Denne protokollen beskriver vurderingen av mekanisk overfølsomhet i en rottemodell av nevropatisk orofacial smerte ved hjelp av en operantbasert orofacial smertevurderingsenhet.
Smerte har sensoriske og affektive komponenter. I motsetning til tradisjonelle, refleksbaserte smerteanalyser, kan operant smerteanalyser gi mer klinisk relevante resultater ved å ta opp de kognitive og motiverende aspektene av smerte hos gnagere. Denne artikkelen presenterer en protokoll for vurdering av mekanisk overfølsomhet etter kronisk innsnevringsskade av infraorbitale nerver (CCI-ION) hos rotter ved bruk av et orofacial operant smertesystem. Før CCI-ION-kirurgi ble rotter trent i en orofacial smertevurderingsenhet (OPAD) for å drikke søtet kondensert melk mens de fikk ansiktskontakt med metallpiggede stenger og slikkerør.
I denne analysen kan rotter velge mellom å motta melk som en positiv forsterker eller unnslippe en aversiv mekanisk stimulus som produseres av en vertikal rad med små pyramideformede pigger på hver side av belønningstilgangshullet. Etter 2 ukers trening i OPAD og før CCI-ION-operasjonen, ble mekaniske sensitivitetsdata ved baseline registrert i 5 dager for hver rotte i løpet av en 10 min testøkt. Under en økt registrerer operantsystemet automatisk antall aktiveringer av belønningsflasker (slikker) og ansiktskontakter, kontaktvarighet og ventetid til første slikk, blant andre tiltak.
Etter baseline målinger gjennomgikk rotter enten CCI-ION eller humbug kirurgi. I denne protokollen ble mekanisk overfølsomhet kvantifisert ved å måle antall slikker, latens til første slikk, antall kontakter og forholdet mellom slikker og ansiktskontakter (L/F). Dataene viste at CCI-ION resulterte i en signifikant reduksjon i antall slikker og L / F-forholdet og en økning i latensen til den første slikken, noe som indikerer mekanisk overfølsomhet. Disse dataene støtter bruken av operantbaserte smerteanalyser for å vurdere mekanisk smertefølsomhet i preklinisk smerteforskning.
Kronisk smerte påvirker millioner av amerikanere årlig1. Dessverre er kronisk smerte utfordrende å behandle, da eksisterende terapier er relativt ineffektive for å redusere kronisk smerte og ofte har uønskede bivirkninger med langvarig bruk 2,3,4. Tradisjonelle prekliniske smerteanalyser, som von Frey-analysen, er avhengige av refleksive utfall eller smertestimulerte responser5. Mens von Frey-analysen har blitt brukt i flere tiår for å måle mekanisk allodyni, er den utsatt for flere forstyrrende faktorer, spesielt eksperimentell bias6. Bruken av von Frey-testing for å evaluere orofacial smerte er også problematisk på grunn av graden av tilbakeholdenhet som trengs for å sikre dyrets hode for å kunne teste ansiktsområdet, noe som kan gi uønskede stresseffekter, for eksempel å øke smerte eller omvendt stressindusert analgesi.
Smertestimulert atferd er også utsatt for falske positive utfall7 og tar ikke hensyn til den affektive komponenten av smerte, som er integrert i den menneskelige smerteopplevelsen8. Derfor er det en økende interesse for å bruke operant smertemodeller som vurderer smerte-deprimert atferd som omfatter både sensoriske og affektive komponenter av smerte for å forbedre innholdet og prediktiv validitet i preklinisk testing. Den operant orofacial smertevurderingsanalysen som er beskrevet her, er basert på et belønningskonfliktparadigme 9,10,11. I denne analysen kan gnageren velge mellom å motta en positiv forsterker og utsette seg for en nociceptiv stimulus eller avstå fra belønningen og unngå den nociceptive stimulansen, og dermed kontrollere mengden smerte den opplever. I motsetning til tradisjonelle smerteanalyser er den operantbaserte analysen eksperimentuavhengig og er ikke utsatt for falske positive utfall på grunn av uheldige beroligende effekter.
Skadelige opplevelser fra hodet og ansiktet bæres av oftalmiske, maksillære og mandibulære grener av trigeminusnerven. Skade eller betennelse i trigeminusnerven øker følsomheten til sensoriske nevroner for termiske eller mekaniske stimuli12,13,14,15. Operantbaserte orofaciale smerteanalyser gir en automatisert måling av termisk eller mekanisk orofacial smerte overført av trigeminusnerven hos gnagere 11,12,16,17,18. Stimulering med ikke-skadelige og skadelige stimuli er et viktig skille mellom testing av termisk og mekanisk allodyni og hyperalgesi i det orofaciale området med OPAD, da de kan representere manifestasjoner av forskjellige underliggende mekanismer.
I den orofaciale termiske analysen presser dyrene ansiktet mot glatte termoder for å få tilgang til belønningen. Termodene kan stilles inn på forskjellige kjølige, varme og varme temperaturer, og tillater dermed vurdering av oppførsel under nøytrale eller nociceptive forhold. I den orofaciale mekaniske analysen presser dyrene ansiktet mot piggete stenger under operanttesting; Siden disse piggene forårsaker et visst nivå av ubehag, kan gnagere drikke mindre når ansiktene deres berører piggene kontra termodens glatte overflater. Dermed kan operant orofacial mekanisk analyse vurdere effekten av varierende grad av mekanisk nociceptiv stimulering. Vi har tidligere vist at OPAD er en nyttig og pålitelig metode for å vurdere akutt termisk9, samt akutt mekanisk19, nociception og hyperalgesi.
Dette papiret rapporterer bruken av en nyutviklet versjon av OPAD for å vurdere mekanisk nociception og overfølsomhet. I tillegg, ved hjelp av validering, demonstrerer vi CCI-IONS evne til å indusere kronisk nevropati som resulterer i en forutsigbar respons i OPAD. Også detaljert er hvordan du bruker OPAD og tilhørende programvare for raskt å skaffe og analysere gnageradferdsdata.
Smerte utløst av uskyldig mekanisk stimulering av ansikt og intraoral slimhinne er et fremtredende trekk ved orofaciale smerteforhold, inkludert trigeminusnevralgi og temporomandibulære leddsykdommer24,25. Selv om trigeminal nevropatisk smerte er klinisk godt beskrevet, er vurderingen av nevropatisk nociceptiv atferd hos gnagere utfordrende. Smerteanalyser som måler refleksiv atferd er de mest brukte metodene i preklinisk smerteforskning. Imidlertid gir testing av apparatrelatert stress, manglende evne til å vurdere affektiv tilstand og eksperimenteringsskjevhet bekymringer om nytten og gyldigheten av refleksanalyser26.
Denne studien introduserer vurderingen av mekanisk følsomhet i den orofaciale regionen av rotter, og demonstrerer følsomheten for CCI-ION ved hjelp av en operantbasert smerteanalyse. Det samme operantsystemet kan også brukes til å teste den mekaniske følsomheten til mus. Det skal bemerkes at muse- og rottestammer kan utvise variasjon i deres respons på CCI-ION, og dermed kan nivåene av mekanisk overfølsomhet variere. Basert på vår erfaring utvikler Sprague-Dawley-rotter vanligvis en stabil mekanisk overfølsomhet 2 uker etter CCI-ION, de begynner å komme seg 4 uker etter CCI-ION, og etter 6 uker med CCI-ION ser vi utvinning fra operasjonen.
I denne protokollen ble mekanisk overfølsomhet kvantifisert ved å måle antall slikker og kontaktene, L/F, og latens til første slikk. Dataene viste at CCI-ION resulterte i reduksjoner i L / F og antall slikkeresponser og økning i ventetiden til den første slikkeresponsen, noe som indikerer at dyr ikke var villige til å presse ansiktene mot piggede stenger på grunn av økt orofacial smertefølsomhet.
OPAD er en belønningskonfliktanalyse der dyr må tåle nociceptive stimuli for å få tilgang til en velsmakende belønning. Slikking oppførsel i analysen kan påvirkes av appetittvekkende atferd. I tillegg brukte vi i denne studien rotter som hadde ansiktshår. Basert på tidligere erfaring med operant smerteanalyser, blant gnagere, er hårløse stammer bedre for å oppdage ansiktskontakter16; På publiseringstidspunktet var imidlertid hårløse rottestammer ikke lenger kommersielt tilgjengelige. Dette kan betraktes som en begrensning av studien. Siden vi også bare brukte kvinnelige Sprague-Dawley-rotter, bør kjønns- og belastningsrelaterte forskjeller i smerterespons forventes.
Det er også noen kritiske trinn for å sikre optimale resultater med analysen. Nøyaktige slikke- og kontaktdata må vises som solide røde og hvite blokker i henholdsvis den refererte programvaren (se figur 3). Avstanden mellom piggene og melkeflasken er avgjørende for at forsøket skal lykkes. Hvis spissen av melkeflasken er for langt fremover, vil dyret ikke komme i kontakt med piggene, og programvaren vil ikke registrere kontakter eller slikke tall riktig. Omvendt, hvis melkeflasken er for langt tilbake, vil kontaktene registrere, men dyret vil ikke kunne nå melken. Under treningsøktene kan slikkedata vises som solide hvite blokker, da tuppen av melkeflasken er for langt frem. Det endres til røde faste blokker når melkeflasken skyves bakover. Av en eller annen grunn, hvis slikkedata begynner å vises som hvite blokker fra avstanden som ble notert, kan det hjelpe å skyve flasken litt og flytte melkeholderen litt nedover / oppover.
Flere punkter kan også betraktes som begrensninger i det orofaciale operant smertesystemet som er beskrevet her. Opplæringen av gnagere er nødvendig og tar uker. Før hver testøkt er matbegrensning nødvendig hos mus, men ikke hos rotter. Ufastede mus har vist seg å ha lave og inkonsekvente slikketall sammenlignet med fastende mus27. Siden OPAD-systemet er en belønningskonfliktmodell, kan den bli påvirket av dyrenes appetittvekkende oppførsel eller av et stoff som påvirker appetitten. Å ha flere apparater er også fordelaktig for å redusere den totale tiden for å teste dyrene, noe som kan øke kostnadene. Imidlertid er orofacial operant smerteanalyser fortsatt fordelaktige i forhold til konvensjonelle refleksbaserte analyser, da de tillater testing av flere dyr samtidig og begrenser interaksjon mellom dyr og eksperimenter.
Operant condition under smertetilstander endrer menneskers og dyrs atferd i henhold til deres konsekvenser28. Å bruke en belønningskonfliktmodell er derfor fordelaktig for å evaluere smerteforhold fordi det tillater dyrene å utføre operant respons. Dette er mer klinisk relevant fordi egenskapene til operant atferd involverer intensjon, motivasjon og vanligvis kortikal behandling29. Når dyr frivillig nærmer seg belønningsflasken og fritt kan trekke seg fra de piggede stengene når som helst, integrerer dette høyere sentre i hjernen og gjør det mulig å evaluere de affektive motivasjonstilstandene knyttet til smerte10. Dermed gir operant smerteanalyser overlegne data ved vurdering av smerte og smertestillende midler in vivo. De bidrar også til å forstå de nociceptive prosessene i trigeminalsystemet, og bidrar dermed til å fremme det orofaciale smertefeltet.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien er finansiert av Facial Pain Research Foundation.
ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
Dish sponge | ANY | ANY | |
GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
Oxygen tank | Medical | ||
Paper towel | ANY | ANY | |
Plastic food wrap | ANY | ANY | |
Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
Spoon | ANY | ANY | |
Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |