. התנהגות הליקוק בבדיקה עלולה להיות מושפעת מהתנהגות מעוררת תיאבון. בנוסף, במחקר הזה השתמשנו בחולדות עם שיער פנים. בהתבסס על ניסיון קודם עם מבחני כאב אופרנטיים, בקרב מכרסמים, זנים חסרי שיער טובים יותר לאיתור מגעי פנים16; עם זאת, בזמן הפרסום, זני חולדות חסרי שיער כבר לא היו זמינים מסחרית. זה יכול להיחשב מגבלה של המחקר. מכיוון שהשתמשנו גם רק בחולדות ספראג-דאולי, יש לצפות להבדלים הקשורים למין ולמתח בתגובות לכאב.
ישנם גם כמה שלבים קריטיים להבטחת תוצאות אופטימליות עם הבדיקה. נתוני ליקוק ומגע מדויקים חייבים להופיע כגושים אדומים ולבנים מוצקים בתוכנה המוזכרת, בהתאמה (ראו איור 3). המרחק בין הקוצים לבקבוק החלב הוא קריטי להצלחת הניסוי. אם קצה בקבוק החלב רחוק מדי קדימה, החיה לא תיצור מגע עם הקוצים, והתוכנה לא תרשום נכון אנשי קשר או תלקק מספרים. לעומת זאת, אם בקבוק החלב רחוק מדי, מגעים יירשמו, אך החיה לא תוכל להגיע לחלב. במהלך אימונים, נתוני הליקוק עשויים להיראות כגושים לבנים מוצקים, מכיוון שקצה בקבוק החלב רחוק מדי קדימה. הוא משתנה לגושים מוצקים אדומים ברגע שבקבוק החלב נדחף לאחור. מסיבה כלשהי, אם נתוני הליקוק מתחילים להופיע כגושים לבנים מהמרחק שצוין, דחיפת הבקבוק מעט והזזת מחזיק החלב מעט כלפי מטה/כלפי מעלה עשויה לעזור.
מספר נקודות עשויות להיחשב גם כמגבלות של מערכת הכאב האופרנטית האורפציאלית המתוארת כאן. הכשרת המכרסמים נחוצה ונמשכת שבועות. לפני כל בדיקה, יש צורך בהגבלת מזון בעכברים, אך לא בחולדות. הודגם כי לעכברים ללא צום יש מספרי ליקוק נמוכים ולא עקביים בהשוואה לעכברים בצום27. מכיוון שמערכת OPAD היא מודל של קונפליקט תגמול, היא עשויה להיות מושפעת מההתנהגות מעוררת התיאבון של בעלי החיים או מתרופה שמשפיעה על התיאבון. ריבוי מכשירים הוא גם יתרון לקיצור הזמן הכולל לניסויים בבעלי החיים, מה שעשוי לייקר את העלויות. עם זאת, מבחני כאב אופרנטיים אורופציאליים הם עדיין יתרון על פני מבחנים קונבנציונליים מבוססי רפלקס, מכיוון שהם מאפשרים ניסויים במספר בעלי חיים בו זמנית ומגבילים את האינטראקציה בין בעלי חיים לנסיינים.
התניה אופרנטית במהלך מצבי כאב משנה את התנהגות האדם ובעלי החיים בהתאם לתוצאותיהם28. שימוש במודל תגמול-קונפליקט הוא, אם כן, יתרון להערכת מצבי כאב מכיוון שהוא מאפשר לבעלי החיים לבצע תגובות אופרנטיות. זה רלוונטי יותר מבחינה קלינית מכיוון שהמאפיינים של התנהגויות אופרנטיות כרוכים בכוונה, מוטיבציה, ובדרך כלל, עיבוד קליפת המוח29. כאשר בעלי חיים מתקרבים מרצונם לבקבוק התגמול ויכולים לסגת בחופשיות מהברים המחורצים בכל עת, זה משלב מרכזים גבוהים יותר של המוח ומאפשר הערכה של מצבים רגשיים-מוטיבציוניים הקשורים לכאב10. לפיכך, מבחני כאב אופרנטיים מספקים נתונים מעולים בעת הערכת כאב ומשככי כאבים in vivo. הם גם מסייעים להבין את התהליכים הנוסיצפטיביים במערכת הטריגמינלית, ובכך תורמים לקידום שדה הכאב האורופאציאלי.
Disclosures
ג'ון ק. נויברט ורוברט מ. קאודל הם ממציאי ה- OPAD. Stoelting ושות' היא היצרנית של OPAD, וריצ'רד מילס הוא עובד של סטואלטינג. דמי הפרסום שולמו על ידי Stoelting Co. ריצ'רד מילס, ג'ון ק. נויברט ורוברט מ. קאודל הם הבעלים הקודמים של מעבדות Velocity, חברה המספקת בדיקות התנהגותיות בתשלום עבור שירות באמצעות מבחני כאב אופרנטיים.
Acknowledgments
מחקר זה ממומן על ידי הקרן לחקר כאבי פנים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
