Summary
该协议描述了在麻醉啮齿动物中测量膀胱腔中ATP浓度的程序。
Abstract
ATP 因膀胱扩张而从尿路上皮释放，被认为在控制排尿中起显著的感觉作用。因此，在生理环境中准确测量尿路上皮ATP释放是研究控制膀胱嘌呤能信号传导机制的重要第一步。研究机械诱发尿路上皮ATP释放的现有技术利用接种在柔性支架上的培养细胞或固定在Ussing室中的膀胱组织;然而，这些技术中的每一种都不能完全模拟完整膀胱的状况。因此，开发了一种实验装置来直接测量啮齿动物膀胱管腔中的ATP浓度。
在这种设置中，麻醉啮齿动物的膀胱通过膀胱圆 顶和尿 道外口的导管灌注。通过盖住尿道导管，同时通过圆顶将无菌液体注入膀胱来增加膀胱中的压力。使用连接到膀胱圆顶导管的压力传感器实现膀胱内压力的测量，类似于用于膀胱测量的设置。一旦达到所需的压力，取下尿道导管的盖，并通过荧光素-荧光素酶测定收集液体用于ATP定量。通过这种实验装置，可以通过在灌注液中加入各种激动剂或拮抗剂或通过比较野生型和转基因动物之间的结果来询问控制尿路上皮ATP释放的机械和化学刺激的机制。
Introduction
尿 ATP 被认为在控制排尿中起显着的感觉作用1.例如，人们认为ATP从尿路上皮释放以响应膨胀，它可以作用于膀胱传入神经上的受体以增加其兴奋性，从而导致饱腹感2。因此，人们还认为尿ATP可能是膀胱病变发展的重要参与者。为了支持这一假设，患有膀胱过度活动症（OAB）3，膀胱疼痛综合征/间质性膀胱炎（BPS / IC）4或尿路感染（UTI）的患者的尿ATP浓度显着增加5，6，所有情况的特征都是增加的紧迫性，频率和有时疼痛。相反，患有膀胱活动不足（UAB）的患者，其特征是无法排空膀胱，有时可能包括感知膀胱充盈的能力下降，已被证明尿ATP浓度降低7。实验上，尿ATP浓度的操作可以改变大鼠的膀胱反射;通过阻断膀胱腔中的内源性ATP酶来增加ATP浓度可以增加排尿频率，而通过将外源性ATP酶注入膀胱来降低ATP浓度会降低排尿频率8。因此，尿ATP对膀胱功能的重要性是显而易见的。
鉴于尿ATP对膀胱病理学的明显重要性，准确测量尿路上皮ATP释放是了解控制释放机制的重要一步。许多研究已经使用不同的实验模型来完成测量尿路上皮ATP的释放。其中最重要的是细胞培养物，原代培养物或细胞系。然而，培养的尿路上皮细胞的使用很复杂，因为尿路上皮细胞不会呈现其生理极化形态，除非它们生长在特殊的可渗透膜上（例如Transwell技术[孔插入]）9。因此，很难将测量的任何ATP释放与生理学联系起来。在孔插入物上生长的尿路上皮细胞可以极化并形成类似于 体内看到的屏障;然而，完全分化的尿路上皮的生长可能需要数天或数周。此外，虽然可以将孔插入室安装到Ussing室中并向顶端侧施加压力以引起拉伸，但在病理期间很难施加足够的压力来模拟膀胱内的情况（即，压力为30cm H2O或以上）。整个膀胱组织也可以安装在Ussing室中进行拉伸实验，但这会将膀胱与维持尿路上皮细胞健康的营养因子一起从生物体中移除，从而维持尿路上皮屏障功能。因此，研究ATP响应拉伸或压力从尿路上皮释放的最生理相关方法是 体内。建立实验所需的手术技术与动物膀胱测量中常用的技术相同，因此，任何熟悉该技术的人都应该很容易进行。
在该协议中，我们将描述用于检查体重约200-250g的雌性Sprague Dawley大鼠管腔ATP的技术，因为下面描述的经尿道导管插入术在雌性中要容易得多;然而，经尿道导尿术也可以在雄性啮齿动物中进行10。由于经尿道导管插入术现在已经在两性小鼠中进行11，因此根据研究小组的需要，这些实验可以很容易地适用于小鼠或任何性别或不同大小的大鼠。
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Protocol
在啮齿动物中执行的所有程序必须遵守适用的准则，并得到当地机构伦理审查委员会的批准。为该手稿进行的实验是根据国家研究委员会的实验动物护理和使用指南进行的，并得到了匹兹堡大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。有关此协议中使用的标准啮齿动物膀胱测量设置的修改版本，请参见 图1 。
1. 实验动物
- 将大鼠维持在社会住房中（一个笼子中的多种啮齿动物），具有12小时的光照/黑暗循环，并 随意 获得水和食物颗粒。
2.麻醉和神经节阻滞
- 通过将动物置于用O2 （1L / min）中的4%-5%异氟醚气体的封闭盒中来诱导初始麻醉。
- 使用聚氨酯麻醉动物。
- 双侧皮下注射聚氨酯（动物两侧各1/2剂量），剂量为1.2g / kg。将动物放在笼子里，让聚氨酯生效，这通常需要2小时。
- 或者，腹膜内（ip）给药聚氨酯，间隔~10分钟以两个单独的剂量注射全剂量。
- 在等待聚氨酯生效的适当时间（皮下：2小时，ip：30分钟）后，通过使用镊子捏住动物的脚来测试适当的麻醉平面。如果观察到反射，给予额外剂量的聚氨酯（0.05-0.1mL ip），等待15分钟，然后再次测试。在整个过程中继续监测动物的适当麻醉平面。
- 为了防止膨胀期间膀胱收缩，给动物注射神经节阻滞剂，如六甲铵（20mg / kg，ip）。
- 将眼药膏涂抹在动物的眼睛上，以防止在实验过程中干燥。
3.外科手术-耻骨上膀胱导尿术
- 剃掉动物的腹部并进行中线剖腹手术以暴露膀胱。
- 使用火焰燃烧短（~10-15 cm）长的PE50内用导管的一端来准备导管。将22 G针头放入管子的另一端，并填充克雷布斯溶液（成分见 材料表 ）。
- 在膀胱圆顶上放置一小圈 3-0 丝缝线，并进行足够大的小型膀胱造口术（使用细剪刀或 18 G 针头）以插入上面制造的导管的喇叭形端。用一只手握住导管，用另一只手拧紧缝合线的环，将导管固定到位。通过在缝合线上打两个结并将导管拉回，直到喇叭头与膀胱壁接触，完成导管的固定。
- 或者，使用经典的钱包绳缝合技术固定导管，如前面的膀胱测量12所述。
注意：在此过程中，必须不要将气泡引入膀胱。
- 或者，使用经典的钱包绳缝合技术固定导管，如前面的膀胱测量12所述。
- 通过导管注入少量克雷布斯溶液来测试设置的泄漏。如果液体从膀胱造口术中泄漏出来，请在膀胱造口周围用额外的缝合线重新固定导管。
4.经尿道导尿
- 将 20 G x 1“ 静脉注射导管（移除针头）的末端浸入手术润滑剂中。
- 用一对镊子轻轻握住尿道外道口，并将导管尖端沿尾部方向插入尿道口，直到尖端导致相邻阴道口的壁变形。将导管旋转 90°（使导管的 Luer-Lock 端朝向尾部）并轻轻前进。完全插入导管，直到 Luer-Lock 集线器距离尿道外开口约 5 mm。
注意：请勿将导管插入太远，这可能会导致尖端戳到膀胱内壁。如果在推进导管时感到阻力，请停止并重新开始，否则可能会刺穿尿道。请参阅讨论部分，了解增加成功导尿的技巧。 - 固定导管并防止导管周围泄漏，方法是在尿道外道口周围缠绕一小段 3-0 丝线并将其系紧。用胶带将导管固定在尾部，以防止其意外拉出。
- 导尿后，通过耻骨上膀胱导管轻轻地将克雷布斯溶液注入膀胱，并确认液体从尿道导管流出而不是在其周围。如有必要，重新缝合尿道外口周围的缝合线。
- 使用3-0丝线关闭膀胱上的腹部切口。
5. 实验设置
- 将动物固定在能够倾斜以帮助通过尿道导管排出膀胱内液体的板上。在动物和板之间放置加热垫和吸收垫，以保持身体热量并吸收从尿道导管排出的液体。
- 将耻骨上导管连接到三通旋塞阀，三通旋塞阀将导管连接到注射泵和压力传感器。通过放大器和数据采集系统将压力传感器连接到计算机。
注意：应注意防止在连接注射泵、换能器和膀胱导管的管道中形成气泡。 - 使用压力传感器和/或数据采集软件制造商建议的程序校准气囊压力记录。
- 以 0.1 mL/min 的速率通过耻骨上导管输注 Krebs 溶液，让液体从尿道导管排出 1 小时，以洗掉导管植入期间释放的任何残留 ATP。
- 在此冲洗期之后，使用鲁尔锁塞盖住尿道导管并测量膀胱中的压力。寻找膀胱内压力缓慢上升至30cm H 2 O的压力，而压力没有急剧增加，这表明膀胱收缩（见图2）。当压力达到30cm H2O时，从尿道导管上取下塞子，以防止对膀胱造成损害。
注意：如果膀胱收缩在1小时后继续发生，请给予额外剂量的六甲铵（5mg / kg剂量ip）。
6. 样品采集
- 以 0.1 mL/min 的速度输注膀胱，并从尿道导管收集洗脱液。立即检测 100 μL 洗脱液的 ATP（见下文）或冷冻以进行后续批次定量。
- 为了测试膀胱扩张对管腔ATP浓度的影响，用塞子盖住尿道导管并监测膀胱压力，直到达到所需水平。然后，如上所述，打开尿道导管的盖子并收集洗脱液以进行ATP测量或冷冻。
- 每次膨胀后，让膀胱休息并冲洗10-15分钟，然后再采集其他样品。在每个所需的膨胀压力下总共取3-5个预膨胀样品和3-5个样品以证明可重复性。
- 为了测试药物对ATP释放的影响，请将输注膀胱的克雷布斯溶液切换到含有所选药物的克雷布斯。以0.1mL / min的速度灌注10-15分钟以使药物起作用，然后如步骤6.1和6.2中所述从未膨胀和膨胀的膀胱中收集样品。
7. 从收集的样品中量化 ATP
- 按照制造商的说明和光度计，使用市售的荧光素/荧光素酶检测试剂盒定量收集的 100 μL 样品中的 ATP。
- 要量化 ATP，请将 100 μL 灌注液样品与 50 μL 测定混合物混合，并将它们放入光度计中读数。要将光度计报告的相对光单位 （RLU） 转换为 ATP 浓度，请在克雷布斯溶液中以 10 倍稀释液连续稀释 ATP，范围从 1 μM 到 10 pM，以创建标准曲线并在光度计中读取它们。在图表上绘制结果读数并执行非线性（二次）回归以从动物身上采集的样品中推断浓度。
注意：为实验中测试的任何药物溶液制定ATP标准品很重要，因为许多药物会干扰荧光素/荧光素酶反应，必须纠正。
- 要量化 ATP，请将 100 μL 灌注液样品与 50 μL 测定混合物混合，并将它们放入光度计中读数。要将光度计报告的相对光单位 （RLU） 转换为 ATP 浓度，请在克雷布斯溶液中以 10 倍稀释液连续稀释 ATP，范围从 1 μM 到 10 pM，以创建标准曲线并在光度计中读取它们。在图表上绘制结果读数并执行非线性（二次）回归以从动物身上采集的样品中推断浓度。
8. 动物安乐死
- 当实验完成并收集所有样本时，根据美国农业部指南和国家研究委员会的实验动物护理和使用指南对动物实施人道安乐死。
- 从实验装置中取出麻醉动物，将其放入封闭的盒子中，并用100%CO2充气。确保填充率等于每分钟腔室体积的 30%-70%（例如，对于容量为 10 L 的盒子，填充率为 3-7 L/min）。呼吸停止后继续CO2 流动至少1分钟。
- 使用第二种形式的安乐死来确保死亡。
- 通过抓住胸骨尾端的小皮瓣，并用一把锋利的剪刀在横膈膜的皮肤和肌肉组织上切一个小孔，进行开胸术作为安乐死的次要形式。通过将剪刀插入开口并切开肋骨并露出胸腔来完成开胸术。
注意：安乐死的动物应根据机构指南进行处理。
- 通过抓住胸骨尾端的小皮瓣，并用一把锋利的剪刀在横膈膜的皮肤和肌肉组织上切一个小孔，进行开胸术作为安乐死的次要形式。通过将剪刀插入开口并切开肋骨并露出胸腔来完成开胸术。
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Representative Results
所描述的方案允许使用标准啮齿动物膀胱测量设置的修改版本准确测量膀胱 腔体内尿 路上皮ATP释放（见 图1）。这使得研究人员能够在生理环境中检查药物对拉伸介导的ATP释放的影响。
图 1：实验设置。 （A） 显示实验设置的图像，并标记了各种设备。红色矩形中勾勒的动物区域显示在 B 中。 （B）描绘手术后大鼠腹部的照片。注意耻骨上导管插入并绑在膀胱圆顶中，以及通过外孔插入的尿道导管。照片中插入尿道导管，以显示通过膀胱导管灌注时膀胱压力升高。在实验过程中，腹部开口将被缝合关闭，但在此处保持开放以允许膀胱的可视化。请点击此处查看此图的大图。
成功测量啮齿动物膀胱中拉伸介导的ATP释放的首要目标是确保排尿反射被阻断，使膀胱膨胀超过通常足以激活排尿反射的阈值压力。如图 2A所示，当尿道导管堵塞时，将溶液输注到膀胱中会导致膀胱内压力随着膀胱收缩而急剧上升。由于我们对被动拉伸而不是收缩对尿路上皮ATP释放的影响感兴趣，因此用神经节阻滞剂六甲铵治疗动物以防止排尿反射。如图 2B所示，当施用六甲铵时，将溶液滴入膀胱并堵塞尿道导管会导致膀胱内压力更逐渐升高，使压力上升至30cm H2O而不收缩。这允许在足够高的压力下测量管腔 ATP 释放，以与病理学相关，例如在膀胱活动不足、膀胱部分出口梗阻或脊髓损伤后逼尿肌-括约肌协同障碍期间观察到的那些。虽然可能需要补充剂量的六甲铵才能完全阻断排尿反射，但应注意不要给予足够的剂量以致于导致过量。这可能导致心输出量显着降低并影响实验质量。需要注意的是，通过双侧切割盆腔神经或切断L4级或以上的脊髓，可以获得对膀胱反射的相同抑制作用。当然，这大大增加了实验设置的难度和完成实验所需的时间。
图2：来自大鼠的压力记录。 在 （A） 和 （B） 神经节传导阻滞之前和之后。箭头表示尿道导管何时堵塞。请注意，当压力达到诱导排尿的阈值时，顶部迹线中的压力迅速增加，而底部迹线中的压力逐渐升高。 请点击此处查看此图的大图。
这些实验的另一个非常重要的考虑因素是确保使用标准曲线将光度计读数（通常以RLU表示）正确转换为ATP浓度。荧光素/荧光素酶反应对干扰剂非常敏感13。这种干扰可能来自与荧光素/荧光素酶的直接相互作用。例如，许多化合物可以作为荧光素酶的竞争性或非竞争性抑制剂;一项研究表明，分子库小分子存储库中~3%的化合物可以在浓度低于11μM14时抑制萤火虫荧光素酶。此外，荧光素易受氧化剂的影响，从而减少了可用于发光反应的底物量15。也可以通过改变反应的辅助因子镁的可用性来干扰荧光素/荧光素酶反应。例如，在 体外 ATP实验中模拟机械拉伸的一种常见技术是通过降低灌注溶液的渗透压来诱导细胞膨胀。然而，许多研究人员通过用水稀释溶液来实现这种减少，降低可用于作为荧光素/荧光素酶反应辅助因子的镁的浓度。此外，一些药物以镁盐的形式出售，这会大大增加溶液中镁的含量，也会导致发光读数的可测量差异。最后，药物溶液可能会干扰准确测量荧光素/荧光素酶反应产生的光的能力。Brilliant Blue FCF（BB-FCF，也称为erioglaucine或FD&C Blue dye #1）是膜联蛋白介导的ATP释放16的特异性抑制剂。在有效剂量下，亮蓝FCF溶液具有独特的蓝色色调，可吸收约600nm峰值的光17。这在萤火虫荧光素酶发出的光波长范围内;因此，BB-FCF实验中的发光大大降低。因此，必须使用使用溶解在含有每种实验药物的溶液中的已知量的ATP的标准曲线来量化实验过程中的ATP释放。如图 3所示，BB-FCF（100μM）显着降低了标准曲线的斜率，这足以显着改变样品中ATP浓度的计算值。如图 3底部所示，使用克雷布斯标准品计算含有BB-FCF的样品中ATP的浓度可能导致ATP浓度被低估~50%。在某些情况下，使用错误的标准曲线可能会掩盖药物介导的ATP释放变化，或者使其错误地看起来像发生了变化。例如，在 图3所示的实验中，对所有样品使用克雷布斯标准品会使亮蓝FCF将ATP释放降低~67%（16.6至5.5nM），而实际上，它仅降低了~42%（16.6至9.6nM）。
图3：实验药物对ATP标准曲线的影响。 请注意，膜联蛋白通道拮抗剂亮蓝会显着改变针对任何给定浓度的ATP测量的RLU，如果不加以纠正，这将导致低估所测量的ATP。缩写：RLUs = 相对光单位;BB-FCF = 亮蓝色 FCF。 请点击此处查看此图的大图。
另一个要记住的考虑因素是，ATP通常由于损伤而从组织中释放出来，如果在设置后过早服用，这些外科手术和尿道导管插入将导致异常高的ATP读数。此过程描述了实验设置后的1小时洗脱期，不应跳过。我们发现，1小时后，在膀胱未膨胀时采集的样品中测量的ATP浓度相对较低（~10-30nM），而在洗脱期之前采集的样品可以读取一个数量级。在扩张之间也应进行短促的 5 分钟冲洗，因为 ATP 水平可以在短时间内保持升高。一个好的经验法则是在实验开始时和每次膨胀之后测量多个样品中的ATP，并且仅在ATP读数趋于平稳时才继续。 在图 4 中，我们展示了在不同时间点进行测量的典型实验的表示。请注意洗脱前采集的高读数（样品 #1 和 #5）与洗脱后采集的高读数（样品 #2 和 #6）。
图 4：典型实验的表示。 典型压力记录的风格化表示。每个数字代表采集和测量ATP样品的时间点：1）设置完成后立即，在洗脱期之前，2）在1小时洗脱期之后，3）在膨胀之前，4）在膨胀期间，5）在膨胀后立即，以及6）在膨胀后的短暂冲洗期之后。插图显示了每个样品的代表性RLU值和ATP浓度。缩写：RLUs = 相对光单位。 请点击此处查看此图的大图。
图5显示了检查尿路上皮释放ATP机制的实验结果的代表性图。如图5A所示，增加压力导致膀胱腔中ATP浓度显着增加，30厘米水的压力使浓度增加几乎是非膨胀对照的2.5倍。膀胱内灌注2U / mL的吡啶酶（一种催化ATP水解的酶）显着降低膀胱腔中ATP的测量浓度。相反，尿路上存在的NTPDase抑制剂ARL67156的膀胱内灌注显着增加管腔ATP浓度。图5B描述了拉伸诱导的ATP从尿路上皮释放机制的实验。用膜联蛋白通道拮抗剂亮蓝FCF（BB-FCF，100μM）或卡比诺酮（CBX，100μM）灌注在所有压力下显着减少ATP释放到膀胱腔中。当连接蛋白阻断剂 18α-甘草次酸灌注时，管腔 ATP 浓度不会降低，表明膨胀诱发的 ATP 释放是由膜联蛋白通道而不是连接蛋白通道介导的。
图 5：膀胱腔中膨胀诱发的 ATP 释放的代表性测量值。 （A）膀胱膨胀增加管腔ATP浓度，在NTPDase吡啶酶（2U / mL）存在下可以降低，或者在ARL67156（10μM）抑制内源性NTPDase时升高。（B）膨胀诱发的ATP释放被膜联蛋白通道拮抗剂亮蓝FCF（BB-FCF，100μM）和卡比诺酮（CBX，100μM）阻断，但不是连接蛋白通道拮抗剂18α-甘草次酸（18α-GA，50μM）。数据以平均值表示，带有标准误差线。** p <线指示的两个柱之间的 0.05，## p < 0.05 与相同膨胀下的克雷布斯控件相比。本图经贝克尔等人8许可转载。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
大多数关于尿路上皮ATP释放的研究都是在培养细胞中进行的，使用永生化细胞系或啮齿动物尿路上皮细胞的原代培养物。虽然这些模型具有相对高通量的优点（即，一次培养/传代可以制作许多细胞板/培养皿），但由于以下原因，它们的生理相关性降低：1）尿路上皮细胞无法生长极化，除非它们在特殊载体上生长，2）难以将培养的细胞暴露于生理水平的拉伸/压力。处理这些限制的一种方法是从啮齿动物身上取出膀胱，将其切开，然后将其放入Ussing室中，将膀胱组织插入两个充满生理溶液的半室之间。这允许研究人员通过增加腔室尿路上皮侧的体积来使处于天然极化状态的尿路上皮膨胀，从而导致腔室中的膀胱组织拉伸。然而，很难将这种拉伸与体内尿路上皮细胞看到的膨胀联系起来 。 此外，Ussing室中的膨胀诱发ATP被释放到腔室中包含的大量生理液中，使ATP的浓度稀释了几倍。使用该程序，直接测量膀胱压力，以便将膨胀保持在与生理学或病理生理学相关的范围内。此外，由于我们直接从管腔液中测量ATP浓度，而不是从用于体 外维持组织的任意和过量的液体中测量ATP浓度，因此测量的浓度不必校正。因此，本文中描述的程序允许研究人员在更接近膀胱生理或病理生理条件的条件下检查膀胱腔中的ATP释放。
所描述的技术与用于研究药物对反射性膀胱活动影响的标准膀胱测量技术非常相似，并且应该由常规进行这些实验的任何人轻松进行。然而，对于那些刚接触膀胱导管插入术的研究人员来说，有一些注意事项需要注意。首先，由于啮齿动物尿道的曲率，对于没有经验的人来说，经尿道导尿可能很困难。尿道外括约肌的紧绷也会使这更加困难，即使在聚氨酯麻醉下也是如此。研究人员必须不要试图将导管强行插入尿道，因为它很可能会引起炎症和肿胀的增加，这反过来又会使尿道更难成功导尿。此外，有可能将导管戳穿尿道壁，破坏整个实验。
我们开发了一些提高成功率的提示和技巧。例如，有时需要给动物再给予短剂量的吸入异氟醚（0.5%-1.0%）以放松尿道括约肌。这应该谨慎和小心地进行，因为聚氨酯和异氟醚的组合会导致呼吸抑制。另一个技巧是将导管尖端浸入 2% 利多卡因溶液中，然后将其插入尿道外孔;这通常会导致括约肌在几分钟后放松。通过轻轻按压动物的腹部来排空膀胱也有助于放松尿道括约肌。最后，可能需要使用较小规格的导管;我们有时使用 24 G 导管，尤其是对于较小的动物。但请记住，当使用较小规格的经尿道导管时，可能需要降低膀胱的输注速率，以匹配尿道导管的较慢引流。否则会导致膀胱压力升高，尽管尿道导管没有封盖。
应该注意的是，聚氨酯在该协议中用作麻醉剂。聚氨酯通常用于研究下尿路的实验室，因为它可以避免排尿反射，而其他麻醉剂则不能。因此，在聚氨酯麻醉下膀胱膨胀超过~7-10cm H2O的压力将触发排尿反射。由于我们对被动扩张的ATP释放感兴趣，因此该协议要求使用神经节阻滞剂六甲铵阻断膀胱收缩。这允许测量ATP释放，以响应涉及出口梗阻的膀胱病理学中常见的较高膀胱内压（即30cm H2O）。因此，使用聚氨酯/六甲铵可以长时间测量膨胀诱发的管腔ATP释放（两种药物的作用持续时间以小时为单位）。然而，一些实验室可能更喜欢使用不放过排尿反射的麻醉剂，例如氯胺酮，并消除对神经节阻滞剂的需求。这也适用于此过程，尽管由于麻醉剂的作用持续时间较短，它将需要更频繁（或连续）的给药。
这种测量ATP的技术与泌尿科研究人员可能熟悉的常见膀胱测量设置之间的一个值得注意的区别是使用缓冲的Krebs溶液作为灌注物，而不是标准的等渗盐水溶液。ATP是一种相当不稳定的分子，在缓冲溶液中有些稳定。此外，克雷布斯溶液的成分比盐水更接近尿液的成分，这进一步增加了这些实验的临床相关性。这是一个重要的考虑因素，因为尿路上皮ATP释放的控制已被证明是由钙渗透通道调节的，并且生理盐水中钙的缺乏可能会对ATP的释放产生负面影响。溶液中ATP的不稳定性也是我们建议使用荧光素-荧光素酶反应立即定量样品的原因。但是，如果研究人员无法立即读取样品，则应尽快冷冻样品，以限制ATP的降解。
该技术的一个局限性是它只能测量管腔ATP的释放，而不能测量尿路上皮浆膜侧的ATP释放。据信，ATP从浆膜侧释放，直接影响传入兴奋性;但是，很难直接测量此版本。在这种情况下，使用在透膜载体（例如Transwell板）上生长的细胞或手术去除尿路上皮进行Ussing室实验是首选技术。然而，鉴于管腔ATP在膀胱病理学中的明显重要性，该实验模型是阐明病理期间控制尿路上皮ATP释放的细胞机制的有用工具。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）对JMB（DK117884）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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