Summary
Denne protokollen beskriver vurderingen av mekanisk overfølsomhet i en rottemodell av nevropatisk orofacial smerte ved hjelp av en operantbasert orofacial smertevurderingsenhet.
Abstract
Smerte har sensoriske og affektive komponenter. I motsetning til tradisjonelle, refleksbaserte smerteanalyser, kan operant smerteanalyser gi mer klinisk relevante resultater ved å ta opp de kognitive og motiverende aspektene av smerte hos gnagere. Denne artikkelen presenterer en protokoll for vurdering av mekanisk overfølsomhet etter kronisk innsnevringsskade av infraorbitale nerver (CCI-ION) hos rotter ved bruk av et orofacial operant smertesystem. Før CCI-ION-kirurgi ble rotter trent i en orofacial smertevurderingsenhet (OPAD) for å drikke søtet kondensert melk mens de fikk ansiktskontakt med metallpiggede stenger og slikkerør.
I denne analysen kan rotter velge mellom å motta melk som en positiv forsterker eller unnslippe en aversiv mekanisk stimulus som produseres av en vertikal rad med små pyramideformede pigger på hver side av belønningstilgangshullet. Etter 2 ukers trening i OPAD og før CCI-ION-operasjonen, ble mekaniske sensitivitetsdata ved baseline registrert i 5 dager for hver rotte i løpet av en 10 min testøkt. Under en økt registrerer operantsystemet automatisk antall aktiveringer av belønningsflasker (slikker) og ansiktskontakter, kontaktvarighet og ventetid til første slikk, blant andre tiltak.
Etter baseline målinger gjennomgikk rotter enten CCI-ION eller humbug kirurgi. I denne protokollen ble mekanisk overfølsomhet kvantifisert ved å måle antall slikker, latens til første slikk, antall kontakter og forholdet mellom slikker og ansiktskontakter (L/F). Dataene viste at CCI-ION resulterte i en signifikant reduksjon i antall slikker og L / F-forholdet og en økning i latensen til den første slikken, noe som indikerer mekanisk overfølsomhet. Disse dataene støtter bruken av operantbaserte smerteanalyser for å vurdere mekanisk smertefølsomhet i preklinisk smerteforskning.
Introduction
Kronisk smerte påvirker millioner av amerikanere årlig1. Dessverre er kronisk smerte utfordrende å behandle, da eksisterende terapier er relativt ineffektive for å redusere kronisk smerte og ofte har uønskede bivirkninger med langvarig bruk 2,3,4. Tradisjonelle prekliniske smerteanalyser, som von Frey-analysen, er avhengige av refleksive utfall eller smertestimulerte responser5. Mens von Frey-analysen har blitt brukt i flere tiår for å måle mekanisk allodyni, er den utsatt for flere forstyrrende faktorer, spesielt eksperimentell bias6. Bruken av von Frey-testing for å evaluere orofacial smerte er også problematisk på grunn av graden av tilbakeholdenhet som trengs for å sikre dyrets hode for å kunne teste ansiktsområdet, noe som kan gi uønskede stresseffekter, for eksempel å øke smerte eller omvendt stressindusert analgesi.
Smertestimulert atferd er også utsatt for falske positive utfall7 og tar ikke hensyn til den affektive komponenten av smerte, som er integrert i den menneskelige smerteopplevelsen8. Derfor er det en økende interesse for å bruke operant smertemodeller som vurderer smerte-deprimert atferd som omfatter både sensoriske og affektive komponenter av smerte for å forbedre innholdet og prediktiv validitet i preklinisk testing. Den operant orofacial smertevurderingsanalysen som er beskrevet her, er basert på et belønningskonfliktparadigme 9,10,11. I denne analysen kan gnageren velge mellom å motta en positiv forsterker og utsette seg for en nociceptiv stimulus eller avstå fra belønningen og unngå den nociceptive stimulansen, og dermed kontrollere mengden smerte den opplever. I motsetning til tradisjonelle smerteanalyser er den operantbaserte analysen eksperimentuavhengig og er ikke utsatt for falske positive utfall på grunn av uheldige beroligende effekter.
Skadelige opplevelser fra hodet og ansiktet bæres av oftalmiske, maksillære og mandibulære grener av trigeminusnerven. Skade eller betennelse i trigeminusnerven øker følsomheten til sensoriske nevroner for termiske eller mekaniske stimuli12,13,14,15. Operantbaserte orofaciale smerteanalyser gir en automatisert måling av termisk eller mekanisk orofacial smerte overført av trigeminusnerven hos gnagere 11,12,16,17,18. Stimulering med ikke-skadelige og skadelige stimuli er et viktig skille mellom testing av termisk og mekanisk allodyni og hyperalgesi i det orofaciale området med OPAD, da de kan representere manifestasjoner av forskjellige underliggende mekanismer.
I den orofaciale termiske analysen presser dyrene ansiktet mot glatte termoder for å få tilgang til belønningen. Termodene kan stilles inn på forskjellige kjølige, varme og varme temperaturer, og tillater dermed vurdering av oppførsel under nøytrale eller nociceptive forhold. I den orofaciale mekaniske analysen presser dyrene ansiktet mot piggete stenger under operanttesting; Siden disse piggene forårsaker et visst nivå av ubehag, kan gnagere drikke mindre når ansiktene deres berører piggene kontra termodens glatte overflater. Dermed kan operant orofacial mekanisk analyse vurdere effekten av varierende grad av mekanisk nociceptiv stimulering. Vi har tidligere vist at OPAD er en nyttig og pålitelig metode for å vurdere akutt termisk9, samt akutt mekanisk19, nociception og hyperalgesi.
Dette papiret rapporterer bruken av en nyutviklet versjon av OPAD for å vurdere mekanisk nociception og overfølsomhet. I tillegg, ved hjelp av validering, demonstrerer vi CCI-IONS evne til å indusere kronisk nevropati som resulterer i en forutsigbar respons i OPAD. Også detaljert er hvordan du bruker OPAD og tilhørende programvare for raskt å skaffe og analysere gnageradferdsdata.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee og overholdt standardene som er angitt i National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Her beskrives vurderingen av mekanisk overfølsomhet ved bruk av OPAD ved hjelp av en rottemodell av nevropatisk orofacial smerte. Et skjema over tidslinjen som ble brukt i studien er vist i figur 1. Alle atferdsvurderinger ble utført av kvinnelige eksperimenter.
1. Dyr
- Hushunnrotter fra Sprague-Dawley (n = 8/gruppe, 150-200 g) parvis i et temperaturkontrollert rom (22 °C ± 1 °C) med en lys-mørk syklus på 12 timer:12 timer. Gi mat og vann ad libitum. Hold rottene i anlegget i 5 dager for akklimatisering før forsøkene.
- Utfør operant smerte analyser på samme dag i uken og tid (9 am-11 am).
- På slutten av forsøkene avliver du rottene ved halshugging etter isofluranbedøvelse.
2. Sette opp OPAD
- Plasser melkedråpebrett, pleksiglassbur og metallgulvrister på OPAD. Fest ledninger til burene. Slip flaskeholderen på metallstangen på baksiden av enheten.
- Forbered et 2: 1-forhold mellom vann og søtet kondensert melk som belønningsløsning ved å åpne en boks søtet kondensert melk og hell den i en 1 l beger. Tilsett ~ 600 ml vann fra springen til 300 ml melk. Rør først løsningen med en skje, og bruk deretter en rørestang og omrøreren på kokeplaten. Fyll deretter belønningsflaskene med melkeløsningen og hold stammelkløsningen ved 4 °C.
MERK: Dekk lagermelkløsningen med plastfolie. Varm melkeoppløsningen før hver bruk. Lagermelkløsning i kjøleskapet kan koagulere etter en uke. Når det koagulerer, kan det okkludere slikkerøret. Kast den derfor og lag en ny lagerløsning. - Plasser belønningsmelkflaskene på flaskeholderen og juster dem slik at tuten kan nås av dyret. Stram knappen på venstre side på holderen for å feste flasken på plass.
- Slå på burene ved hjelp av bryteren på frontpanelet.
3. Sette opp en protokoll og opprette en eksperimentfil
MERK: Først konfigurerer du protokollen for å kjøre eksperimentet. Protokollen beskriver hvordan ANY-maze-programvaren utfører eksperimentet.
- Åpne programvaren. Skriv inn passordet. Klikk Logg meg på eller trykk Enter.
- Klikk Nytt tomt eksperiment | Protokoll-menyen .
- Velg modusen denne protokollen skal bruke, og navngi protokollen. Klikk Protokoll uten navn under Apparat, klikk på delen Velg modus denne protokollen skal bruke , og under Utstyrsspesifikke moduser velger du OPAD mekanisk burmodus og klikker OK. Deretter navngir du protokollen (f.eks. OPAD mekanisk).
- Legg til OPAD-bur.
- Under Apparat klikker du Apparat | Legg til element øverst i protokollruten | Nytt OPAD-bur | Legg til alle tilkoblede OPAD-bur.
MERK: Før du legger til burene, må du sørge for at alle burene er slått på.
- Under Apparat klikker du Apparat | Legg til element øverst i protokollruten | Nytt OPAD-bur | Legg til alle tilkoblede OPAD-bur.
- Legg til eksperimenttestfaser.
- Under Testing klikker du trinn | Første trinn og navn Stage (f.eks Baseline Day 1). Skriv inn 10 min for testens varighet. Hvis du vil legge til flere trinn, klikker du Legg til element øverst i Protokoll-ruten | Nytt stadium.
MERK: Hvert trinn refererer til økten når en analyse utføres. For eksempel, i 10 dager med trening, er det nødvendig med 10 stadier. Testvarigheten kan økes eller reduseres basert på eksperimentell design.
- Under Testing klikker du trinn | Første trinn og navn Stage (f.eks Baseline Day 1). Skriv inn 10 min for testens varighet. Hvis du vil legge til flere trinn, klikker du Legg til element øverst i Protokoll-ruten | Nytt stadium.
- Tilordne behandlingsgrupper.
- Under Tilleggsinformasjon klikker du Behandlingsgrupper. Sjekk Bruk behandlingsgrupper | Brukeren vil manuelt tilordne dyrene til sine grupper.
MERK: Den refererte programvaren (se materialtabellen) gjør det også mulig å tildele dyr tilfeldig eller i en bestemt rekkefølge. Eksperimenter kan kjøres blinde. Hvis du vil se de tilordnede behandlingsgruppene, fjerner du merket for Kjør eksperimenter i blinde.
- Under Tilleggsinformasjon klikker du Behandlingsgrupper. Sjekk Bruk behandlingsgrupper | Brukeren vil manuelt tilordne dyrene til sine grupper.
- Tilordne dyreidentifikasjoner (ID).
- Klikk på Protokoll-menyen; under Tilleggsinformasjon klikker du på Dyre-ID og merker av for Bruk mine ID-er for å referere til dyr.
- Klikk på Eksperiment-menyen .
- Skriv inn en eksperimenttittel.
- Gi behandlingene et navn ved å klikke på Vis behandlinger, og skriv inn behandlingsnavnene (f.eks. Behandling 1: CCI-ION, Behandling 2: humbug).
- Legg til dyr og tilordne behandlinger og dyre-ID-er ved å klikke på Vis dyr | Legg til dyr, skriv inn antall dyr som skal testes, og klikk OK. Vent til listen over dyr vises, og legg til dyre-ID-er og behandlinger for hver rotte.
MERK: En statusliste som vises ved siden av dyre-ID vil bli satt til Normal i begynnelsen av studien. Dyr kan senere fjernes fra testplanen ved å endre statusen til enten Pensjonert eller Slettet.
- Lagre protokollen ved å klikke på Protokoll-menyen | Lagre protokollen øverst i Protokoll-ruten . Skriv inn Filnavn og programvaren (ANY-maze) passord og klikk Lagre.
MERK: Lagrede protokoller kan brukes på nytt for nye eksperimenter. - Lagre eksperimentfilen ved å klikke Fil | Lagre, skriv inn programvarepassordet, og klikk Lagre.
4. Treningsøkter og grunnleggende testing
MERK: Ta med rotter til rommet minst 15 min før testen hvis atferdstestrommet er på samme dyrehjem. Hvis de blir transportert til et testrom utenfor dyreavdelingen, gi rottene 1 time for å akklimatisere seg til rommet.
- Før baseline registreringer, trene rottene i OPADs i 2 uker (5 dager / uke, 10 min / dag) for å presse ansiktene mot metallpiggede stenger for å motta melkeoppløsningen.
MERK: Et representativt bilde av piggete stenger og en rotte som utfører analysen er vist i figur 2. - Sett opp OPAD-utstyret.
- Slå på burene ved hjelp av bryteren på frontpanelet. Se etter det grønne lyset på buret, noe som betyr at buret er klart til å testes.
- Dobbeltklikk den lagrede eksperimentfilen for å åpne. Skriv inn passordet. Klikk Logg meg på eller trykk Enter.
- Vent til Tester-menyen vises. På venstre side av skjermen noterer du antall dyr og det tilhørende buret (f.eks. Dyr 1 vil bli testet i bur 1), scenen som skal kjøres den dagen, og teststatusen ("klar"). På høyre side av skjermen observerer du diagrammet til hvert dyr som viser antall slikker og kontakter.
- Følg skjermen på burene som viser ID-en til dyret som skal testes. Plasser hver rotte i det tilsvarende buret og trykk på knappen på buret to ganger. Vær oppmerksom på at det grønne lyset blir til et oransje lys når testingen starter, og en advarselslyd høres når testøkten er over.
- For de første 2 dagene av trening, plasser melkeflasker helt inn i buret for å la rottene drikke melk uten å kontakte stimulansen.
- På dagene 3-8 av treningen, når dyrene begynner å drikke, flytt flaskene gradvis bakover for å oppmuntre rottene til å presse ansiktene mot de piggete stolpene.
- På dagene 9-10 av treningen, når dyrene presser helt mot de piggete stengene og slikketallene er konsistente (minimum 500 slikker i løpet av de 10 minutters testøktene), noterer du plasseringen av melkeflasken for hvert dyr og bruker denne avstanden til grunnlinjeregistreringer.
- Etter 2 ukers trening samles data fra den angitte melkeflaskeavstanden i 5 dager som baseline (10 min/dag).
5. Induksjon av orofacial nevropatisk smerte og evaluering av mekanisk overfølsomhet
MERK: Etter baseline målinger gjennomgikk rotter CCI-ION kirurgi, som involverte bilateral ligering av ION, som tidligere beskrevet20. Kontrollrotter ble operert. Ingen pre- eller postoperativ analgesi ble brukt i prosedyren, da det kan endre nevropatiens tidsforløp. FORSIKTIG: Avfall isofluran må fjernes gjennom kullbeholdere. Skalpellblader og nåler må kastes i biohazard avfall.
- Bedøv rotta i induksjonskammeret med en blanding av O2 (1 l / min) og 4% isofluran og opprettholde bedøvelsestilstanden med en spesialisert nesekegle i løpet av operasjonen.
- Plasser den bedøvede rotten på en kirurgisk arbeidsbenk og hold den fast. Hold kroppstemperaturen på 37 °C ved hjelp av en varmepute. Påfør oftalmisk salve i øynene for å forhindre at de tørker ut. Kontroller bedøvelsesdybden ved å klemme tåen og start prosedyren når tåuttaksrefleksen ikke lenger observeres.
- Utfør den kirurgiske prosedyren under et stereomikroskop. Åpne munnen ved hjelp av retractors og trekk leppen med et lite klipp.
- Lag et lite snitt mellom dorsal tannkjøtt og leppe ved hjelp av et skalpellblad (# 15). Klipp forsiktig bort bløtvev ved hjelp av spissen av skalpellbladet for å avsløre en gren av ION.
- Plasser to kromiske tarmligaturer (#5-0) rundt ION ved hjelp av en butt, bøyd sprøytenål.
- Lukk såret med vevslim.
- For humbugoperasjonen, utsett ION ved hjelp av samme prosedyre, men ikke ligate nerven.
- Etter operasjonen, gi melkemyknet gnager chow i 2 dager for å oppmuntre til å spise og forhindre dehydrering.
- Test rottene i OPAD dagen etter operasjonen i 3 påfølgende dager og deretter 3 dager / uke (f.eks. hver tirsdag, torsdag og fredag) i de følgende ukene til slikketallene når utgangsverdiene.
MERK: Varigheten av den CCI-ION-induserte mekaniske følsomheten kan avhenge av kjønn, belastningen til gnageren som brukes, og eksperimentørens ytelse. Dermed kan det hende at det ikke er nøyaktig å indikere en viss varighet for å teste dyr. Derfor er testing til slikketall når grunnlinjeverdier mer nøyaktig.
6. Rengjøring av enheten
- Når testingen er ferdig, avslutter du programvaren ved å klikke på x-ikonet øverst til høyre og venter på at dataene skal lagres automatisk.
- Slå av burene ved hjelp av bryteren på frontpanelet.
- Koble ledningene fra metallgulvristene. Fjern og vask melkedråpebrettene, pleksiglassburene, metallgulvristene og flaskeholderne med oppvaskmiddel. Legg alt på tørkestativet.
- Tørk av metallpiggstengene, testenheten og laboratoriebenkene ved hjelp av 70% isopropylalkohol.
MERK: Instrumentene må håndteres med forsiktighet. Bruk myke børster mens du rengjør melkeflasker og slikkerør. Skittent utstyr kan føre til bakterieoppbygging.
7. Analyse av data
- Dobbeltklikk på eksperimentfilen for å åpne den.
- Klikk på Resultater-menyen . Velg hvilke mål (dvs. slikk, kontakt) eller testdager du vil se.
- Klikk på Tekst eller Graf eller Statistikk øverst i Resultater-panelet for å se en tekst-, graf- eller statistisk analyserapport.
- For å se rådataene, klikk på Data-menyen . Klikk Lagre øverst i Data-panelet for å lagre dataene som et regneark, eller klikk Send for å motta dem via e-post.
- Hvis du vil endre eller legge til flere variabler å se, klikker du Velg data, velger målene og klikker Vis regneark.
- Statistisk analyse
- Utlede automatisk antall slikker og kontakter og ventetiden til den første slikken fra programvaren og eksporter dataene fra programvaren til et regneark.
- Beregn L / F-forholdet som en indeks for overfølsomhet ved å dele antall slikker med antall kontakter21,22,23.
MERK: I denne studien ble en av rottene i humbuggruppen ekskludert fra studien på grunn av lave slikketall (<500 slikker) før operasjonen. - Analyser den statistiske betydningen av forskjellene mellom L/F, antall slikker og kontaktene, og latensen til den første slikken via toveis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av Dunnetts flere sammenligninger eller Šídáks flere sammenligningstester der det er hensiktsmessig.
MERK: P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Data ble presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM).
Representative Results
Et eksempel på en enkelt rottes slikker på belønningsflasken og kontakt med metallpiggstengene ved baseline og 2 uker, 4 uker og 6 uker etter operasjonen er presentert i figur 3. I løpet av de ikke-skadelige periodene har rotter generelt lange økter med drikking (f.eks. ved baseline og restitusjon etter CCI-ION: uke 6 i bildet), og etter CCI-ION reduseres slikketallene da de ikke kan opprettholde ansiktskontakt med piggstengene i lang tid (figur 3A), uten signifikante endringer i drikkeperiodene i humbuggruppen (figur 3B).
Rotter med CCI-ION hadde en signifikant reduksjon i antall slikker frem til 4 uker etter operasjonen og en økning i latensen til første slikk på operasjonsuke (uke 0) og 1 uke etter operasjon sammenlignet med baseline. Det var ingen signifikant endring i humbuggruppen (figur 4A,B). CCI-ION ga en nedgang i antall kontakter, men denne forskjellen var ikke signifikant (figur 4C). CCI-ION forårsaket også en signifikant reduksjon i L/F, og reduksjonen for CCI-ION-gruppen var større enn reduksjonen for humbuggruppen (figur 4D).
Disse resultatene indikerer at rotter etter CCI-ION viser mindre belønningsmelkdrikkingsadferd, og det tar dem en stund å lage den første slikken, noe som indikerer en nocifensiv oppførsel. CCI-ION påvirker imidlertid ikke deres ønske om å nå melken. I tillegg indikerer reduksjonen i L/F hos rotter med CCI-ION mekanisk overfølsomhet, da L/F er høyere under ikke-smertefulle tilstander.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av studiedesignet. Forkortelser: OPAD = orofacial smertevurderingsenhet; CCI-ION = kronisk innsnevringsskade av infraorbitale nerver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativt bilde av piggete stenger og en rotte som utfører analysen. Spiked barer er laget av rustfritt stål metall. Lengden på hele stangen er 7 cm. Høyden på piggene er 0,3 cm. Avstanden mellom piggene er 0,5 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative kontaktforsøk og slikkedata for en enkelt CCI-ION- og humbug-operert rotte under standard 10 min testøkt ved baseline og 2 uker, 4 uker og 6 uker etter operasjonen. Forkortelser: CCI-ION = kronisk innsnevringsskade av infraorbitale nerver; AS = etter operasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Utvikling av mekanisk overfølsomhet etter CCI-ION hos Sprague-Dawley-rotter. (A) Rotter med CCI-ION (n = 8) hadde en signifikant reduksjon i slikketall inntil 4 uker etter operasjonen og (B) en økning i latens til første slikk på operasjonsuke (uke 0) og 1 uke etter operasjon (**p < 0,01, *p < 0,05: uker etter operasjon vs. baseline. #p < 0,05: CCI-ION vs humbug). Det var ingen signifikant nedgang i humbuggruppen (n = 7, p > 0,05). (C) CCI-ION eller humbugkirurgi ga ingen signifikant endring i antall kontakter. (D) Rotter med CCI-ION viste en signifikant reduksjon i L/F ved kirurgi uke og 3 uker etter og viste en nedadgående trend 2 uker etter operasjonen. Sammenlignet med humbuggruppen rotter, var denne reduksjonen signifikant høyere hos CCI-ION-rotter og startet 1 uke etter operasjonen og fortsatte til 3 uker etter operasjonen. Det var ingen signifikant forskjell i humbuggruppen (**p < 0,01, *p < 0,05: uker etter operasjon vs. baseline. # s < 0,05: CCI-ION vs. humbug). I grafene representerer den røde linjen CCI-ION-gruppen, og den blå linjen representerer humbuggruppen. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Signifikante forskjeller ble analysert med toveis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av Šídáks eller Dunnetts flere sammenligningstester, etter behov. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Smerte utløst av uskyldig mekanisk stimulering av ansikt og intraoral slimhinne er et fremtredende trekk ved orofaciale smerteforhold, inkludert trigeminusnevralgi og temporomandibulære leddsykdommer24,25. Selv om trigeminal nevropatisk smerte er klinisk godt beskrevet, er vurderingen av nevropatisk nociceptiv atferd hos gnagere utfordrende. Smerteanalyser som måler refleksiv atferd er de mest brukte metodene i preklinisk smerteforskning. Imidlertid gir testing av apparatrelatert stress, manglende evne til å vurdere affektiv tilstand og eksperimenteringsskjevhet bekymringer om nytten og gyldigheten av refleksanalyser26.
Denne studien introduserer vurderingen av mekanisk følsomhet i den orofaciale regionen av rotter, og demonstrerer følsomheten for CCI-ION ved hjelp av en operantbasert smerteanalyse. Det samme operantsystemet kan også brukes til å teste den mekaniske følsomheten til mus. Det skal bemerkes at muse- og rottestammer kan utvise variasjon i deres respons på CCI-ION, og dermed kan nivåene av mekanisk overfølsomhet variere. Basert på vår erfaring utvikler Sprague-Dawley-rotter vanligvis en stabil mekanisk overfølsomhet 2 uker etter CCI-ION, de begynner å komme seg 4 uker etter CCI-ION, og etter 6 uker med CCI-ION ser vi utvinning fra operasjonen.
I denne protokollen ble mekanisk overfølsomhet kvantifisert ved å måle antall slikker og kontaktene, L/F, og latens til første slikk. Dataene viste at CCI-ION resulterte i reduksjoner i L / F og antall slikkeresponser og økning i ventetiden til den første slikkeresponsen, noe som indikerer at dyr ikke var villige til å presse ansiktene mot piggede stenger på grunn av økt orofacial smertefølsomhet.
OPAD er en belønningskonfliktanalyse der dyr må tåle nociceptive stimuli for å få tilgang til en velsmakende belønning. Slikking oppførsel i analysen kan påvirkes av appetittvekkende atferd. I tillegg brukte vi i denne studien rotter som hadde ansiktshår. Basert på tidligere erfaring med operant smerteanalyser, blant gnagere, er hårløse stammer bedre for å oppdage ansiktskontakter16; På publiseringstidspunktet var imidlertid hårløse rottestammer ikke lenger kommersielt tilgjengelige. Dette kan betraktes som en begrensning av studien. Siden vi også bare brukte kvinnelige Sprague-Dawley-rotter, bør kjønns- og belastningsrelaterte forskjeller i smerterespons forventes.
Det er også noen kritiske trinn for å sikre optimale resultater med analysen. Nøyaktige slikke- og kontaktdata må vises som solide røde og hvite blokker i henholdsvis den refererte programvaren (se figur 3). Avstanden mellom piggene og melkeflasken er avgjørende for at forsøket skal lykkes. Hvis spissen av melkeflasken er for langt fremover, vil dyret ikke komme i kontakt med piggene, og programvaren vil ikke registrere kontakter eller slikke tall riktig. Omvendt, hvis melkeflasken er for langt tilbake, vil kontaktene registrere, men dyret vil ikke kunne nå melken. Under treningsøktene kan slikkedata vises som solide hvite blokker, da tuppen av melkeflasken er for langt frem. Det endres til røde faste blokker når melkeflasken skyves bakover. Av en eller annen grunn, hvis slikkedata begynner å vises som hvite blokker fra avstanden som ble notert, kan det hjelpe å skyve flasken litt og flytte melkeholderen litt nedover / oppover.
Flere punkter kan også betraktes som begrensninger i det orofaciale operant smertesystemet som er beskrevet her. Opplæringen av gnagere er nødvendig og tar uker. Før hver testøkt er matbegrensning nødvendig hos mus, men ikke hos rotter. Ufastede mus har vist seg å ha lave og inkonsekvente slikketall sammenlignet med fastende mus27. Siden OPAD-systemet er en belønningskonfliktmodell, kan den bli påvirket av dyrenes appetittvekkende oppførsel eller av et stoff som påvirker appetitten. Å ha flere apparater er også fordelaktig for å redusere den totale tiden for å teste dyrene, noe som kan øke kostnadene. Imidlertid er orofacial operant smerteanalyser fortsatt fordelaktige i forhold til konvensjonelle refleksbaserte analyser, da de tillater testing av flere dyr samtidig og begrenser interaksjon mellom dyr og eksperimenter.
Operant condition under smertetilstander endrer menneskers og dyrs atferd i henhold til deres konsekvenser28. Å bruke en belønningskonfliktmodell er derfor fordelaktig for å evaluere smerteforhold fordi det tillater dyrene å utføre operant respons. Dette er mer klinisk relevant fordi egenskapene til operant atferd involverer intensjon, motivasjon og vanligvis kortikal behandling29. Når dyr frivillig nærmer seg belønningsflasken og fritt kan trekke seg fra de piggede stengene når som helst, integrerer dette høyere sentre i hjernen og gjør det mulig å evaluere de affektive motivasjonstilstandene knyttet til smerte10. Dermed gir operant smerteanalyser overlegne data ved vurdering av smerte og smertestillende midler in vivo. De bidrar også til å forstå de nociceptive prosessene i trigeminalsystemet, og bidrar dermed til å fremme det orofaciale smertefeltet.
Disclosures
John K. Neubert og Robert M. Caudle er oppfinnerne av OPAD. Stoelting Co er produsent av OPAD, og Richard Mills er ansatt i Stoelting. Publiseringsavgiften er betalt av Stoelting Co Richard Mills, John K. Neubert og Robert M. Caudle er tidligere eiere av Velocity Laboratories, et selskap som tilbyr gebyr-for-service atferdstesting ved hjelp av operant smerteanalyser.
Acknowledgments
Denne studien er finansiert av Facial Pain Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
