Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההליך למדידת ריכוזי ATP בלומן של שלפוחית השתן במכרסם מורדם.
Abstract
ATP, המשתחרר מהאורותל בתגובה להתנפחות שלפוחית השתן, נחשב כבעל תפקיד תחושתי משמעותי בשליטה על מיקוריטיון. לכן, מדידה מדויקת של שחרור ATP במערכת פיזיולוגית היא צעד ראשון חשוב בחקר המנגנונים השולטים באיתות פורינרגי בשלפוחית השתן. טכניקות קיימות לחקר שחרור ATP אורותלי מעורר מכנית משתמשות בתאים בתרבית המצופים על תמיכות גמישות או ברקמת שלפוחית השתן המוצמדת לתאי שימוש; עם זאת, כל אחת מהטכניקות הללו אינה מחקה באופן מלא את התנאים בשלפוחית השתן השלפוחית. לכן, פותח מערך ניסיוני למדידה ישירה של ריכוזי ATP בלומן של שלפוחית השתן של המכרסם.
במערך זה, שלפוחיות של מכרסמים מורדמים מחוררות דרך צנתרים הן בכיפת שלפוחית השתן והן דרך פתח השופכה החיצוני. הלחץ בשלפוחית השתן מוגבר על ידי סגירת קטטר השופכה תוך החדרת נוזל סטרילי לשלפוחית השתן דרך הכיפה. מדידת הלחץ התוך-שלפוחית מתבצעת באמצעות מתמר לחץ המחובר לצנתר כיפת שלפוחית השתן, בדומה למערך המשמש לציסטומטריה. ברגע שמגיעים ללחץ הרצוי, מכסת צנתר השופכה מוסרת, ונוזל נאסף לכימות ATP על ידי בדיקת לוציפרין-לוציפראז. באמצעות מערך ניסוי זה, ניתן לחקור את המנגנונים השולטים הן בגירוי מכני והן בגירוי כימי של שחרור ATP אורותל על ידי הכללת אגוניסטים או אנטגוניסטים שונים לתוך הפרבוסט או על ידי השוואת התוצאות בין חיות בר לבעלי חיים מהונדסים גנטית.
Introduction
ATP בשתן נחשב כבעל תפקיד תחושתי משמעותי בשליטה על מיקטוריציה1. לדוגמה, הוא חשב כי ATP משתחרר מן השתן בתגובה distension שבו הוא יכול לפעול על קולטנים על עצבים afferent שלפוחית השתן כדי להגביר את ההתרגשות שלהם, מה שמוביל לתחושות של מלאות2. לכן, הוא חשב גם כי ATP בשתן יכול להיות שחקן חשוב בפיתוח פתולוגיות שלפוחית השתן. לתמיכה בהשערה זו, ריכוזי ATP בשתן עולים באופן משמעותי בחולים הסובלים מפעילות יתר של שלפוחית השתן (OAB)3, תסמונת כאב בשלפוחית השתן/דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית (BPS/IC)4, או דלקת בדרכי השתן (UTI)5,6, כולם מצבים המאופיינים בדחיפות מוגברת, בתדירות ולפעמים גם בכאב. לעומת זאת, מטופלים הסובלים מתת-פעילות של שלפוחית השתן (UAB), המאופיינת בחוסר יכולת לרוקן את שלפוחית השתן ולעיתים יכולה לכלול ירידה ביכולת לחוש מלאות בשלפוחית השתן, הוכחו כבעלי ירידה בריכוזי ATP בשתן7. באופן ניסיוני, מניפולציה של ריכוזי ATP בשתן יכולה לשנות את רפלקסי שלפוחית השתן בחולדה; הגדלת ריכוזי ATP על ידי חסימת ATPases אנדוגניים בלומן שלפוחית השתן יכולה להגביר את תדירות ההתרוקנות, בעוד הפחתת ריכוזי ATP על ידי החדרת ATPases אקסוגניים לשלפוחית השתן מפחיתה את תדירות ההתרוקנות8. לפיכך, החשיבות של ATP בשתן לתפקוד שלפוחית השתן ברורה.
בהתחשב בחשיבות לכאורה של ATP בשתן לפתולוגיה של שלפוחית השתן, מדידה מדויקת של שחרור ATP דרכי השתן היא צעד חשוב בהבנת המנגנונים השולטים בשחרור. מחקרים רבים הושלמו תוך שימוש במודלים ניסיוניים שונים למדידת שחרור ATP אורותלי. בראש ובראשונה תרביות תאים, תרביות ראשוניות או קווי תאים. עם זאת, השימוש בתאי שתן בתרבית מסובך בשל העובדה שתאי השתן אינם מקבלים את המורפולוגיה המקוטבת הפיזיולוגית שלהם אלא אם כן הם גדלים על ממברנות חדירות מיוחדות (כגון טכנולוגיית Transwell [תוספות באר])9. לכן, קשה לקשר כל שחרור ATP שנמדד לפיזיולוגיה. תאי השתן הגדלים על תוספות באר יכולים לקטב וליצור מחסום דומה למה שנראה in vivo; עם זאת, הצמיחה של אורותל ממוין לחלוטין יכולה להימשך ימים או שבועות. בנוסף, בעוד שניתן להרכיב היטב מוכנסים לתוך תא שימוש ולהפעיל לחץ על הצד האפי כדי לגרום למתיחה, קשה להפעיל מספיק לחץ כדי לחקות את התנאים בתוך שלפוחית השתן במהלך הפתולוגיה (כלומר, לחצים של 30 ס"מ H2O ומעלה). רקמת שלפוחית השתן כולה יכולה גם להיות מורכבת בתא שימוש לניסויי מתיחה, אך זה מסיר את שלפוחית השתן מהאורגניזם יחד עם הגורמים הטרופיים השומרים על בריאות תאי השתן, ומכאן, תפקוד מחסום השתן. לכן, הדרך הרלוונטית ביותר מבחינה פיזיולוגית לחקור את שחרורו של ATP מהאורותל בתגובה למתיחה או לחץ היא in vivo. הטכניקות הכירורגיות הדרושות להקמת הניסוי זהות לאלה הנפוצות בציסטומטריה של בעלי חיים, ולכן צריכות להתבצע בקלות על ידי כל מי שמכיר את הטכניקה הזו.
