In vivo Luminale meting van Distensie-evoked Urothelial ATP Release bij knaagdieren

Summary

Dit protocol beschrijft de procedure voor het meten van ATP-concentraties in het lumen van de blaas bij een verdoofd knaagdier.

Abstract

ATP, vrijgekomen uit het urotheel als reactie op opgezette blaas, wordt verondersteld een belangrijke sensorische rol te spelen bij de controle van mictie. Daarom is nauwkeurige meting van urotheliale ATP-afgifte in een fysiologische omgeving een belangrijke eerste stap in het bestuderen van de mechanismen die purinerge signalering in de urineblaas regelen. Bestaande technieken om mechanisch opgeroepen urotheliale ATP-afgifte te bestuderen, maken gebruik van gekweekte cellen die zijn verguld op flexibele steunen of blaasweefsel dat in ussingkamers is vastgepind; elk van deze technieken emuleert echter niet volledig de omstandigheden in de intacte blaas. Daarom werd een experimentele opstelling ontwikkeld om atp-concentraties direct te meten in het lumen van de urineblaas van knaagdieren.

In deze opstelling worden de blazen van verdoofde knaagdieren door katheters in zowel de koepel van de blaas als via de externe urethrale opening doordrenkt. De druk in de blaas wordt verhoogd door de urethrale katheter af te sluiten en steriele vloeistof via de koepel in de blaas te brengen. Meting van de intravesicale druk wordt bereikt met behulp van een drukomvormer die is bevestigd aan de blaaskoepelkatheter, vergelijkbaar met de opstelling die wordt gebruikt voor cystometrie. Zodra de gewenste druk is bereikt, wordt de dop van de urethrale katheter verwijderd en vloeistof verzameld voor ATP-kwantificering door luciferine-luciferasetest. Door deze experimentele opstelling kunnen de mechanismen die zowel mechanische als chemische stimulatie van urotheliale ATP-afgifte regelen, worden ondervraagd door verschillende agonisten of antagonisten in het perfusaat op te nemen of door resultaten tussen wildtype en genetisch gemodificeerde dieren te vergelijken.

Introduction

Urinaire ATP wordt verondersteld een belangrijke sensorische rol te spelen bij de controle van mictie¹. Er wordt bijvoorbeeld gedacht dat ATP wordt vrijgegeven uit het urotheel als reactie op uitzetting, waar het kan inwerken op receptoren op blaasafferente zenuwen om hun prikkelbaarheid te vergroten, wat leidt tot sensaties van volheid². Er wordt dus ook gedacht dat urine-ATP een belangrijke speler kan zijn in de ontwikkeling van blaaspathologieën. Ter ondersteuning van deze hypothese zijn de ATP-concentraties in de urine significant verhoogd bij patiënten die lijden aan een overactieve blaas (OAB)³, blaaspijnsyndroom/interstitiële cystitis (BPS/IC)⁴, of een urineweginfectie (UTI)^5,6, allemaal aandoeningen die worden gekenmerkt door verhoogde urgentie, frequentie en soms pijn. Omgekeerd is aangetoond dat patiënten die lijden aan een onderactieve blaas (UAB), die wordt gekenmerkt door een onvermogen om de blaas te legen en soms een verminderd vermogen kan hebben om blaasvolheid te voelen, verlaagde ATP-concentraties in de urine hebben⁷. Experimenteel kan manipulatie van ATP-concentraties in de urine de blaasreflexen bij de rat veranderen; het verhogen van ATP-concentraties door het blokkeren van endogene ATPasen in het blaaslumen kan de leegtefrequentie verhogen, terwijl het verlagen van ATP-concentraties door exogene ATPasen in de blaas te brengen de ledigingsfrequentie vermindert⁸. Het belang van urine-ATP voor de blaasfunctie is dus duidelijk.

Gezien het schijnbare belang van atp in de urine voor blaaspathologie, is nauwkeurige meting van urotheliale ATP-afgifte een belangrijke stap in het begrijpen van de mechanismen die de afgifte regelen. Veel studies zijn voltooid met behulp van verschillende experimentele modellen om de afgifte van urotheliale ATP te meten. De belangrijkste hiervan zijn celculturen, primaire culturen of cellijnen. Het gebruik van gekweekte urotheelcellen wordt echter bemoeilijkt door het feit dat urotheelcellen hun fysiologische gepolariseerde morfologie niet aannemen, tenzij ze worden gekweekt op speciale permeabele membranen (zoals Transwell-technologie [putinzet])⁹. Het is dus moeilijk om een ATP-afgifte gemeten te relateren aan de fysiologie. Urotheelcellen gekweekt op putinzetstukken kunnen polariseren en een barrière vormen die lijkt op wat in vivo wordt gezien; de groei van een volledig gedifferentieerd urotheel kan echter dagen of weken duren. Bovendien, hoewel het mogelijk is om putinzetstukken in een ussingkamer te monteren en druk uit te oefenen op de apicale kant om rek te veroorzaken, is het moeilijk om voldoende druk uit te oefenen om de omstandigheden in de blaas na te bootsen tijdens pathologie (d.w.z. drukken van 30 cm H₂O of hoger). Heel blaasweefsel kan ook in een Ussing-kamer worden gemonteerd voor stretchexperimenten, maar dit verwijdert de blaas uit het organisme samen met de trofische factoren die de gezondheid van de urotheelcel en dus de urotheliale barrièrefunctie behouden. Daarom is de meest fysiologisch relevante manier om de afgifte van ATP uit het urotheel te bestuderen als reactie op rek of druk in vivo. De chirurgische technieken die nodig zijn om het experiment op te zetten, zijn identiek aan die welke vaak worden gebruikt in de cystometrie bij dieren en moeten daarom gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd door iedereen die bekend is met die techniek.

In dit protocol zullen we de techniek beschrijven die wordt gebruikt om luminale ATP te onderzoeken bij vrouwelijke Sprague Dawley-ratten met een gewicht van ongeveer 200-250 g, omdat de hieronder beschreven transurethrale katheterisatie veel gemakkelijker is bij vrouwen; transurethrale katheterisatie kan echter ook worden uitgevoerd bij mannelijke knaagdieren¹⁰. Aangezien transurethrale katheterisatie nu is uitgevoerd bij muizen van beide geslachten^{en ook 11}, kunnen deze experimenten gemakkelijk worden aangepast voor muizen of ratten van beide geslachten of van verschillende grootte, afhankelijk van de behoeften van het onderzoeksteam.

Protocol

Alle procedures die bij knaagdieren worden uitgevoerd, moeten voldoen aan de toepasselijke richtlijnen en worden goedgekeurd door de lokale institutionele ethische beoordelingscommissie. De experimenten die voor dit manuscript werden uitgevoerd, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Pittsburgh School of Medicine. Zie figuur 1 voor een aangepaste versie van de standaard cystometrie-instelling voor knaagdieren die in dit protocol wordt gebruikt.

1. Proefdieren

1. Onderhoud de ratten in sociale huisvesting (meerdere knaagdieren in één kooi) met een licht/donkercyclus van 12 uur en ad libitum toegang tot water en voedselpellets.

2. Anesthesie en ganglionisch blok

1. Induceer initiële anesthesie door het dier in een gesloten doos te plaatsen die wordt vergast met 4% -5% isofluraan in O₂ (1 L/min).
2. Verdoof het dier met urethaan.
   1. Injecteer urethaan subcutaan bilateraal (1/2 dosis aan elke kant van het dier) in een dosis van 1,2 g/kg. Plaats het dier in een kooi om het urethaan in werking te laten treden, wat over het algemeen 2 uur duurt.
   2. U kunt ook urethaan intraperitoneaal (i.p.) toedienen door de volledige dosis in twee afzonderlijke doses ~ 10 minuten uit elkaar te injecteren.
3. Na te hebben gewacht op het juiste moment waarop het urethaan in werking treedt (s.c.: 2 uur, i.p.: 30 min), test u op een goed anesthesievlak door de voet van het dier met een tang te knijpen. Als een reflex wordt waargenomen, dien dan een extra dosis urethaan (0,05-0,1 ml i.p.), wacht 15 minuten en test opnieuw. Blijf het dier gedurende de hele procedure controleren op het juiste niveau van anesthesie.
4. Om een samentrekking van de blaas tijdens uitzetting te voorkomen, injecteert u het dier met een ganglionisch blokkerend middel, zoals hexamethonium (20 mg/kg, i.p.).
5. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging tijdens het experiment te voorkomen.

3. Chirurgische procedure-suprapubische blaaskatheterisatie

1. Scheer de buik van het dier en voer een middenlijn laparotomie uit om de urineblaas bloot te leggen.
2. Bereid een katheter voor door het ene uiteinde van een korte (~ 10-15 cm) lengte van PE50 intramedische slang af te flakkeren met behulp van een vlam. Plaats een naald van 22 G in het andere uiteinde van de buis en vul met Krebs-oplossing (zie materiaaltabel voor de samenstelling).
3. Plaats een kleine lus van 3-0 zijdeverbinding over de koepel van de blaas en voer een kleine cystostoma uit (met behulp van een fijne schaar of een naald van 18 G) die groot genoeg is om het uitlopende uiteinde van de katheter hierboven in te brengen. Terwijl u de katheter op zijn plaats houdt, gebruikt u de andere hand om de lus van de hechtdraad aan te spannen om de katheter op zijn plaats te houden. Voltooi het vastzetten van de katheter door twee knopen in de hechtdraad te binden en de katheter terug te trekken totdat de uitlopende kop in contact komt met de blaaswand.
   1. U kunt de katheter ook vastzetten met behulp van een klassieke tas-string hechttechniek, zoals eerder beschreven voor cystometrie¹².
      OPMERKING: Het is absoluut noodzakelijk om tijdens deze procedure geen luchtbellen in de blaas te introduceren.
4. Test de opstelling op lekken door een kleine hoeveelheid Krebs-oplossing door de katheter te brengen. Als de vloeistof uit de cystostoma lekt, beveiligt u de katheter opnieuw met extra hechting rond de cystostomie.

4. Transurethrale katheterisatie

1. Dompel het uiteinde van een 20 G x 1" I.V.-katheter (met de naald verwijderd) in chirurgisch smeermiddel.
2. Houd de uitwendige urethrale meatus voorzichtig vast met een tang en breng de punt van de katheter in de urethrale opening in de richting van de staart totdat de punt ervoor zorgt dat de wand van de aangrenzende vaginale opening vervormt. Draai de katheter 90° (breng het Luer-Lock-uiteinde van de katheter naar de staart) en ga voorzichtig vooruit. Plaats de katheter volledig totdat de Luer-Lock-naaf ongeveer 5 mm distal is van de externe urethrale opening.
   OPMERKING: Breng de katheter niet te ver in, waardoor de punt de binnenwand van de blaas kan prikken. Als weerstand wordt gevoeld tijdens het oprukken van de katheter, stop dan en begin opnieuw of loop het risico de urethra te doorboren. Zie het discussiegedeelte over tips om succesvolle katheterisatie te vergroten.
3. Zet de katheter vast en voorkom lekkage rond de katheter door een korte lengte van 3-0 zijden hechtdraad rond de externe urethrale meatus te lusen en stevig af te binden. Bevestig de katheter aan de staart met tape om te voorkomen dat deze per ongeluk wordt uitgetrokken.
4. Eenmaal gekatheteriseerd, injecteer krebs oplossing voorzichtig in de blaas via de suprapubische blaaskatheter en bevestig dat de vloeistof uit de urethrale katheter stroomt en niet eromheen. Retie indien nodig de hechting rond de externe urethrale opening.
5. Sluit de abdominale incisie over de blaas met behulp van een 3-0 zijdeverbinding.

5. Experimentele opstelling

1. Bevestig het dier op een plank die geneigd is te helpen bij het afvoeren van intravesicale vloeistof door de urethrale katheter. Plaats een verwarmingskussen en absorberend onderpad tussen het dier en het bord om de lichaamswarmte te behouden en vocht te absorberen dat uit de urethrale katheter loopt.
2. Sluit de suprapubische katheter aan op een driewegstopkraan, die de katheter verbindt met een spuitpomp en een drukomvormer. Sluit de drukomvormer aan op een computer door middel van een versterker en een data-acquisitiesysteem.
   OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen ontstaan in de slang die de spuitpomp, transducer en blaaskatheter verbindt.
3. Kalibreer de blaasdrukregistratie volgens de procedure die wordt voorgesteld door de fabrikant van de drukomvormer en/of data-acquisitiesoftware.
4. Injecteer Krebs-oplossing door de suprapubische katheter met een snelheid van 0,1 ml / min en laat de vloeistof gedurende 1 uur uit de urethrale katheter wegvloeien om eventuele resterende ATP die vrijkomt tijdens de katheterimplantaties uit te spoelen.
5. Sluit na deze uitwasperiode de urethrale katheter af met een Luer-Lock-plug en meet de druk in de blaas. Zoek naar een langzame stijging van de intravesicale druk tot een druk van 30 cm H₂O zonder een sterke toename van de druk, wat zou wijzen op een blaascontractie (zie figuur 2). Verwijder de plug uit de urethrale katheter wanneer de druk 30 cm H₂O bereikt om schade aan de blaas te voorkomen.
   OPMERKING: Als blaascontracties na 1 uur blijven optreden, geef dan een extra dosis hexamethonium (dosis van 5 mg/kg i.p.).

6. Verzameling van monsters

1. Infundeer de blaas op 0,1 ml/min en vang het eluaat op uit de urethrale katheter. Test 100 μL aliquots van het eluaat onmiddellijk op ATP (zie hieronder) of vries in voor latere batchkwantificering.
2. Om het effect van blaasuitzetting op luminale ATP-concentraties te testen, sluit u de urethrale katheter af met de plug en controleert u de blaasdruk totdat deze het gewenste niveau bereikt. Maak vervolgens de urethrale katheter los en verzamel het eluaat voor ATP-meting of bevriezing, zoals hierboven beschreven.
3. Laat na elke uitzetting de blaas rusten en uitspoelen gedurende 10-15 minuten voordat u extra monsters neemt. Neem in totaal 3-5 predistensiemonsters en 3-5 monsters bij elke gewenste uitzettingsdruk om herhaalbaarheid aan te tonen.
4. Om het effect van geneesmiddelen op de afgifte van ATP te testen, schakelt u de Krebs-oplossing die de blaas infundeert over op Krebs die het medicijn van keuze bevatten. Perfuseer op 0,1 ml / min gedurende 10-15 minuten voordat het medicijn een effect heeft en verzamel vervolgens de monsters van niet-opgezwollen en opgezwollen blazen zoals beschreven in stappen 6.1 en 6.2.

7. Kwantificeren van ATP uit verzamelde monsters

1. Kwantificeer ATP in de verzamelde monsters van 100 μL met behulp van een in de handel verkrijgbare luciferine/luciferase-testkit volgens de instructies van de fabrikant en een luminometer.
   1. Om ATP te kwantificeren, combineert u 100 μL-monsters perfusaat met 50 μL van het testmengsel en plaatst u ze in de luminometer voor aflezing. Om de relatieve lichteenheden (RLU's) die door de luminometer worden gerapporteerd, om te zetten in een concentratie ATP, maakt u seriële verdunningen van ATP in Krebs-oplossing variërend van 1 μM tot 10 pM in 10-voudige verdunningen om een standaardcurve te creëren en deze in de luminometer af te lezen. Plot de resulterende metingen op een grafiek en voer een niet-lineaire (kwadratische) regressie uit om concentraties uit de monsters van het dier te extrapoleren.
      OPMERKING: Het is belangrijk om ATP-normen te maken voor elke geneesmiddeloplossing die in het experiment wordt getest, omdat veel geneesmiddelen interfereren met de luciferine / luciferase-reactie, waarvoor moet worden gecorrigeerd.

8. Euthanasie van dieren

1. Wanneer het experiment is voltooid en alle monsters zijn verzameld, euthanaseert u het dier op humane wijze volgens de USDA-richtlijnen en de gids van de National Research Council voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
   1. Haal het verdoofde dier uit de proefopstelling, plaats het in een gesloten doos en gas het met 100% CO₂. Zorg ervoor dat de vulsnelheid gelijk is aan 30% -70% van het kamervolume per minuut (bijvoorbeeld 3-7 l / min voor een doos met een volume van 10 l). Ga door met de CO_2-stroom gedurende ten minste 1 minuut nadat de ademhaling is gestopt.
2. Gebruik een secundaire vorm van euthanasie om de dood te verzekeren.
   1. Voer een thoracotomie uit als een secundaire vorm van euthanasie door de kleine flap van de huid aan het caudale uiteinde van het borstbeen vast te pakken en een klein gat in de huid en spieren bij het diafragma te snijden met een scherpe schaar. Voltooi de thoracotomie door de schaar in de opening te steken en rostrale door de ribbenkast te snijden en de thoracale holte bloot te leggen.
      OPMERKING: Het geëuthanaseerde dier moet worden verwijderd volgens institutionele richtlijnen.

Representative Results

Het beschreven protocol maakt het mogelijk om de urotheliale ATP-afgifte in vivo uit het lumen van de blaas nauwkeurig te meten, met behulp van een aangepaste versie van de standaard cystometrie-opstelling voor knaagdieren (zie figuur 1). Dit stelt de onderzoeker in staat om de effecten van geneesmiddelen op stretch-gemedieerde ATP-afgifte in een fysiologische omgeving te onderzoeken.

Figuur 1: Experimentele opstelling. (A) Afbeelding van de experimentele opstelling, met de verschillende apparatuur gelabeld. Het gebied van het dier omlijnd in een rode rechthoek wordt weergegeven in B. (B) Foto van de buik van de rat na de operatie. Let op de suprapubische katheter die in de blaaskoepel is ingebracht en vastgebonden, evenals de urethrale katheter die door de externe opening is ingebracht. De urethrale katheter is op de foto aangesloten om aan te tonen dat de blaasdruk tijdens de perfusie via de blaaskatheter wordt verhoogd. Tijdens het experiment zou de buikopening worden dichtgezonderd, maar werd hier opengelaten om visualisatie van de urineblaas mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Van primair belang voor de succesvolle meting van stretch-gemedieerde ATP-afgifte in de knaagdierblaas is ervoor te zorgen dat de mictiereflex wordt geblokkeerd, waardoor de blaas kan worden opgezwollen boven de drempeldruk die normaal voldoende is om de mictiereflex te activeren. Zoals te zien is in figuur 2A, wanneer de urethrale katheter is aangesloten, zorgt infusie van de oplossing in de blaas ervoor dat de intravesicale druk sterk stijgt naarmate de blaas samentrekt. Omdat we geïnteresseerd zijn in de effecten van passieve stretch, niet contractie, op urotheliale ATP-afgifte, wordt het dier behandeld met een ganglionische blokker, hexamethonium, om de mictiereflex te voorkomen. Zoals blijkt uit figuur 2B, resulteert instillatie van de oplossing in de blaas met de urethrale katheter geblokkeerd bij toediening van hexamethonium in een veel geleidelijkere stijging van de intravesicale druk, waardoor de druk zonder contractie kan oplopen tot 30 cm H₂O. Dit maakt het mogelijk om de luminale ATP-afgifte te meten bij drukken die hoog genoeg zijn om relevant te zijn voor pathologie, zoals die waargenomen in een onderactieve blaas, gedeeltelijke obstructie van de blaasuitlaat of tijdens detrusor-sfincter dyssynergie na ruggenmergletsel. Hoewel het een aanvullende dosis hexamethonium kan vereisen om de mictiereflex volledig te blokkeren, moet ervoor worden gezorgd dat niet genoeg wordt toegediend om te resulteren in een overdosis. Dit kan leiden tot een aanzienlijk verminderde cardiale output en de kwaliteit van het experiment in gevaar brengen. Opgemerkt moet worden dat hetzelfde remmende effect op de blaasreflex kan worden verkregen door de bekkenzenuwen bilateraal door te snijden of het ruggenmerg af te snijden op niveau L4 of hoger. Dit verhoogt natuurlijk de moeilijkheidsgraad van de experimentele opstelling en de tijd die nodig is om het experiment te voltooien aanzienlijk.

Figuur 2: Drukregistraties van ratten. Voor (A) en na (B) ganglionisch blok. Pijlen geven aan wanneer de urethrale katheter is aangesloten. Merk op dat de druk in het bovenste spoor snel toeneemt wanneer de druk de drempel bereikt om mictie te induceren, terwijl de druk in het onderste spoor geleidelijk stijgt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een andere zeer belangrijke overweging voor deze experimenten is om te zorgen voor een goede omzetting van de luminometermetingen (normaal uitgedrukt in RRU's) naar een concentratie ATP met behulp van standaardcurven. De luciferine/luciferase reactie is zeer gevoelig voor storende stoffen¹³. Deze interferentie kan voortkomen uit een directe interactie met luciferine/luciferase. Een aantal verbindingen kan bijvoorbeeld fungeren als concurrerende of niet-competitieve remmers van luciferase; een studie suggereerde dat ~ 3% van de verbindingen in de Molecular Libraries Small Molecule Repository vuurvlieg luciferase zou kunnen remmen bij concentraties onder 11 μM¹⁴. Bovendien is luciferine gevoelig voor oxidatiemiddelen, waardoor de hoeveelheid substraat die beschikbaar is voor de luminescentieproducerende reactie wordt verminderd¹⁵. Het is ook mogelijk om de luciferine/luciferase reactie te verstoren door de beschikbaarheid van de co-factor van de reactie, magnesium, te veranderen. Een veelgebruikte techniek voor het nabootsen van mechanische stretch in in vitro ATP-experimenten is bijvoorbeeld het induceren van celzwelling door de osmolariteit van de perfuserende oplossing te verminderen. Veel onderzoekers bereiken deze reductie echter door de oplossing met water te verdunnen, waardoor de concentratie magnesium die beschikbaar is om als co-factor in de luciferine / luciferasereactie te fungeren, wordt verminderd. Bovendien worden sommige geneesmiddelen verkocht als magnesiumzouten, die de hoeveelheid magnesium in de oplossing aanzienlijk kunnen verhogen, wat ook leidt tot meetbare verschillen in luminescentiemetingen. Ten slotte is het mogelijk dat een medicijnoplossing interfereert met het vermogen om het licht dat wordt geproduceerd door de luciferine / luciferase-reactie nauwkeurig te meten. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, ook bekend als erioglaucine of FD &C Blue dye # 1) is een specifieke remmer van pannexin-gemedieerde ATP-release¹⁶. Bij effectieve doses heeft brilliant blue FCF-oplossing een duidelijke blauwe tint, die licht absorbeert bij een piek van ongeveer 600 nm¹⁷. Dit is binnen het bereik van golflengten van licht dat wordt uitgezonden door vuurvlieg luciferase; daarom wordt de lichtemissie in experimenten met BB-FCF sterk verminderd. Het is dus absoluut noodzakelijk dat standaardcurven met behulp van bekende hoeveelheden ATP opgelost in oplossingen die elk experimenteel geneesmiddel bevatten, worden gebruikt om de ATP-afgifte tijdens het experiment te kwantificeren. Zoals te zien is in figuur 3, verlaagt BB-FCF (100 μM) de helling van de standaardcurve aanzienlijk, wat voldoende is om de berekende waarden voor de concentratie van ATP in het monster significant te wijzigen. Zoals onderaan figuur 3 te zien is, kan het gebruik van de Krebs-standaard om de concentratie ATP te berekenen in een monster dat BB-FCF bevat, resulteren in een onderschatting van de ATP-concentratie met ~ 50%. In sommige gevallen kan het gebruik van de verkeerde standaardcurve een door drugs gemedieerde verandering in ATP-afgifte verdoezelen of het ten onrechte laten lijken alsof er een verandering is opgetreden. In het experiment dat in figuur 3 wordt weergegeven, bijvoorbeeld, zou het gebruik van de Krebs-standaard voor alle monsters hebben doen lijken dat Brilliant Blue FCF de ATP-afgifte met ~ 67% (16,6 tot 5,5 nM) verminderde, terwijl het in werkelijkheid slechts ~ 42% (16,6 tot 9,6 nM) was afgenomen.

Figuur 3: Effecten van experimentele geneesmiddelen op de ATP-standaardcurve. Merk op dat de pannexinekanaalantagonist, Brilliant Blue, de RRU's die worden gemeten voor een bepaalde concentratie ATP aanzienlijk verandert, wat zou resulteren in een onderschatting van de gemeten ATP, zo niet gecorrigeerd voor. Afkorting: RKU's = Relative Light Units; BB-FCF = Briljant Blauw FCF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een andere overweging om in gedachten te houden is dat ATP vaak vrijkomt uit weefsels als gevolg van schade, en dat deze chirurgische procedures en het inbrengen van urethrale katheters zullen resulteren in abnormaal hoge ATP-metingen als ze te snel na de installatie worden genomen. Deze procedure beschrijft een uitwasperiode van 1 uur nadat het experiment is opgezet, die niet mag worden overgeslagen. We hebben ontdekt dat na 1 uur ATP-concentraties gemeten in monsters die zijn genomen wanneer de blaas niet is opgezwollen, relatief laag zijn (~ 10-30 nM), terwijl monsters die vóór de uitwasperiode zijn genomen, een orde van grootte hoger kunnen lezen. Korte, 5 minuten washouts moeten ook worden uitgevoerd tussen uitzettingen, omdat ATP-niveaus gedurende een korte periode verhoogd kunnen blijven. Een goede vuistregel zou zijn om ATP in meerdere monsters te meten aan het begin van het experiment en na elke uitzetting en alleen verder te gaan wanneer ATP-metingen afvlakken. In figuur 4 tonen we een weergave van een typisch experiment met metingen die op verschillende tijdstippen zijn uitgevoerd. Let op de hoge metingen die vóór de washout zijn genomen (monsters # 1 en # 5) versus die na het wassen zijn genomen (monsters # 2 en # 6).

Figuur 4: Weergave van een typisch experiment. Een gestileerde weergave van een typische drukopname. Elk getal vertegenwoordigt een tijdstip waarop een monster werd genomen en gemeten voor ATP: 1) onmiddellijk nadat de installatie is voltooid, vóór de uitwasperiode, 2) na een wastijd van 1 uur, 3) onmiddellijk voorafgaand aan een uitzetting, 4) tijdens uitzetting, 5) onmiddellijk na een uitzetting en 6) na een korte uitwasperiode na de uitzetting. De inzettabel toont representatieve RLU-waarden en ATP-concentraties voor elk monster. Afkorting: RLU's = Relative Light Units. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5 toont representatieve grafieken van experimentele resultaten die het mechanisme van ATP-afgifte uit het urotheel onderzoeken. Zoals te zien is in figuur 5A, veroorzaakt toenemende druk een significante toename van de concentratie ATP in het lumen van de blaas, waarbij drukken van 30 cm water de concentraties bijna 2,5x van de niet-opgezwollen controles verhogen. Intravesicale perfusie van 2 U/ml apyrase, een enzym dat de hydrolyse van ATP katalyseert, verlaagt de gemeten concentratie van ATP in het blaaslumen aanzienlijk. Omgekeerd verhoogt intravesicale perfusie van ARL67156, een remmer van NTPDases aanwezig op het urotheel, de luminale ATP-concentraties aanzienlijk. Figuur 5B toont de experimenten naar het mechanisme van stretch-geïnduceerde ATP-afgifte uit het urotheel. Perfusie met de pannexinekanaalantagonisten Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) of carbenoxolon (CBX, 100 μM) vermindert de afgifte van ATP in het blaaslumen bij alle drukken aanzienlijk. Luminale ATP-concentraties worden niet verminderd wanneer de connexineblokker 18α-glycyrrhetinezuur wordt doordrenkt, wat aangeeft dat door distensie opgewekte ATP-afgifte wordt gemedieerd door pannexinekanalen en niet door connexinekanalen.

Figuur 5: Representatieve metingen van door distensie opgewekte ATP-afgifte in het lumen van de urineblaas. (A) Uitzetting van de blaas verhoogt luminale ATP-concentraties, die kunnen worden verminderd in aanwezigheid van de NTPDase-apyrase (2 U / ml) of verhoogd wanneer endogene NTPDases worden geremd met ARL67156 (10 μM). (B) Distensie-geëvoceerde ATP-afgifte wordt geblokkeerd door de pannexinekanaalantagonisten Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) en carbenoxolon (CBX, 100 μM), maar niet door de connexinekanaalantagonist 18α-glycyrrhetininezuur (18α-GA, 50 μM). Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde met standaard foutbalken. ** p < 0,05 tussen de twee balken die door de lijn worden aangegeven, ## p < 0,05 in vergelijking met Krebs-controles bij dezelfde uitzetting. Deze figuur is met toestemming van Beckel et ^al.8 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het grootste deel van het onderzoek naar urotheliale ATP-afgifte wordt uitgevoerd in gekweekte cellen, met behulp van onsterfelijke cellijnen of primaire culturen van knaagdierurotheelcellen. Hoewel deze modellen het voordeel hebben dat ze een relatief hoge doorvoersnelheid hebben (d.w.z. één cultuur / passage kan veel platen / schotels van cellen maken), wordt hun fysiologische relevantie verminderd als gevolg van: 1) het onvermogen van urotheelcellen om gepolariseerd te groeien tenzij ze op speciale steunen worden gekweekt en 2) de moeilijkheid om gekweekte cellen bloot te stellen aan fysiologische niveaus van rek / druk. Een manier om met deze beperkingen om te gaan, is door de blaas van een knaagdier te verwijderen, open te snijden en in een Ussing-kamer te plaatsen, waarbij het blaasweefsel tussen twee halve kamers gevuld met fysiologische oplossing wordt ingebracht. Hierdoor kan de onderzoeker het urotheel, in zijn oorspronkelijke gepolariseerde toestand, onderwerpen aan uitzetting door volume toe te voegen aan de urotheliale kant van de kamer, waardoor het blaasweefsel in de kamer wordt uitgerekt. Het is echter moeilijk om deze rek te relateren aan de uitzetting die het urotheel in vivo ziet. Bovendien wordt uitgelokte ATP in de Ussing-kamer vrijgegeven in het grote volume fysiologische vloeistof in de kamer, waardoor de concentratie van ATP meerdere malen wordt verdund. Met behulp van deze procedure wordt de blaasdruk direct gemeten, zodat de uitzetting in een bereik kan worden gehouden dat relevant is voor fysiologie of pathofysiologie. Bovendien, aangezien we de ATP-concentratie rechtstreeks uit de luminale vloeistof meten en niet uit een willekeurige en overmatige hoeveelheid vloeistof die wordt gebruikt om weefsel in vitro te behouden, hoeft de gemeten concentratie niet te worden gecorrigeerd. De procedure die in dit artikel wordt beschreven, stelt de onderzoeker dus in staat om de ATP-afgifte in het blaaslumen te onderzoeken onder omstandigheden die veel meer lijken op fysiologische of pathofysiologische omstandigheden van de blaas.

De beschreven techniek lijkt sterk op standaard cystometrietechnieken die worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen op reflexblaasactiviteit te bestuderen en moet gemakkelijk worden uitgevoerd door iedereen die deze experimenten routinematig uitvoert. Voor die onderzoekers die nieuw zijn bij blaaskatheterisatie, zijn er echter een paar kanttekeningen om rekening mee te houden. Ten eerste kan transurethrale katheterisatie moeilijk zijn voor onervarenen vanwege de kromming van de urethra van het knaagdier. Dit kan ook worden bemoeilijkt door de strakheid van de externe urethrale sluitspier, zelfs onder urethaananesthesie. Het is absoluut noodzakelijk dat de onderzoeker niet probeert de katheter in de urethra te dwingen, omdat dit hoogstwaarschijnlijk verhoogde ontsteking en zwelling zal veroorzaken, wat op zijn beurt de urethra nog moeilijker zal maken om met succes te katheteriseren. Bovendien is het mogelijk om de katheter door de wand van de urethra te prikken, waardoor het hele experiment wordt verpest.

We hebben enkele tips en trucs ontwikkeld om de slagingspercentage te verhogen. Het is bijvoorbeeld soms nodig om het dier nog een korte dosis geïnhaleerd isofluraan (0,5% -1,0%) te geven om de urethrale sluitspier te ontspannen. Dit moet spaarzaam en met zorg worden uitgevoerd, omdat de combinatie van urethaan en isofluraan kan leiden tot ademhalingsdepressie. Een andere truc is om de punt van de katheter in een 2% lidocaïne-oplossing te dopen voordat deze in de externe urethrale opening wordt ingebracht; dit zorgt er vaak voor dat de sluitspier na een paar minuten ontspant. Het legen van de blaas door zachtjes op de buik van het dier te drukken, kan ook helpen de urethrale sluitspier te ontspannen. Ten slotte kan het nodig zijn om een katheter met een kleinere gauge te gebruiken; we gebruiken soms een katheter van 24 G, vooral bij kleinere dieren. Houd er echter rekening mee dat het nodig kan zijn om de infusiesnelheid in de blaas te verlagen bij gebruik van een kleinere transurethrale katheter, om de langzamere drainage van de urethrale katheter te evenaren. Als u dit niet doet, zou de blaasdruk stijgen, ondanks het feit dat de urethrale katheter niet is afgedekt.

Opgemerkt moet worden dat urethaan wordt gebruikt als een verdovingsmiddel in dit protocol. Urethaan wordt vaak gebruikt in laboratoria die de lagere urinewegen bestuderen, omdat het de mictiereflex spaart, terwijl andere anesthetica dat niet doen. Hierdoor zal uitzetting van de blaas boven een druk van ~7-10 cm H₂O onder urethaan anesthesie een mictiereflex veroorzaken. Omdat we geïnteresseerd zijn in ATP-afgifte als reactie op passieve uitzetting, roept dit protocol op tot het blokkeren van blaascontracties met behulp van de ganglionische blokker hexamethonium. Dit maakt het mogelijk om atp-afgifte te meten als reactie op de hogere intravesicale drukken (d.w.z. 30 cm H₂O) die vaak worden gezien bij blaaspathologie met uitlaatobstructie. Daarom maakt het gebruik van een urethaan / hexamethonium het mogelijk om de door distensie opgewekte luminale ATP-afgifte gedurende lange perioden te meten (de werkingsduur van beide geneesmiddelen wordt gemeten in uren). Sommige laboratoria geven er echter de voorkeur aan om een verdovingsmiddel te gebruiken dat de mictiereflex, zoals ketamine, niet spaart en de noodzaak van een ganglionische blokker elimineert. Dit zal ook goed werken voor deze procedure, hoewel het frequentere (of continue) toediening vereist vanwege de kortere werkingsduur van het verdovingsmiddel.

Een opmerkelijk verschil tussen deze techniek om ATP te meten en de gebruikelijke cystometrie-setup waar urologieonderzoekers bekend mee kunnen zijn, is het gebruik van gebufferde Krebs-oplossing als perfusaat in plaats van de standaard isotone zoutoplossing. ATP is een vrij labiel molecuul en is enigszins gestabiliseerd in een gebufferde oplossing. Bovendien ligt de samenstelling van Krebs-oplossing veel dichter bij die van urine dan zoutoplossing, wat verder klinische relevantie toevoegt aan deze experimenten. Dit is een belangrijke overweging, omdat is aangetoond dat de controle van urotheliale ATP-afgifte wordt gemoduleerd door calciumdoorlatende kanalen en het gebrek aan calcium in normale zoutoplossing de ATP-afgifte negatief kan beïnvloeden. De instabiliteit van ATP in oplossing is ook de reden waarom we voorstellen dat monsters onmiddellijk worden gekwantificeerd met behulp van de luciferine-luciferasereactie. Als de onderzoeker de monsters echter niet onmiddellijk kan lezen, moeten de monsters zo snel mogelijk worden ingevroren om de afbraak van ATP te beperken.

Een beperking van deze techniek is dat het alleen luminale ATP-afgifte meet en de ATP-afgifte van de serosale kant van het urotheel niet kan meten. Er wordt aangenomen dat ATP wordt vrijgegeven van de serosale kant om de afferente prikkelbaarheid direct te beïnvloeden; directe meting van deze afgifte is echter moeilijk. In dit geval is het gebruik van cellen gekweekt op doorlatende membraansteunen zoals Transwell-platen of het operatief verwijderen van het urotheel voor Ussing-kamerexperimenten de voorkeurstechniek. Gezien het schijnbare belang van luminale ATP in blaaspathologie, is dit experimentele model echter een nuttig hulpmiddel om de cellulaire mechanismen op te helderen die de afgifte van urotheliale ATP tijdens pathologie regelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose