In vivo Mesure luminale de la libération d’ATP urothéliale évoquée par distension chez les rongeurs

Summary

Ce protocole décrit la procédure de mesure des concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie chez un rongeur anesthésié.

Abstract

On pense que l’ATP, libéré par l’urothélium en réponse à la distension de la vessie, joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction. Par conséquent, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale dans un contexte physiologique est une première étape importante dans l’étude des mécanismes qui contrôlent la signalisation purinergique dans la vessie. Les techniques existantes pour étudier la libération d’ATP urothéliale évoquée mécaniquement utilisent des cellules cultivées plaquées sur des supports flexibles ou des tissus vésicaux épinglés dans des chambres d’Ussing; Cependant, chacune de ces techniques n’imite pas complètement les conditions dans la vessie intacte. Par conséquent, une installation expérimentale a été développée pour mesurer directement les concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie des rongeurs.

Dans cette configuration, les vessies des rongeurs anesthésiés sont perfusées à travers des cathéters à la fois dans le dôme de la vessie et via l’orifice urétral externe. La pression dans la vessie est augmentée en coiffant le cathéter urétral tout en perfusant du liquide stérile dans la vessie à travers le dôme. La mesure de la pression intravésicale est réalisée à l’aide d’un transducteur de pression fixé au cathéter à dôme vésical, semblable à la configuration utilisée pour la cystométrie. Une fois la pression désirée atteinte, le capuchon du cathéter urétral est retiré et le liquide prélevé pour la quantification de l’ATP par dosage de la luciférine-luciférase. Grâce à cette configuration expérimentale, les mécanismes contrôlant à la fois la stimulation mécanique et chimique de la libération d’ATP urothéliale peuvent être interrogés en incluant divers agonistes ou antagonistes dans le perfusat ou en comparant les résultats entre les animaux de type sauvage et génétiquement modifiés.

Introduction

On pense que l’ATP urinaire joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction¹. Par exemple, on pense que l’ATP est libéré de l’urothélium en réponse à la distension où il peut agir sur les récepteurs des nerfs afférents de la vessie pour augmenter leur excitabilité, conduisant à des sensations de plénitude². Ainsi, on pense également que l’ATP urinaire pourrait être un acteur important dans le développement des pathologies de la vessie. À l’appui de cette hypothèse, les concentrations urinaires d’ATP sont significativement augmentées chez les patients souffrant d’hyperactivité vésicale (vessie hyperactive)³, de syndrome de douleur vésicale/cystite interstitielle (SPB/IC)⁴ ou d’infection des voies urinaires (IVU)^5,6, toutes conditions caractérisées par une urgence, une fréquence et^, parfois, une douleur accrues. À l’inverse, il a été démontré que les patients souffrant de vessie sous-active (UAB), qui se caractérise par une incapacité à vider sa vessie et peut parfois inclure une diminution de la capacité à sentir la plénitude de la vessie, ont diminué les concentrations urinaires^{d’ATP 7}. Expérimentalement, la manipulation des concentrations urinaires d’ATP peut modifier les réflexes vésicaux chez le rat; l’augmentation des concentrations d’ATP en bloquant les ATPases endogènes dans la lumière de la vessie peut augmenter la fréquence de miction, tandis que la diminution des concentrations d’ATP en instillant des ATPases exogènes dans la vessie réduit la fréquence de miction⁸. Ainsi, l’importance de l’ATP urinaire pour la fonction de la vessie est claire.

Compte tenu de l’importance apparente de l’ATP urinaire pour la pathologie de la vessie, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale est une étape importante dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent la libération. De nombreuses études ont été réalisées en utilisant différents modèles expérimentaux pour mesurer la libération d’ATP urothéliale. Au premier rang d’entre eux sont les cultures cellulaires, soit des cultures primaires, soit des lignées cellulaires. Cependant, l’utilisation de cellules urothéliales en culture est compliquée par le fait que les cellules urothéliales ne prennent pas leur morphologie polarisée physiologique à moins qu’elles ne soient cultivées sur des membranes perméables spéciales (telles que la technologie Transwell [inserts de puits])⁹. Ainsi, il est difficile de relier une libération d’ATP mesurée à la physiologie. Les cellules urothéliales cultivées sur des inserts de puits peuvent se polariser et former une barrière semblable à ce que l’on voit in vivo; Cependant, la croissance d’un urothélium complètement différencié peut prendre des jours ou des semaines. De plus, bien qu’il soit possible de monter des inserts de puits dans une chambre d’Ussing et d’appliquer une pression sur le côté apical pour provoquer un étirement, il est difficile d’appliquer une pression suffisante pour imiter les conditions à l’intérieur de la vessie pendant la pathologie (c.-à-d. pressions de 30 cm H₂O ou plus). Le tissu entier de la vessie peut également être monté dans une chambre d’Ussing pour des expériences d’étirement, mais cela élimine la vessie de l’organisme ainsi que les facteurs trophiques maintenant la santé des cellules urothéliales et, par conséquent, la fonction de barrière urothéliale. Par conséquent, la façon la plus physiologiquement pertinente d’étudier la libération d’ATP par l’urothélium en réponse à l’étirement ou à la pression est in vivo. Les techniques chirurgicales nécessaires à la mise en place de l’expérience sont identiques à celles couramment utilisées en cystométrie animale et, par conséquent, devraient être facilement effectuées par toute personne familière avec cette technique.

Dans ce protocole, nous décrirons la technique utilisée pour examiner l’ATP luminal chez les rats Sprague Dawley femelles pesant environ 200-250 g, car le cathétérisme transurétral décrit ci-dessous est beaucoup plus facile chez les femelles; Cependant, le cathétérisme transurétral peut également être effectué chez les rongeurs mâles¹⁰. Comme le cathétérisme transurétral a maintenant été effectué chez des souris des deux sexes¹¹, ces expériences peuvent facilement être adaptées à des souris ou des rats des deux sexes ou de tailles variables, selon les besoins de l’équipe de recherche.

Protocol

Toutes les procédures effectuées chez les rongeurs doivent respecter les lignes directrices applicables et être approuvées par le comité d’éthique de l’établissement local. Les expériences réalisées pour ce manuscrit ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du Conseil national de recherches du Canada et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université de Pittsburgh. Voir la figure 1 pour une version modifiée de la configuration standard de cystométrie des rongeurs utilisée dans ce protocole.

1. Animaux de laboratoire

1. Maintenir les rats dans des logements sociaux (plusieurs rongeurs dans une cage) avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et un accès ad libitum à de l’eau et des granulés de nourriture.

2. Anesthésie et bloc ganglionnaire

1. Induire l’anesthésie initiale en plaçant l’animal dans une boîte fermée gazée avec 4 % à 5 % d’isoflurane dans O₂ (1 L/min).
2. Anesthésiez l’animal à l’aide d’uréthane.
   1. Injecter de l’uréthane par voie sous-cutanée bilatérale (1/2 dose de chaque côté de l’animal) à une dose de 1,2 g/kg. Placez l’animal dans une cage pour permettre à l’uréthane de faire effet, ce qui prend généralement 2 h.
   2. Alternativement, administrer l’uréthane par voie intrapéritonéale (i.p.) en injectant la dose complète en deux doses distinctes ~ 10 min d’intervalle.
3. Après avoir attendu le moment opportun pour que l’uréthane fasse effet (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), tester un plan d’anesthésie approprié en pinçant le pied de l’animal à l’aide d’une pince. Si un réflexe est observé, administrer une dose supplémentaire d’uréthane (0,05-0,1 mL i.p.), attendre 15 minutes et tester à nouveau. Continuez à surveiller l’animal pour le plan d’anesthésie approprié tout au long de la procédure.
4. Pour éviter une contraction de la vessie lors de la distension, injecter à l’animal un agent bloquant ganglionnaire, tel que l’hexaméthonium (20 mg/kg, i.p.).
5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement pendant l’expérience.

3. Procédure chirurgicale - cathétérisme vésical sus-pubien

1. Rasez l’abdomen de l’animal et effectuez une laparotomie médiane pour exposer la vessie.
2. Préparer un cathéter en évasant une extrémité d’une courte longueur (~10-15 cm) de tube intramédical PE50 à l’aide d’une flamme. Placez une aiguille de 22 G à l’autre extrémité du tube et remplissez-la de solution de Krebs (voir le tableau des matériaux pour la composition).
3. Placez une petite boucle de suture de soie 3-0 sur le dôme de la vessie et effectuez une petite cystostomie (à l’aide de ciseaux fins ou d’une aiguille de 18 G) suffisamment grande pour insérer l’extrémité évasée du cathéter fabriqué au-dessus. Avec une main tenant le cathéter en place, utilisez l’autre main pour resserrer la boucle de la suture afin de fixer le cathéter en place. Terminez de fixer le cathéter en attachant deux nœuds dans la suture et en tirant le cathéter vers l’arrière jusqu’à ce que la tête évasée soit en contact avec la paroi de la vessie.
   1. Vous pouvez également fixer le cathéter à l’aide d’une technique classique de suture à cordon de bourse, comme décrit précédemment pour la cystométrie¹².
      REMARQUE: Il est impératif de ne pas introduire de bulles d’air dans la vessie pendant cette procédure.
4. Testez la configuration pour détecter les fuites en perfusant une petite quantité de solution de Krebs à travers le cathéter. Si le liquide s’échappe de la cystostomie, refixez le cathéter avec une suture supplémentaire autour de la cystostomie.

4. Cathétérisme transurétral

1. Trempez l’extrémité d’un cathéter intraveineux de 20 G x 1 » (avec l’aiguille retirée) dans un lubrifiant chirurgical.
2. Tenez doucement le méat urétral externe avec une paire de pinces et insérez l’extrémité du cathéter dans l’orifice urétral dans la direction de la queue jusqu’à ce que l’extrémité provoque la déformation de la paroi de l’ouverture vaginale adjacente. Faites pivoter le cathéter de 90° (en amenant l’extrémité Luer-Lock du cathéter vers la queue) et avancez doucement. Insérez complètement le cathéter jusqu’à ce que le moyeu Luer-Lock soit distal d’environ 5 mm de l’ouverture urétrale externe.
   REMARQUE: N’insérez pas le cathéter trop loin, ce qui pourrait provoquer une poussée de la paroi interne de la vessie. Si une résistance est ressentie en avançant le cathéter, arrêtez-vous et recommencez ou risquez de perforer l’urètre. Voir la section de discussion sur les conseils pour augmenter le succès du cathétérisme.
3. Fixez le cathéter et évitez les fuites autour du cathéter en bouclant une courte longueur de suture de soie 3-0 autour du méat urétral externe et attachez-le fermement. Fixez le cathéter à la queue avec du ruban adhésif pour éviter qu’il ne soit accidentellement retiré.
4. Une fois le cathétérisme effectué, infuser doucement la solution de Krebs dans la vessie à travers le cathéter vésical sus-pubien et confirmer que le liquide s’écoule hors du cathéter urétral et non autour de celui-ci. Si nécessaire, renouez la suture autour de l’orifice urétral externe.
5. Fermez l’incision abdominale sur la vessie à l’aide d’une suture en soie 3-0.

5. Configuration expérimentale

1. Fixez l’animal sur une planche capable d’être inclinée pour aider à l’évacuation du liquide intravésical à travers le cathéter urétral. Placez un coussin chauffant et un sous-coussin absorbant entre l’animal et la planche pour maintenir la chaleur corporelle et absorber le liquide qui s’écoule du cathéter urétral.
2. Connectez le cathéter sus-pubien à un robinet d’arrêt à trois voies, qui relie le cathéter à une pompe à seringue et à un transducteur de pression. Connectez le transducteur de pression à un ordinateur au moyen d’un amplificateur et d’un système d’acquisition de données.
   REMARQUE: Des précautions doivent être prises pour empêcher la formation de bulles d’air dans le tube reliant la pompe à seringue, le transducteur et le cathéter de la vessie.
3. Calibrer l’enregistrement de la pression vésicale en utilisant la procédure suggérée par le fabricant du transducteur de pression et/ou du logiciel d’acquisition de données.
4. Injecter la solution de Krebs à travers le cathéter sus-pubien à un débit de 0,1 mL/min et laisser le liquide s’écouler du cathéter urétral pendant 1 h pour éliminer tout résidu d’ATP libéré lors des implantations du cathéter.
5. Après cette période de lavage, boucher le cathéter urétral à l’aide d’un bouchon Luer-Lock et mesurer la pression dans la vessie. Rechercher une augmentation lente de la pression intravésicale jusqu’à une pression de 30 cm_H2Osans forte augmentation de la pression, ce qui indiquerait une contraction de la vessie (voir Figure 2). Retirez le bouchon du cathéter urétral lorsque la pression atteint 30 cm_H2Opour éviter d’endommager la vessie.
   NOTE: Si les contractions de la vessie continuent de se produire après 1 h, administrer une dose supplémentaire d’hexaméthonium (dose de 5 mg / kg i.p.).