בפרוטוקול זה, נתאר את הטכניקה המשמשת לבדיקת ATP לומינלי בחולדות Sprague Dawley נקבות השוקלות כ-200-250 גרם, שכן הצנתור הטרנס-שופכתי המתואר להלן קל הרבה יותר בנקבות; עם זאת, צנתור transurethral יכול להתבצע גם מכרסמים זכרים10. מכיוון שצנתור דרך השופכה בוצע כעת גם בעכברים משני המינים11, ניתן להתאים ניסויים אלה בקלות לעכברים או חולדות משני המינים או בגדלים שונים, בהתאם לצרכי צוות המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המבוצעים במכרסמים חייבים לעמוד בהנחיות הרלוונטיות ולקבל את אישור ועדת האתיקה המוסדית המקומית. הניסויים שבוצעו עבור כתב יד זה בוצעו בהתאם למדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג. ראו איור 1 עבור גרסה שונה של מערך הציסטומטריה הסטנדרטי של מכרסמים המשמש בפרוטוקול זה.
1. חיות מעבדה
- שמרו על החולדות בדיור סוציאלי (מכרסמים מרובים בכלוב אחד) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה אד ליביטום , למים וכדורי מזון.
2. הרדמה ובלוק גנגליונים
- יש להשרות הרדמה ראשונית על ידי הנחת בעל החיים בקופסה סגורה עם 4%-5% איזופלורן ב-O2 (1 ליטר/דקה).
- מרדימים את בעל החיים באמצעות אורתן.
- יש להזריק אורתן תת עורית דו-צדדית (1/2 מנה מכל צד של החיה) במינון של 1.2 גרם/ק"ג. הכניסו את בעל החיים לכלוב כדי לאפשר לשופכן להשפיע, פעולה שבדרך כלל אורכת שעתיים.
- לחלופין, יש לתת אורתן תוך צפקי (כלומר) על ידי הזרקת המינון המלא בשתי מנות נפרדות ~ 10 דקות זו מזו.
- לאחר המתנה לזמן המתאים לכניסת האורתן לתוקף (שעתיים, כלומר 30 דקות), יש לבדוק מישור הרדמה תקין על ידי צביטת כף רגלו של בעל החיים באמצעות מלקחיים. אם נצפה רפלקס, לתת מנה נוספת של אורתן (0.05-0.1 מ"ל i.p.), לחכות 15 דקות, ולבדוק שוב. המשך לעקוב אחר בעל החיים למישור ההרדמה הנכון לאורך כל ההליך.
- כדי למנוע התכווצות של שלפוחית השתן במהלך distension, להזריק את החיה עם סוכן חוסם גנגליונים, כגון hexamethonium (20 מ"ג / ק"ג, i.p).
- יש למרוח משחה אופתלמית על עיני החיה כדי למנוע התייבשות במהלך הניסוי.
3. הליך כירורגי - צנתור שלפוחית השתן
- לגלח את הבטן של החיה ולבצע laparotomy קו אמצע לחשוף את שלפוחית השתן.
- הכן קטטר על ידי התלקחות קצה אחד של אורך קצר (~ 10-15 ס"מ) של צינורות PE50 intramedic באמצעות להבה. הכניסו מחט 22 גרם לקצה השני של הצינורית ומלאו בתמיסת קרבס (ראו טבלת חומרים להרכב).
- מניחים לולאה קטנה של תפר משי 3-0 מעל כיפת שלפוחית השתן ומבצעים ציסטומי קטן (באמצעות מספריים עדינים או מחט 18 גרם) גדול מספיק כדי להחדיר את הקצה המתלקח של הצנתר שנעשה לעיל. כאשר יד אחת מחזיקה את הצנתר במקומו, השתמש ביד השנייה כדי להדק את הלולאה של התפר כדי לאבטח את הצנתר במקומו. לסיים את אבטחת הצנתר על ידי קשירת שני קשרים בתפר ומשיכת הצנתר לאחור עד שהראש המתלקח בא במגע עם דופן שלפוחית השתן.
- לחלופין, אבטחו את הצנתר בטכניקת תפר ארנק-חוט קלאסית, כפי שתואר קודם לכן עבור ציסטומטריה12.
הערה: חובה לא להכניס בועות אוויר לשלפוחית השתן במהלך הליך זה.
- לחלופין, אבטחו את הצנתר בטכניקת תפר ארנק-חוט קלאסית, כפי שתואר קודם לכן עבור ציסטומטריה12.
- בדוק את ההתקנה עבור דליפות על ידי החדרת כמות קטנה של תמיסת קרבס דרך הצנתר. אם הנוזל דולף החוצה מהציסטוסטומיה, אבטחו מחדש את הצנתר עם תפר נוסף סביב הציסטוסטומיה.
4. צנתור Transurethral
- יש לטבול את קצהו של צנתר I.V בגודל 20 גרם על 1 אינץ' (עם הסרת המחט) בחומר סיכה כירורגי.
- החזיקו את בשר השופכה החיצוני בעדינות בעזרת זוג מלקחיים והכניסו את קצה הצנתר לפתח השופכה לכיוון הזנב עד שהקצה גורם לעיוות דופן פתח הנרתיק הסמוך. סובבו את הצנתר ב-90° (הביאו את קצה ה-Luer-Lock של הצנתר לכיוון הזנב) והתקדמו בעדינות. יש להחדיר את הצנתר במלואו עד שרכזת Luer-Lock תהיה דיסטלית כ-5 מ"מ מפתח השופכה החיצוני.
הערה: אין להכניס את הצנתר רחוק מדי, מה שעלול לגרום לקצה לדקור את הדופן הפנימית של שלפוחית השתן. אם מורגשת התנגדות בעת התקדמות הצנתר, יש לעצור ולהתחיל שוב או להסתכן בניקור השופכה. עיין בפרק הדיון על טיפים להגברת הצלחת הצנתור. - אבטחו את הצנתר ומנעו דליפה סביב הצנתר על ידי לולאת אורך קצר של תפר משי 3-0 סביב בשר השופכה החיצוני וקשרו אותו בחוזקה. הצמידו את הצנתר לזנב בעזרת נייר דבק כדי למנוע ממנו להישלף בטעות.
- לאחר הצנתור, יש להחדיר בעדינות תמיסת קרבס לשלפוחית השתן דרך צנתר שלפוחית השתן הסופרפובי ולאשר שהנוזל זורם החוצה מצנתר השופכה ולא סביבו. במידת הצורך, יש לסובב את התפר סביב פתח השופכה החיצוני.
- סגור את חתך הבטן מעל שלפוחית השתן באמצעות תפר משי 3-0.
5. מערך ניסיוני
- אבטח את בעל החיים על לוח המסוגל להיות נוטה לסייע בניקוז של נוזל intravesical דרך קטטר השופכה. הניחו כרית חימום וכרית תחתונה סופגת בין בעל החיים לקרש כדי לשמור על חום הגוף ולספוג נוזלים המתנקזים מקטטר השופכה.
- חבר את הצנתר העל-ערוצי לסטופקוק תלת-כיווני, המחבר את הצנתר למשאבת מזרק ומתמר לחץ. חבר את מתמר הלחץ למחשב באמצעות מגבר ומערכת קליטת נתונים.
הערה: יש להקפיד על היווצרות בועות אוויר בצינור המחבר בין משאבת המזרק, המתמר וצנתר שלפוחית השתן. - כייל את רישום הלחץ בשלפוחית השתן באמצעות ההליך המוצע על ידי יצרן מתמר הלחץ ו/או התוכנה לרכישת נתונים.
- יש להחדיר תמיסת קרבס דרך הצנתר הסופרפאביק בקצב של 0.1 מ"ל/דקה ולאפשר לנוזל להתנקז מצנתר השופכה למשך שעה אחת כדי לשטוף את שאריות ה-ATP שהשתחררו במהלך השתלות הצנתר.
- לאחר תקופת שטיפה זו, יש לסגור את צנתר השופכה באמצעות תקע Luer-Lock ולמדוד את הלחץ בשלפוחית השתן. חפשו עלייה איטית בלחץ התוך-שלפוחית ללחץ של 30 ס"מ H2 O ללא עלייה חדה בלחץ, מה שיצביע על התכווצות שלפוחית השתן (ראו איור 2). הסר את התקע מקטטר השופכה כאשר הלחץ מגיע ל 30 ס"מ H2O כדי למנוע נזק לשלפוחית השתן.
הערה: אם התכווצויות שלפוחית השתן ממשיכות להתרחש לאחר שעה, יש לתת מנה נוספת של הקסמטוניום (מינון של 5 מ"ג/ק"ג i.p).
6. איסוף דגימות
- יש להחדיר את שלפוחית השתן במהירות של 0.1 מ"ל/דקה ולאסוף את הפליט מצנתר השופכה. בדוק 100 μL aliquots של eluate מיד עבור ATP (ראה להלן) או להקפיא עבור כימות אצווה מאוחר יותר.
- כדי לבדוק את ההשפעה של התנפחות שלפוחית השתן על ריכוזי ATP לומינליים, יש לסגור את צנתר השופכה עם התקע ולנטר את לחץ השלפוחית עד שהוא מגיע לרמה הרצויה. לאחר מכן, פתח את מכסה צנתר השופכה ואסוף את הפולט למדידת ATP או להקפאה, כמתואר לעיל.
- לאחר כל התנפחות, יש לאפשר לשלפוחית השתן לנוח ולשטוף למשך 10-15 דקות לפני נטילת דגימות נוספות. קח סך של 3-5 דגימות predistension ו 3-5 דגימות בכל לחץ התנפחות הרצוי כדי להדגים חזרתיות.
- כדי לבדוק את השפעת התרופות על שחרור ATP, החליפו את תמיסת קרבס המחדירה את שלפוחית השתן לקרבס המכילה את תרופת הבחירה. יש לנקב במהירות של 0.1 מ"ל/דקה למשך 10-15 דקות כדי שהתרופה תשפיע, ולאחר מכן לאסוף את הדגימות משלפוחית השתן הנפוחה והלא מרוחקת, כמתואר בשלבים 6.1 ו-6.2.
7. כימות ATP מדגימות שנאספו
- כמת ATP בדגימות 100 μL שנאספו באמצעות ערכת בדיקת לוציפרין/לוציפראז הזמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן ולומינומטר.
- כדי לכמת ATP, שלב דגימות של 100 μL של פרפוזט עם 50 μL של תערובת הבדיקה ומקם אותן בלומינומטר לקריאה. כדי להמיר את יחידות האור היחסי (RLUs) המדווחות על ידי הלומנומטר לריכוז של ATP, בצע דילולים סדרתיים של ATP בתמיסת קרבס בטווח של 1 מיקרומטר עד 10 pM בדילול של פי 10 כדי ליצור עקומה סטנדרטית ולקרוא אותם בלומינומטר. התווה את הקריאות המתקבלות על גרף ובצע רגרסיה לא ליניארית (ריבועית) כדי להסיק ריכוזים מהדגימות שנלקחו מהחיה.
הערה: חשוב לקבוע תקני ATP לכל פתרון תרופתי שנבדק בניסוי, מכיוון שתרופות רבות מפריעות לתגובת לוציפרין/לוציפראז, שיש לתקן עבורה.
- כדי לכמת ATP, שלב דגימות של 100 μL של פרפוזט עם 50 μL של תערובת הבדיקה ומקם אותן בלומינומטר לקריאה. כדי להמיר את יחידות האור היחסי (RLUs) המדווחות על ידי הלומנומטר לריכוז של ATP, בצע דילולים סדרתיים של ATP בתמיסת קרבס בטווח של 1 מיקרומטר עד 10 pM בדילול של פי 10 כדי ליצור עקומה סטנדרטית ולקרוא אותם בלומינומטר. התווה את הקריאות המתקבלות על גרף ובצע רגרסיה לא ליניארית (ריבועית) כדי להסיק ריכוזים מהדגימות שנלקחו מהחיה.
8. המתת חסד של בעלי חיים
- עם השלמת הניסוי ואיסוף כל הדגימות, יש להרדים את בעל החיים באופן הומני בהתאם להנחיות משרד החקלאות האמריקאי ולמדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
- הוציאו את בעל החיים המורדם ממערך הניסוי, הניחו אותו בקופסה סגורה וגסו אותו ב-100%CO2. ודא שקצב המילוי שווה ל- 30%-70% מנפח התא לדקה (לדוגמה, 3-7 ליטר לדקה עבור קופסה בנפח 10 ליטר). יש להמשיך את זרימת ה-CO2 למשך דקה אחת לפחות לאחר הפסקת הנשימה.
- השתמש בצורה משנית של המתת חסד כדי להבטיח מוות.
- בצע בית החזה כצורה משנית של המתת חסד על ידי אחיזה בדש העור הקטן בקצה הקאודלי של עצם החזה וחיתוך חור קטן בעור ובשרירים בסרעפת עם זוג מספריים חדים. להשלים את בית החזה על ידי החדרת המספריים לתוך הפתח וחיתוך rostrally דרך כלוב הצלעות ולחשוף את חלל בית החזה.
הערה: יש להשליך את בעל החיים המומת בהתאם להנחיות המוסדיות.
- בצע בית החזה כצורה משנית של המתת חסד על ידי אחיזה בדש העור הקטן בקצה הקאודלי של עצם החזה וחיתוך חור קטן בעור ובשרירים בסרעפת עם זוג מספריים חדים. להשלים את בית החזה על ידי החדרת המספריים לתוך הפתח וחיתוך rostrally דרך כלוב הצלעות ולחשוף את חלל בית החזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר מאפשר מדידה מדויקת של שחרור ATP בדרכי השתן in vivo מלומן שלפוחית השתן, באמצעות גרסה שונה של מערך הציסטומטריה הסטנדרטי של מכרסמים (ראו איור 1). זה מאפשר לחוקר לבחון את ההשפעות של תרופות על שחרור ATP בתיווך מתיחה בסביבה פיזיולוגית.
איור 1: מערך ניסויי . (A) תמונה המציגה את מערך הניסוי, עם הציוד השונה מסומן. שטח החיה המשורטט במלבן אדום מוצג ב-B. (B) תצלום המתאר את בטנה של החולדה לאחר ניתוח. שימו לב לצנתר הסופרפובי המוחדר ונקשר לכיפת שלפוחית השתן, כמו גם לצנתר השופכה המוחדר דרך הפתח החיצוני. צנתר השופכה מחובר לתמונה כדי להראות שלחץ שלפוחית השתן מוגבר במהלך הזלוף דרך צנתר שלפוחית השתן. במהלך הניסוי נתפר פתח הבטן, אך נותר פתוח כאן כדי לאפשר הדמיה של שלפוחית השתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
חשיבות עליונה למדידה מוצלחת של שחרור ATP בתיווך מתיחה בשלפוחית השתן של המכרסם היא הקפדה על חסימת רפלקס המיקטוריציה, המאפשר לשלפוחית השתן להיות מרוחקת מעבר ללחץ הסף המספיק בדרך כלל כדי להפעיל את רפלקס המיקטוריציה. כפי שניתן לראות באיור 2A, כאשר צנתר השופכה מחובר, עירוי של התמיסה לתוך שלפוחית השתן גורם ללחץ תוך שלפוחית לעלות בחדות כאשר שלפוחית השתן מתכווצת. מכיוון שאנו מעוניינים בהשפעות של מתיחה פסיבית, לא התכווצות, על שחרור ATP דרכי השתן, החיה מטופלת עם חוסם גנגליונים, hexamethonium, כדי למנוע את רפלקס micturition. כפי שניתן באיור 2B, כאשר הקסמטוניום מנוהל, החדרת התמיסה לשלפוחית השתן כאשר צנתר השופכה חסום גורמת לעלייה הדרגתית הרבה יותר בלחץ התוך-שלפוחיתי, מה שמאפשר ללחצים לעלות עד 30 ס"מ H2O ללא כיווץ. זה מאפשר מדידה של שחרור ATP לומינלי בלחצים גבוהים מספיק כדי להיות רלוונטיים לפתולוגיה, כגון אלה שנצפו בשלפוחית תת-פעילה, חסימה חלקית של מוצא שלפוחית השתן, או במהלך דיססינרגיה של הסוגר לאחר פגיעה בחוט השדרה. אמנם זה עשוי לדרוש מינון משלים של hexamethonium כדי לחסום לחלוטין את רפלקס micturition, יש לנקוט בזהירות לא לתת מספיק כדי לגרום מנת יתר. זה עלול להוביל לירידה משמעותית בתפוקת הלב ולפגוע באיכות הניסוי. יש לציין כי אותה השפעה מעכבת על רפלקס שלפוחית השתן יכולה להתקבל על ידי חיתוך עצבי האגן דו צדדית או קטיעת חוט השדרה ברמה L4 ומעלה. זה כמובן מגדיל את הקושי של מערך הניסוי ואת הזמן הדרוש להשלמת הניסוי, באופן משמעותי.
איור 2: רישומי לחץ מחולדות. לפני (A) ואחרי (B) בלוק גנגליוני. חצים מציינים מתי צנתר השופכה היה מחובר. שימו לב שהלחץ בעקיבה העליונה עולה במהירות כאשר הלחץ מגיע לסף כדי לגרום למיקטוריציה, בעוד שהלחץ בעקיבה התחתונה עולה בהדרגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
שיקול חשוב נוסף בניסויים אלה הוא להבטיח המרה נכונה של קריאות הלומינומטר (המתבטאות בדרך כלל ב-RLUs) לריכוז ATP באמצעות עקומות סטנדרטיות. תגובת לוציפרין/לוציפראז רגישה מאוד לגורמים מפריעים13. הפרעה זו יכולה לבוא מאינטראקציה ישירה עם לוציפרין/לוציפראז. לדוגמה, מספר תרכובות יכולות לפעול כמעכבים תחרותיים או לא תחרותיים של לוציפראז; מחקר אחד הציע כי ~3% מהתרכובות במאגר המולקולות הקטנות של הספריות המולקולריות יכולות לעכב לוציפראז גחליליות בריכוזים מתחת ל-11 מיקרומטר14. יתר על כן, לוציפרין רגיש לחומרים מחמצנים, ומקטין את כמות המצע הזמין לתגובה המייצרת זוהר15. ניתן גם להפריע לתגובת לוציפרין/לוציפראז על ידי שינוי הזמינות של הקו-פקטור של התגובה, מגנזיום. לדוגמה, טכניקה נפוצה אחת לחיקוי מתיחה מכנית בניסויי ATP במבחנה היא לגרום לנפיחות התא על ידי הפחתת האוסמולריות של התמיסה המחוררת. עם זאת, חוקרים רבים משיגים הפחתה זו על ידי דילול התמיסה במים, הפחתת ריכוז המגנזיום הזמין לפעול כקו-פקטור בתגובת לוציפרין/לוציפראז. בנוסף, תרופות מסוימות נמכרות כמלחי מגנזיום, אשר יכולים להגדיל מאוד את כמות המגנזיום בתמיסה, מה שמוביל גם להבדלים מדידים בקריאות האור. לבסוף, פתרון תרופתי יכול להפריע ליכולת למדוד במדויק את האור המיוצר על ידי תגובת לוציפרין/לוציפראז. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, הידוע גם בשם erioglaucine או FD&C Blue dye #1) הוא מעכב ספציפי של שחרור ATP בתיווך פנקסין16. במינונים יעילים, לתמיסת Brilliant Blue FCF יש גוון כחול מובהק, אשר סופג אור בשיא של כ-600 ננומטר17. זה בטווח אורכי הגל של האור הנפלט על ידי לוציפראז גחלילית; לכן, פליטת האור בניסויים עם BB-FCF מופחתת מאוד. לכן, הכרחי שעקומות סטנדרטיות המשתמשות בכמויות ידועות של ATP מומס בתמיסות המכילות כל תרופה ניסיונית ישמשו לכימות שחרור ה-ATP במהלך הניסוי. כפי שניתן לראות באיור 3, BB-FCF (100 מיקרומטר) מקטין באופן משמעותי את שיפוע העקומה הסטנדרטית, וזה מספיק כדי לשנות באופן משמעותי את הערכים המחושבים עבור ריכוז ATP בדגימה. כפי שניתן לראות בתחתית איור 3, שימוש בתקן קרבס לחישוב ריכוז ה-ATP במדגם המכיל BB-FCF יכול לגרום להערכת חסר של ריכוז ה-ATP ב~50%. במקרים מסוימים, שימוש בעקומה סטנדרטית שגויה עלול לטשטש שינוי בתיווך תרופה בשחרור ATP, או לגרום לו להיראות בטעות כאילו התרחש שינוי. בניסוי המתואר באיור 3, למשל, שימוש בתקן קרבס עבור כל הדגימות היה גורם לכך שנראה כי Brilliant Blue FCF הפחית את שחרור ה-ATP ב~67% (16.6 עד 5.5 ננומטר) כאשר בפועל הוא ירד רק ב~42% (16.6 עד 9.6 ננומטר).
איור 3: השפעות של תרופות ניסיוניות על עקומת תקן ATP. שימו לב שהאנטגוניסט של תעלת הפנקסין, Brilliant Blue, משנה באופן משמעותי את ה-RLUs שנמדדו עבור כל ריכוז נתון של ATP, מה שיגרום להערכת חסר של ה-ATP שנמדד, אם לא יתוקן עבורו. קיצור: RLUs = יחידות אור יחסיות; BB-FCF = FCF כחול מבריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
שיקול נוסף שיש לזכור הוא כי ATP משתחרר בדרך כלל מרקמות כתוצאה מנזק, וכי הליכים כירורגיים אלה והחדרת קטטר שופכה יגרמו לקריאות ATP גבוהות באופן חריג אם נלקחים מוקדם מדי לאחר ההתקנה. הליך זה מתאר תקופת שטיפה של שעה לאחר הגדרת הניסוי, שאין לדלג עליה. מצאנו כי לאחר שעה אחת, ריכוזי ATP שנמדדו בדגימות שנלקחו כאשר שלפוחית השתן אינה מנופחת הם נמוכים יחסית (~ 10-30 ננומטר) בעוד דגימות שנלקחו לפני תקופת השטיפה יכולות לקרוא סדר גודל גבוה יותר. יש לבצע גם שטיפות קצרות של 5 דקות בין התנפחות מכיוון שרמות ה-ATP יכולות להישאר גבוהות לתקופה קצרה. כלל אצבע טוב יהיה למדוד ATP במספר דגימות בתחילת הניסוי ולאחר כל התנפחות ולהמשיך רק כאשר קריאות ה-ATP מתאזנות. באיור 4 אנו מראים ייצוג של ניסוי טיפוסי עם מדידות שנערכו בנקודות זמן שונות. שימו לב לקריאות הגבוהות שנלקחו לפני השטיפה (דוגמאות #1 ו- #5) לעומת אלה שנלקחו לאחר השטיפה (דוגמאות #2 ו- #6).
איור 4: ייצוג של ניסוי טיפוסי. ייצוג מסוגנן של הקלטת לחץ טיפוסית. כל מספר מייצג נקודת זמן שבה דגימה נלקחה ונמדדה עבור ATP: 1) מיד לאחר השלמת ההתקנה, לפני תקופת השטיפה, 2) לאחר תקופת שטיפה של שעה אחת, 3) מיד לפני התנפחות, 4) במהלך התנפחות, 5) מיד לאחר התנפחות, ו-6) לאחר תקופת שטיפה קצרה לאחר התנפחות. טבלת הכניסה מציגה ערכי RLU מייצגים וריכוזי ATP עבור כל דגימה. קיצור: RLUs = יחידות אור יחסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 מציג גרפים מייצגים של תוצאות ניסוי הבוחנים את מנגנון שחרור ה-ATP מהאורותל. כפי שניתן לראות באיור 5A, הגברת הלחץ גורמת לעלייה משמעותית בריכוז ה-ATP בלומן של שלפוחית השתן, כאשר לחצים של 30 ס"מ מים מגדילים את הריכוזים כמעט פי 2.5 מקבוצת ביקורת לא מרוחקת. זילוח תוך שלפוחית של 2 U/mL של אפיראז, אנזים המזרז הידרוליזה של ATP, מקטין באופן משמעותי את הריכוז הנמדד של ATP בלומן שלפוחית השתן. לעומת זאת, זילוח תוך שלפוחית של ARL67156, מעכב NTPDases הקיים על האורוטליום, מעלה באופן משמעותי את ריכוזי ה-ATP הלומינלי. איור 5B מתאר את הניסויים לתוך מנגנון שחרור ATP המושרה על ידי מתיחה מהאורותל. זילוח עם אנטגוניסטים ערוץ pannexin כחול מבריק FCF (BB-FCF, 100 מיקרומטר) או carbenoxolone (CBX, 100 μM) מפחית באופן משמעותי את שחרור ATP לתוך לומן שלפוחית השתן בכל הלחצים. ריכוזי ATP לומינליים אינם פוחתים כאשר חוסם הקונקסין 18α-glycyrrhetinic acid מחורר, דבר המצביע על כך ששחרור ATP המעורר התנפחות מתווך על ידי תעלות פנקסין ולא על ידי תעלות קונקסין.
איור 5: מדידות מייצגות של שחרור ATP המעורר התנפחות בלומן של שלפוחית השתן. (A) התנפחות שלפוחית השתן מעלה את ריכוזי ה-ATP הלומינלי, אשר יכולים להיות מופחתים בנוכחות NTPDase apyrase (2 U/mL) או מוגברים כאשר NTPDasesare אנדוגניים מעוכבים עם ARL67156 (10 μM). (B) שחרור ATP מעורר התנפחות נחסם על-ידי אנטגוניסטים של תעלות פנקסין Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) וקרבנוקסולון (CBX, 100 μM) אך לא על אנטגוניסט תעלת קונקסין 18α-glycyrrhetinic acid (18α-GA, 50 μM). הנתונים מוצגים כממוצע עם קווי שגיאה סטנדרטיים. ** p < 0.05 בין שני הפסים המסומנים על ידי הקו, ## p < 0.05 בהשוואה לבקרות קרבס באותה התנפחות. איור זה הודפס מחדש באישור Beckel et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רוב המחקר על שחרור ATP בדרכי השתן מתבצע בתאים בתרבית, תוך שימוש בקווי תאים אימורטליים או בתרביות ראשוניות של תאי השתן של מכרסמים. בעוד שלמודלים אלה יש את היתרון של תפוקה גבוהה יחסית (כלומר, תרבית/מעבר אחד יכול לייצר צלחות/כלים רבים של תאים), הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם פוחתת בגלל: 1) חוסר היכולת של תאי השתן לגדול מקוטב אלא אם כן הם גדלים על תמיכות מיוחדות 2) הקושי לחשוף תאים בתרבית לרמות פיזיולוגיות של מתיחה/לחץ. אחת הדרכים להתמודד עם מגבלות אלה היא על ידי הוצאת שלפוחית השתן ממכרסם, חתיכתה והכנסתה לתא שימוש, החדרת רקמת השלפוחית בין שני חצאי חדרים מלאים בתמיסה פיזיולוגית. זה מאפשר לחוקר לחשוף את האורותל, במצבו המקוטב הטבעי, להתנפחות על ידי הוספת נפח לצד השתן של החדר, מה שגורם למתיחה של רקמת שלפוחית השתן בחדר. עם זאת, קשה לייחס מתיחה זו להתנפחות הנראית על ידי האורוטליום in vivo. יתר על כן, ATP מעורר distension בתא השימוש משתחרר לתוך נפח גדול של נוזל פיזיולוגי הכלול בחדר, מדלל את ריכוז ATP פי כמה. באמצעות הליך זה, לחץ שלפוחית השתן נמדד ישירות, כך שניתן לשמור על התנפחות בטווח הרלוונטי לפיזיולוגיה או לפתופיזיולוגיה. יתר על כן, מכיוון שאנו מודדים ריכוז ATP ישירות מהנוזל הלומינלי ולא מכמות שרירותית ומופרזת של נוזל המשמש לשמירה על רקמה במבחנה, אין צורך לתקן את הריכוז שנמדד. לפיכך, ההליך המתואר במאמר זה מאפשר לחוקר לבחון שחרור ATP בלומן שלפוחית השתן בתנאים הדומים הרבה יותר לתנאים פיזיולוגיים או פתופיזיולוגיים של שלפוחית השתן.
הטכניקה המתוארת דומה מאוד לטכניקות ציסטומטריה סטנדרטיות המשמשות לחקר ההשפעות של תרופות על פעילות שלפוחית השתן הרפלקסיבית וצריכה להתבצע בקלות על ידי כל מי שמבצע ניסויים אלה באופן שגרתי. עם זאת, עבור אותם חוקרים חדשים בצנתור שלפוחית השתן, יש כמה אזהרות שכדאי להיות מודעים אליהן. ראשית, צנתור transurethral יכול להיות קשה עבור חסרי ניסיון בשל העקמומיות של השופכה מכרסם. זה יכול להיות קשה יותר גם על ידי הידוק של סוגר השופכה החיצוני, אפילו תחת הרדמה אורתן. זה הכרחי כי החוקר לא מנסה לדחוף את הצנתר לתוך השופכה, כפי שהוא קרוב לוודאי יגרום דלקת מוגברת ונפיחות, אשר בתורו להפוך את השופכה אפילו קשה יותר לצנתור בהצלחה. בנוסף, ניתן לדחוף את הצנתר דרך דופן השופכה, ובכך להרוס את הניסוי כולו.
פיתחנו כמה טיפים וטריקים להגדלת שיעור ההצלחה. לדוגמה, לפעמים יש צורך לתת לחיה מנה קצרה נוספת של איזופלורן בשאיפה (0.5%-1.0%) כדי להרפות את סוגר השופכה. זה צריך להתבצע במשורה ובזהירות, כמו שילוב של urethane ו isoflurane יכול לגרום דיכאון נשימתי. טריק נוסף הוא לטבול את קצה הצנתר בתמיסת לידוקאין 2% לפני הכנסתו לפתח השופכה החיצוני; זה יגרום לעתים קרובות לסוגר להירגע לאחר מספר דקות. ריקון שלפוחית השתן על ידי לחיצה עדינה על בטנו של בעל החיים יכול גם לעזור להרפות את סוגר השופכה. לבסוף, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בצנתר מד קטן יותר; לפעמים אנחנו משתמשים בצנתר 24 גרם, במיוחד עם בעלי חיים קטנים יותר. זכור, עם זאת, כי ייתכן שיהיה צורך להפחית את קצב העירוי לתוך שלפוחית השתן בעת שימוש בצנתר transurethral מד קטן יותר, כדי להתאים את הניקוז האיטי יותר מן קטטר השופכה. אם לא תעשו זאת, לחץ השלפוחית יעלה, למרות שצנתר השופכה אינו סגור.
יש לציין כי אורתן משמש כהרדמה בפרוטוקול זה. אורתאן משמש בדרך כלל במעבדות החוקרות את דרכי השתן התחתונות, שכן הוא חוסך את רפלקס המיקטוריציה בעוד שחומרי הרדמה אחרים לא. בגלל זה, distension של שלפוחית השתן מעל לחץ של ~ 7-10 ס"מ H2O תחת הרדמה urethane יפעיל רפלקס micturition. מכיוון שאנו מעוניינים בשחרור ATP בתגובה להתנפחות פסיבית, פרוטוקול זה קורא לחסימת התכווצויות שלפוחית השתן באמצעות חוסם גנגליונים hexamethonium. זה מאפשר מדידה של שחרור ATP בתגובה ללחצים תוך-שלפוחיתיים גבוהים יותר (כלומר, 30 ס"מ H2O) הנפוצים בפתולוגיה של שלפוחית השתן הכוללת חסימת יציאה. לכן, השימוש באורתן/הקסמטוניום מאפשר מדידה של שחרור ATP לומינלי מעורר התנפחות לפרקי זמן ארוכים (משך הפעולה של שתי התרופות נמדד בשעות). עם זאת, מעבדות מסוימות עשויות להעדיף להשתמש בחומר הרדמה שאינו חוסך את רפלקס המיקוריטיון, כגון קטמין, ולבטל את הצורך בחוסם גנגליונים. זה יעבוד גם טוב עבור הליך זה, אם כי זה ידרוש ניהול תכופים יותר (או רציף) בשל משך קצר יותר של פעולה של הרדמה.
הבדל ראוי לציון אחד בין טכניקה זו למדידת ATP לבין מערך הציסטומטריה הנפוץ שחוקרי אורולוגיה עשויים להכיר הוא השימוש בתמיסת קרבס חוצצת כפרפוזט במקום תמיסת המלח האיזוטונית הסטנדרטית. ATP היא מולקולה שבריונית למדי והיא מיוצבת מעט בתמיסה חוצצת. בנוסף, ההרכב של תמיסת קרבס קרוב הרבה יותר לזה של השתן מאשר מי מלח, מה שמוסיף רלוונטיות קלינית נוספת לניסויים אלה. זהו שיקול חשוב, שכן הבקרה על שחרור ATP אורותל הוכחה כמווסתת על ידי תעלות חדירות לסידן, וחוסר סידן במי מלח רגילים עלול להשפיע לרעה על שחרור ה- ATP. חוסר היציבות של ATP בתמיסה הוא גם הסיבה שאנו מציעים לכמת דגימות באופן מיידי באמצעות תגובת לוציפרין-לוציפראז. עם זאת, אם החוקר אינו מסוגל לקרוא את הדגימות מיד, הדגימות צריכות להיות מוקפאות מהר ככל האפשר כדי להגביל את השפלה של ATP.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא שהיא מודדת רק שחרור ATP לומינלי ואינה יכולה למדוד שחרור ATP מהצד הסרוסלי של האורטל. הוא האמין כי ATP משוחרר מן הצד הסרוסלי כדי להשפיע ישירות על רגישות afferent; עם זאת, מדידה ישירה של שחרור זה קשה. במקרה זה, שימוש בתאים הגדלים על תמיכות קרום חדירות כגון לוחות Transwell או הסרה כירורגית של השתן עבור ניסויים בתאי שימוש היא הטכניקה המועדפת. עם זאת, בהתחשב בחשיבות לכאורה של ATP לומינלי בפתולוגיה של שלפוחית השתן, מודל ניסויי זה הוא כלי שימושי כדי להבהיר את המנגנונים התאיים השולטים בשחרור ATP דרכי השתן במהלך הפתולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK) ל- JMB (DK117884).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
References
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A.
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C.
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