6. Prélèvement d’échantillons

1. Infuser la vessie à 0,1 mL/min et prélever l’éluat du cathéter urétral. Tester immédiatement 100 μL d’aliquotes de l’éluat pour l’ATP (voir ci-dessous) ou congeler pour une quantification ultérieure du lot.
2. Pour tester l’effet de la distension de la vessie sur les concentrations luminales d’ATP, boucher le cathéter urétral avec le bouchon et surveiller la pression de la vessie jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau souhaité. Ensuite, décapsulez le cathéter urétral et prélevez l’éluat pour la mesure ou la congélation de l’ATP, comme décrit ci-dessus.
3. Après chaque distension, laissez la vessie reposer et laver pendant 10 à 15 minutes avant de prélever des échantillons supplémentaires. Prélever un total de 3 à 5 échantillons de prédistension et 3 à 5 échantillons à chaque pression de distension souhaitée pour démontrer la répétabilité.
4. Pour tester l’effet des médicaments sur la libération d’ATP, remplacer la solution de Krebs par injection de la vessie par Krebs contenant le médicament de votre choix. Perfuser à 0,1 mL/min pendant 10-15 min pour que le médicament ait un effet, puis prélever les échantillons des vessies non distendues et distendues comme décrit aux étapes 6.1 et 6.2.

7. Quantifier l’ATP à partir d’échantillons prélevés

1. Quantifier l’ATP dans les échantillons de 100 μL prélevés à l’aide d’une trousse de dosage de la luciférine/luciférase disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant et d’un luminomètre.
   1. Pour quantifier l’ATP, combiner 100 μL d’échantillons de perfusat avec 50 μL du mélange d’essai et les placer dans le luminomètre pour la lecture. Pour convertir les unités de lumière relative (RLU) indiquées par le luminomètre en une concentration d’ATP, effectuer des dilutions en série d’ATP dans une solution de Krebs allant de 1 μM à 10 pM dans des dilutions de 10 fois pour créer une courbe standard et les lire dans le luminomètre. Tracer les lectures résultantes sur un graphique et effectuer une régression non linéaire (quadratique) pour extrapoler les concentrations à partir des échantillons prélevés sur l’animal.
      REMARQUE: Il est important d’établir des normes ATP pour toute solution médicamenteuse testée dans l’expérience, car de nombreux médicaments interfèrent avec la réaction luciférine / luciférase, qui doit être corrigée.

8. Euthanasie des animaux

1. Lorsque l’expérience est terminée et que tous les échantillons sont prélevés, euthanasier l’animal sans cruauté conformément aux directives de l’USDA et au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du Conseil national de recherches.
   1. Retirez l’animal anesthésié de la configuration expérimentale, placez-le dans une boîte fermée et gazez-le avec 100% de CO₂. Assurez-vous que le taux de remplissage est égal à 30 % à 70 % du volume de la chambre par minute (p. ex., 3 à 7 L/min pour une boîte d’un volume de 10 L). Continuez le flux de CO₂ pendant au moins 1 min après l’arrêt de la respiration.
2. Utilisez une forme secondaire d’euthanasie pour assurer la mort.
   1. Effectuez une thoracotomie comme forme secondaire d’euthanasie en saisissant le petit lambeau de peau à l’extrémité caudale du sternum et en coupant un petit trou dans la peau et la musculature au diaphragme avec une paire de ciseaux tranchants. Complétez la thoracotomie en insérant les ciseaux dans l’ouverture et en coupant rostralement à travers la cage thoracique et en exposant la cavité thoracique.
      REMARQUE : L’animal euthanasié doit être éliminé conformément aux lignes directrices de l’établissement.

Representative Results

Le protocole décrit permet de mesurer avec précision la libération d’ATP urothéliale in vivo à partir de la lumière de la vessie, en utilisant une version modifiée de la configuration standard de cystométrie des rongeurs (voir Figure 1). Cela permet au chercheur d’examiner les effets des médicaments sur la libération d’ATP à médiation par étirement dans un contexte physiologique.

Figure 1 : Installation expérimentale. (A) Image montrant l’installation expérimentale, avec les différents équipements étiquetés. La zone de l’animal délimitée dans un rectangle rouge est représentée en B. (B) Photographie représentant l’abdomen du rat après la chirurgie. Notez le cathéter sus-pubien inséré et attaché dans le dôme de la vessie, ainsi que le cathéter urétral inséré à travers l’orifice externe. Le cathéter urétral est branché sur la photo pour montrer que la pression de la vessie est augmentée pendant la perfusion à travers le cathéter de la vessie. Au cours de l’expérience, l’ouverture abdominale était suturée fermée, mais était laissée ouverte ici pour permettre la visualisation de la vessie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour mesurer avec succès la libération d’ATP médiée par l’étirement dans la vessie des rongeurs, il est primordial de s’assurer que le réflexe mictionnel est bloqué, ce qui permet à la vessie d’être distendue au-delà de la pression seuil normalement suffisante pour activer le réflexe de miction. Comme le montre la figure 2A, lorsque le cathéter urétral est bouché, la perfusion de la solution dans la vessie provoque une forte augmentation de la pression intravésicale à mesure que la vessie se contracte. Comme nous nous intéressons aux effets de l’étirement passif, et non de la contraction, sur la libération d’ATP urothéliale, l’animal est traité avec un bloqueur ganglionnaire, l’hexaméthonium, pour prévenir le réflexe mictionnel. Comme le montre la figure 2B, lorsque de l’hexaméthonium est administré, l’instillation de la solution dans la vessie avec le cathéter urétral bloqué entraîne une augmentation beaucoup plus progressive de la pression intravésicale, permettant aux pressions d’augmenter jusqu’à 30 cm_H2Osans contraction. Cela permet de mesurer la libération d’ATP luminal à des pressions suffisamment élevées pour être pertinentes pour la pathologie, telles que celles observées dans une vessie sous-active, une obstruction partielle de la sortie de la vessie ou une dyssynergie détrusor-sphincter après une lésion de la moelle épinière. Bien qu’il puisse nécessiter une dose supplémentaire d’hexaméthonium pour bloquer complètement le réflexe mictionnel, il faut prendre soin de ne pas en administrer suffisamment pour entraîner un surdosage. Cela pourrait entraîner une diminution significative du débit cardiaque et compromettre la qualité de l’expérience. Il convient de noter que le même effet inhibiteur sur le réflexe de la vessie peut être obtenu en coupant les nerfs pelviens bilatéralement ou en sectionnant la moelle épinière au niveau L4 ou supérieur. Ceci, bien sûr, augmente considérablement la difficulté de la configuration expérimentale et le temps nécessaire pour terminer l’expérience.

Figure 2 : Enregistrements de pression de rats. Avant (A) et après (B) bloc ganglionnaire. Les flèches indiquent quand le cathéter urétral a été bouché. Notez que la pression dans la trace supérieure augmente rapidement lorsque la pression atteint le seuil pour induire la miction, tandis que la pression dans la trace inférieure augmente progressivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Une autre considération très importante pour ces expériences est d’assurer une conversion correcte des lectures du luminomètre (normalement exprimées en RLU) en une concentration d’ATP en utilisant des courbes standard. La réaction luciférine/luciférase est très sensible aux agents interférents¹³. Cette interférence peut provenir d’une interaction directe avec la luciférine/luciférase. Par exemple, un certain nombre de composés peuvent agir comme inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs de la luciférase; une étude a suggéré que ~3% des composés dans le dépôt de petites molécules des bibliothèques moléculaires pourraient inhiber la luciférase luciole à des concentrations inférieures à 11 μM¹⁴. De plus, la luciférine est sensible aux agents oxydants, ce qui réduit la quantité de substrat disponible pour la réaction produisant la luminescence¹⁵. Il est également possible d’interférer avec la réaction luciférine/luciférase en modifiant la disponibilité du cofacteur de la réaction, le magnésium. Par exemple, une technique courante pour imiter l’étirement mécanique dans les expériences d’ATP in vitro consiste à induire un gonflement cellulaire en réduisant l’osmolarité de la solution perfusante. Cependant, de nombreux chercheurs accomplissent cette réduction en diluant la solution avec de l’eau, réduisant ainsi la concentration de magnésium disponible pour agir comme cofacteur dans la réaction luciférine / luciférase. De plus, certains médicaments sont vendus sous forme de sels de magnésium, ce qui peut augmenter considérablement la quantité de magnésium dans la solution, ce qui entraîne également des différences mesurables dans les lectures de luminescence. Enfin, il est possible qu’une solution médicamenteuse interfère avec la capacité de mesurer avec précision la lumière produite par la réaction luciférine/luciférase. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, également connu sous le nom d’érioglaucine ou FD&C Blue dye #1) est un inhibiteur spécifique de l’ATP médié par la pannexine release¹⁶. À des doses efficaces, la solution Brilliant Blue FCF a une teinte bleue distincte, qui absorbe la lumière à un pic d’environ 600 nm¹⁷. C’est dans la gamme des longueurs d’onde de la lumière émise par la luciole luciférase; par conséquent, l’émission de lumière dans les expériences avec BB-FCF est considérablement réduite. Ainsi, il est impératif que des courbes standard utilisant des quantités connues d’ATP dissous dans des solutions contenant chaque médicament expérimental soient utilisées pour quantifier la libération d’ATP au cours de l’expérience. Comme le montre la figure 3, le BB-FCF (100 μM) diminue considérablement la pente de la courbe standard, ce qui est suffisant pour modifier de manière significative les valeurs calculées pour la concentration d’ATP dans l’échantillon. Comme le montre le bas de la figure 3, l’utilisation de l’étalon de Krebs pour calculer la concentration d’ATP dans un échantillon contenant du BB-FCF peut entraîner une sous-estimation de la concentration d’ATP de ~50%. Dans certains cas, l’utilisation d’une courbe standard incorrecte pourrait masquer un changement médié par le médicament dans la libération d’ATP, ou donner l’impression à tort qu’un changement s’est produit. Dans l’expérience représentée à la figure 3, par exemple, l’utilisation de la norme de Krebs pour tous les échantillons aurait fait apparaître que le Brilliant Blue FCF réduisait la libération d’ATP de ~67% (16,6 à 5,5 nM) alors qu’en réalité, il n’avait diminué que ~42% (16,6 à 9,6 nM).

Figure 3 : Effets des médicaments expérimentaux sur la courbe standard de l’ATP. Il convient de noter que l’antagoniste du canal de la pannexine, Brilliant Blue, modifie considérablement les RLU mesurées pour une concentration donnée d’ATP, ce qui entraînerait une sous-estimation de l’ATP mesurée, sinon corrigée. Abréviation : RLU = unités légères relatives; BB-FCF = Bleu brillant FCF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Une autre considération à garder à l’esprit est que l’ATP est généralement libéré des tissus à la suite de dommages, et que ces procédures chirurgicales et l’insertion d’un cathéter urétral entraîneront des lectures d’ATP anormalement élevées si elles sont prises trop tôt après la configuration. Cette procédure décrit une période de lavage de 1 h après la mise en place de l’expérience, qui ne doit pas être ignorée. Nous avons constaté qu’après 1 h, les concentrations d’ATP mesurées dans les échantillons prélevés lorsque la vessie n’est pas distendue sont relativement faibles (~10-30 nM) tandis que les échantillons prélevés avant la période de lavage peuvent lire un ordre de grandeur plus élevé. De courts lavages de 5 minutes doivent également être effectués entre les distensions, car les niveaux d’ATP peuvent rester élevés pendant une courte période. Une bonne règle de base serait de mesurer l’ATP dans plusieurs échantillons au début de l’expérience et après chaque distension et de ne procéder que lorsque les lectures d’ATP se stabilisent. Dans la figure 4, nous montrons une représentation d’une expérience typique avec des mesures prises à différents points temporels. Notez les lectures élevées prises avant le lavage (échantillons #1 et #5) par rapport à celles prises après le lavage (échantillons #2 et #6).

Figure 4 : Représentation d’une expérience typique. Représentation stylisée d’un enregistrement de pression typique. Chaque chiffre représente un point temporel où un échantillon a été prélevé et mesuré pour l’ATP : 1) immédiatement après la fin de la configuration, avant la période de lavage, 2) après une période de lavage de 1 h, 3) immédiatement avant une distension, 4) pendant la distension, 5) immédiatement après une distension et 6) après une courte période de lavage suivant la distension. Le tableau en médaillon indique les valeurs représentatives des RLU et des concentrations d’ATP pour chaque échantillon. Abréviation : RLU = unités de lumière relatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 5 montre des graphiques représentatifs des résultats expérimentaux examinant le mécanisme de libération d’ATP par l’urothélium. Comme le montre la figure 5A, l’augmentation de la pression entraîne une augmentation significative de la concentration d’ATP dans la lumière de la vessie, avec des pressions de 30 cm d’eau augmentant les concentrations de près de 2,5 fois celles des témoins non distendus. La perfusion intravésicale de 2 U/mL d’apyrase, une enzyme qui catalyse l’hydrolyse de l’ATP, diminue considérablement la concentration mesurée d’ATP dans la lumière de la vessie. Inversement, la perfusion intravésicale de l’ARL67156, un inhibiteur des NTPDases présent sur l’urothélium, augmente significativement les concentrations luminales d’ATP. La figure 5B illustre les expériences sur le mécanisme de libération d’ATP induite par l’étirement à partir de l’urothélium. La perfusion avec les antagonistes des canaux pannexines Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) ou carbenoxolone (CBX, 100 μM) réduit considérablement la libération d’ATP dans la lumière de la vessie à toutes les pressions. Les concentrations luminales d’ATP ne diminuent pas lorsque l’acide 18α-glycyrrhétinique bloqueur de la connexine est perfusé, ce qui indique que la libération d’ATP évoquée par distension est médiée par des canaux pannexine et non par des canaux connexine.

Figure 5 : Mesures représentatives de la libération d’ATP évoquée par distension dans la lumière de la vessie. (A) La distension de la vessie augmente les concentrations luminales d’ATP, qui peuvent être diminuées en présence de la NTPDase apyrase (2 U/mL) ou augmentées lorsque les NTPDases endogènes sont inhibées par ARL67156 (10 μM). (B) La libération d’ATP évoquée par distension est bloquée par les antagonistes du canal pannexine Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) et carbenoxolone (CBX, 100 μM) mais pas par l’antagoniste du canal connexine 18α-glycyrrhétinique acid (18α-GA, 50 μM). Les données sont présentées sous forme de moyenne avec des barres d’erreur types. ** p < 0,05 entre les deux barres indiquées par la ligne, ## p < 0,05 par rapport aux contrôles de Krebs à la même distension. Cette figure est reproduite avec la permission de Beckel et ^al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La majorité des recherches sur la libération d’ATP urothéliale sont menées dans des cellules en culture, en utilisant soit des lignées cellulaires immortalisées, soit des cultures primaires de cellules urothéliales de rongeurs. Bien que ces modèles aient l’avantage d’avoir un débit relativement élevé (c.-à-d. qu’une culture ou un passage peut faire de nombreuses assiettes/boîtes de cellules), leur pertinence physiologique est diminuée en raison : 1) de l’incapacité des cellules urothéliales à se polariser à moins qu’elles ne soient cultivées sur des supports spéciaux et 2) de la difficulté d’exposer les cellules cultivées à des niveaux physiologiques d’étirement ou de pression. Une façon de faire face à ces limitations est de retirer la vessie d’un rongeur, de l’ouvrir et de la placer dans une chambre d’Ussing, en insérant le tissu de la vessie entre deux demi-chambres remplies de solution physiologique. Cela permet au chercheur de soumettre l’urothélium, dans son état polarisé natif, à une distension en ajoutant du volume au côté urothélial de la chambre, provoquant un étirement du tissu vésical dans la chambre. Cependant, il est difficile de relier cet étirement à la distension observée par l’urothélium in vivo. De plus, l’ATP évoqué par distension dans la chambre d’Ussing est libéré dans le grand volume de liquide physiologique contenu dans la chambre, diluant la concentration d’ATP plusieurs fois. En utilisant cette procédure, la pression de la vessie est mesurée directement, de sorte que la distension peut être maintenue dans une plage pertinente pour la physiologie ou la physiopathologie. De plus, puisque nous mesurons la concentration d’ATP directement à partir du fluide luminal et non à partir d’une quantité arbitraire et excessive de liquide utilisé pour maintenir les tissus in vitro, la concentration mesurée n’a pas besoin d’être corrigée. Ainsi, la procédure décrite dans cet article permet au chercheur d’examiner la libération d’ATP dans la lumière de la vessie dans des conditions qui ressemblent beaucoup plus aux conditions physiologiques ou physiopathologiques de la vessie.

La technique décrite est très similaire aux techniques de cystométrie standard utilisées pour étudier les effets des médicaments sur l’activité réflexe de la vessie et devrait être facilement réalisée par toute personne qui effectue régulièrement ces expériences. Pour les chercheurs qui débutent dans le cathétérisme de la vessie, cependant, il y a quelques mises en garde à connaître. Premièrement, le cathétérisme transurétral peut être difficile pour les inexpérimentés en raison de la courbure de l’urètre des rongeurs. Cela peut également être rendu plus difficile par l’étanchéité du sphincter urétral externe, même sous anesthésie uréthane. Il est impératif que le chercheur n’essaie pas de forcer le cathéter dans l’urètre, car cela provoquera très probablement une inflammation et un gonflement accrus, ce qui rendra l’urètre encore plus difficile à cathétériser avec succès. De plus, il est possible de percer le cathéter à travers la paroi de l’urètre, ruinant ainsi toute l’expérience.

Nous avons développé quelques trucs et astuces pour augmenter le taux de réussite. Par exemple, il est parfois nécessaire de donner à l’animal une autre courte dose d’isoflurane inhalé (0,5%-1,0%) pour détendre le sphincter urétral. Cela doit être effectué avec parcimonie et avec soin, car la combinaison d’uréthane et d’isoflurane peut entraîner une dépression respiratoire. Une autre astuce consiste à plonger l’extrémité du cathéter dans une solution de lidocaïne à 2% avant de l’insérer dans l’orifice urétral externe; Cela entraînera souvent le relâchement du sphincter après quelques minutes. Vider la vessie en appuyant doucement sur l’abdomen de l’animal peut également aider à détendre le sphincter urétral. Enfin, il peut être nécessaire d’utiliser un cathéter de plus petit calibre; nous utilisons parfois un cathéter de 24 G, surtout avec les petits animaux. Gardez à l’esprit, cependant, qu’il peut être nécessaire de réduire le débit de perfusion dans la vessie lors de l’utilisation d’un cathéter transurétral de plus petit calibre, pour correspondre au drainage plus lent du cathéter urétral. Ne pas le faire entraînerait une augmentation de la pression de la vessie, même si le cathéter urétral n’est pas bouché.

Il convient de noter que l’uréthane est utilisé comme anesthésique dans ce protocole. L’uréthane est couramment utilisé dans les laboratoires qui étudient les voies urinaires inférieures, car il épargne le réflexe de miction alors que d’autres anesthésiques ne le font pas. De ce fait, la distension de la vessie au-dessus d’une pression de ~7-10 cm_H2Osous anesthésie uréthane déclenchera un réflexe mictionnel. Puisque nous nous intéressons à la libération d’ATP en réponse à la distension passive, ce protocole appelle à bloquer les contractions de la vessie en utilisant l’hexaméthonium, bloqueur ganglionnaire. Cela permet de mesurer la libération d’ATP en réponse aux pressions intravésicales plus élevées (c.-à-d. 30 cm_H2O) couramment observées dans la pathologie de la vessie impliquant une obstruction de la sortie. Par conséquent, l’utilisation d’un uréthane/hexaméthonium permet de mesurer la libération d’ATP luminale évoquée par distension pendant de longues périodes (la durée d’action des deux médicaments est mesurée en heures). Cependant, certains laboratoires peuvent préférer utiliser un anesthésique qui n’épargne pas le réflexe mictionnel, comme la kétamine, et éliminer le besoin d’un bloqueur ganglionnaire. Cela fonctionnera également bien pour cette procédure, bien qu’elle nécessitera une administration plus fréquente (ou continue) en raison de la durée d’action plus courte de l’anesthésique.

Une différence notable entre cette technique pour mesurer l’ATP et la configuration de cystométrie commune que les chercheurs en urologie peuvent connaître est l’utilisation d’une solution tamponnée de Krebs comme perfusat au lieu de la solution saline isotonique standard. L’ATP est une molécule plutôt labile et se stabilise quelque peu dans une solution tamponnée. De plus, la composition de la solution de Krebs est beaucoup plus proche de celle de l’urine que de la solution saline, ce qui ajoute encore une pertinence clinique à ces expériences. Il s’agit d’une considération importante, car il a été démontré que le contrôle de la libération d’ATP urothéliale est modulé par des canaux perméables au calcium, et le manque de calcium dans une solution saline normale peut influencer négativement la libération d’ATP. L’instabilité de l’ATP en solution est également la raison pour laquelle nous suggérons que les échantillons soient immédiatement quantifiés à l’aide de la réaction luciférine-luciférase. Toutefois, si le chercheur n’est pas en mesure de lire les échantillons immédiatement, ceux-ci doivent être congelés le plus rapidement possible afin de limiter la dégradation de l’ATP.

L’une des limites de cette technique est qu’elle ne mesure que la libération luminale d’ATP et ne peut pas mesurer la libération d’ATP du côté sérosal de l’urothélium. On pense que l’ATP est libéré du côté sérosal pour influencer directement l’excitabilité afférente; Cependant, la mesure directe de cette libération est difficile. Dans ce cas, l’utilisation de cellules cultivées sur des supports membranaires perméables tels que les plaques Transwell ou l’élimination chirurgicale de l’urothélium pour les expériences en chambre d’Ussing est la technique préférée. Cependant, étant donné l’importance apparente de l’ATP luminale dans la pathologie de la vessie, ce modèle expérimental est un outil utile pour élucider les mécanismes cellulaires contrôlant la libération d’ATP urothéliale au cours de la pathologie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose