In vivo Luminal mätning av distension-framkallad urotelial ATP-frisättning hos gnagare

Summary

Detta protokoll beskriver proceduren för mätning av ATP-koncentrationer i blåsans lumen i en bedövad gnagare.

Abstract

ATP, frisatt från urotelet som svar på blåsans distension, tros spela en betydande sensorisk roll i kontrollen av urinering. Därför är noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning i en fysiologisk miljö ett viktigt första steg för att studera mekanismerna som styr purinerg signalering i urinblåsan. Befintliga tekniker för att studera mekaniskt framkallad urotelial ATP-frisättning använder odlade celler pläterade på flexibla stöd eller blåsvävnad fäst i Ussing-kamrar; Var och en av dessa tekniker efterliknar emellertid inte helt förhållandena i den intakta blåsan. Därför utvecklades en experimentell inställning för att direkt mäta ATP-koncentrationer i lumen i gnagarens urinblåsa.

I denna inställning perfuseras blåsorna hos bedövade gnagare genom katetrar i både blåsans kupol och via den yttre urinrörsöppningen. Trycket i urinblåsan ökas genom att täcka urinrörskatetern medan den perfuserar steril vätska i blåsan genom kupolen. Mätning av intravesikalt tryck uppnås med hjälp av en tryckgivare fäst vid blåsans kupolkateter, liknande den inställning som används för cystometri. När önskat tryck har uppnåtts avlägsnas urinrörskateterns lock och vätska samlas upp för ATP-kvantifiering genom luciferin-luciferasanalys. Genom denna experimentella uppställning kan mekanismerna som styr både mekanisk och kemisk stimulering av urotelial ATP-frisättning undersökas genom att inkludera olika agonister eller antagonister i perfusatet eller genom att jämföra resultat mellan vildtyp och genetiskt modifierade djur.

Introduction

Urin ATP tros spela en betydande sensorisk roll i kontrollen av urinering¹. Till exempel är det tänkt att ATP frigörs från urotelet som svar på distension där det kan verka på receptorer på blåsans afferenta nerver för att öka deras excitabilitet, vilket leder till känslor av fullhet². Således är det också tänkt att urin ATP kan vara en viktig aktör i utvecklingen av blåspatologier. Till stöd för denna hypotes är ATP-koncentrationerna i urinen signifikant ökade hos patienter som lider av överaktiv blåsa (OAB)³, blåssmärtsyndrom/interstitiell cystit (BPS/IC)⁴ eller urinvägsinfektion (UTI)^5,6, alla tillstånd som kännetecknas av ökad brådska^, frekvens och ibland smärta. Omvänt har patienter som lider av underaktiv blåsa (UAB), som kännetecknas av en oförmåga att tömma blåsan och ibland kan inkludera en minskad förmåga att känna blåsans fullhet, visat sig ha minskade ATP-koncentrationer i urinen⁷. Experimentellt, manipulation av urin ATP-koncentrationer kan förändra urinblåsan reflexer i råtta; ökande ATP-koncentrationer genom att blockera endogena ATPaser i blåsans lumen kan öka tömningsfrekvensen, medan minskande ATP-koncentrationer genom att införa exogena ATPaser i urinblåsan minskar tömningsfrekvensen⁸. Således är betydelsen av urin ATP till blåsfunktionen tydlig.

Med tanke på den uppenbara betydelsen av urin ATP till urinblåsans patologi är noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning ett viktigt steg för att förstå de mekanismer som styr frisättning. Många studier har genomförts med olika experimentella modeller för att mäta urotelial ATP-frisättning. Främst bland dessa är cellkulturer, antingen primära kulturer eller cellinjer. Användningen av odlade urotelceller kompliceras emellertid av det faktum att urotelceller inte tar på sig sin fysiologiska polariserade morfologi om de inte odlas på speciella permeabla membran (såsom Transwell-teknik [brunnsinsatser])⁹. Således är det svårt att relatera någon ATP-frisättning uppmätt till fysiologi. Urotelceller odlade på brunnsinsatser kan polarisera och bilda en barriär som liknar vad som ses in vivo; Tillväxten av ett helt differentierat urotel kan emellertid ta dagar eller veckor. Dessutom, medan det är möjligt att montera brunnsinsatser i en Ussing-kammare och applicera tryck på den apikala sidan för att orsaka sträckning, är det svårt att applicera tillräckligt med tryck för att efterlikna förhållandena inuti blåsan under patologi (dvs tryck på 30 cm_H2Oeller högre). Hela blåsvävnaden kan också monteras i en Ussing-kammare för stretchexperiment, men detta tar bort blåsan från organismen tillsammans med de trofiska faktorerna som upprätthåller urotelcellhälsan och därmed urotelbarriärfunktionen. Därför är det mest fysiologiskt relevanta sättet att studera frisättningen av ATP från urotelet som svar på stretch eller tryck in vivo. De kirurgiska tekniker som behövs för att sätta upp experimentet är identiska med dem som vanligtvis används i djurcystometri och bör därför enkelt utföras av alla som är bekanta med den tekniken.

I detta protokoll kommer vi att beskriva tekniken som används för att undersöka luminal ATP hos kvinnliga Sprague Dawley-råttor som väger cirka 200-250 g, eftersom den transuretrala kateteriseringen som beskrivs nedan är mycket lättare hos kvinnor; Transuretral kateterisering kan emellertid också utföras hos manliga gnagare¹⁰. Eftersom transuretral kateterisering nu har utförts även hos möss av båda könen¹¹, kan dessa experiment enkelt anpassas för möss eller råttor av båda könen eller av varierande storlek, beroende på forskargruppens behov.

Protocol

Alla procedurer som utförs på gnagare måste följa gällande riktlinjer och godkännas av den lokala institutionella etikprövningskommittén. Experimenten som utfördes för detta manuskript utfördes i enlighet med National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 för en modifierad version av standardinställningen för cystometri på gnagare som används i detta protokoll.

1. Försöksdjur

1. Håll råttorna i sociala bostäder (flera gnagare i en bur) med en 12 h ljus / mörk cykel och ad libitum tillgång till vatten och matpellets.

2. Anestesi och ganglionblock

1. Inducera initial anestesi genom att placera djuret i en sluten låda gasad med 4% -5% isofluran i_O2 (1 L/min).
2. Bedöva djuret med uretan.
   1. Injicera uretan subkutant bilateralt (1/2 dos på vardera sidan av djuret) i en dos av 1,2 g/kg. Placera djuret i en bur så att uretan kan träda i kraft, vilket vanligtvis tar 2 timmar.
   2. Alternativt administrera uretan intraperitonealt (i.p.) genom att injicera hela dosen i två separata doser ~ 10 min från varandra.
3. Efter att ha väntat på lämplig tid för att uretan ska träda i kraft (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), testa för ett korrekt anestesiplan genom att klämma djurets fot med pincett. Om en reflex observeras, administrera en extra dos uretan (0,05-0,1 ml i.p.), vänta i 15 minuter och testa igen. Fortsätt att övervaka djuret för rätt anestesiplan under hela proceduren.
4. För att förhindra sammandragning av urinblåsan under utspändhet, injicera djuret med ett ganglieblockerande medel, såsom hexametonium (20 mg/kg, i.p.).
5. Applicera oftalmisk salva på djurets ögon för att förhindra torkning under experimentet.

3. Kirurgiskt ingrepp-suprapubisk blåskateterisering

1. Raka djurets buk och utför en laparotomi i mittlinjen för att exponera urinblåsan.
2. Förbered en kateter genom att blossa ena änden av en kort (~ 10-15 cm) längd av PE50 intramedicinsk slang med en låga. Placera en 22 G nål i den andra änden av slangen och fyll med Krebs-lösning (se materialtabellen för kompositionen).
3. Placera en liten slinga av 3-0 silkesutur över blåsans kupol och utför en liten cystostomi (med fin sax eller en 18 G nål) tillräckligt stor för att sätta in den utsvängda änden av katetern ovan. Med ena handen som håller katetern på plats, använd den andra handen för att dra åt suturens ögla för att säkra katetern på plats. Avsluta säkringen av katetern genom att knyta två knutar i suturen och dra tillbaka katetern tills det utsvängda huvudet är i kontakt med blåsväggen.
   1. Alternativt kan du säkra katetern med en klassisk handväska-strängsuturteknik, som tidigare beskrivits för cystometri¹².
      OBS: Det är absolut nödvändigt att inte införa luftbubblor i blåsan under denna procedur.
4. Testa installationen för läckor genom att införa en liten mängd Krebs-lösning genom katetern. Om vätskan läcker ut ur cystostomin, säkra katetern med ytterligare sutur runt cystostomin.

4. Transuretral kateterisering

1. Doppa änden av en 20 G x 1" I.V. kateter (med nålen borttagen) i kirurgiskt smörjmedel.
2. Håll den yttre urinrörsmeatusen försiktigt med ett par pincett och sätt in kateterns spets i urinrörsöppningen i svansens riktning tills spetsen får väggen i den intilliggande vaginala öppningen att deformeras. Vrid katetern 90° (för kateterns Luer-Lock-ände mot svansen) och rör försiktigt framåt. Sätt in katetern helt tills Luer-Lock-navet är ungefär 5 mm distalt från den yttre urinrörsöppningen.
   OBS: För inte in katetern för långt, vilket kan leda till att spetsen petar på blåsans innervägg. Om motstånd känns när katetern går framåt, stanna och börja om eller riskera att punktera urinröret. Se diskussionsavsnittet om tips för att öka framgångsrik kateterisering.
3. Säkra katetern och förhindra läckage runt katetern genom att slinga en kort längd av 3-0 silkesutur runt den yttre urinrörets meatus och binda av den ordentligt. Fäst katetern i svansen med tejp för att förhindra att den av misstag dras ut.
4. När kateteriserat, infusera försiktigt Krebs-lösningen i urinblåsan genom den suprapubiska blåskatetern och bekräfta att vätskan rinner ut ur urinrörskatetern och inte runt den. Om nödvändigt, retie suturen runt den yttre urinrörsöppningen.
5. Stäng buksnittet över urinblåsan med en 3-0 silkesutur.

5. Experimentell inställning

1. Säkra djuret på ett bräde som kan vara benägen att hjälpa till vid dränering av intravesikal vätska genom urinrörskatetern. Placera en värmedyna och absorberande underplatta mellan djuret och brädan för att bibehålla kroppsvärmen och absorbera vätska som dräneras från urinrörskatetern.
2. Anslut den suprapubiska katetern till en trevägs stoppkran, som ansluter katetern till en sprutpump och en tryckgivare. Anslut tryckgivaren till en dator med hjälp av en förstärkare och ett datainsamlingssystem.
   OBS: Försiktighet bör iakttas för att förhindra att luftbubblor bildas i slangen som förbinder sprutpumpen, givaren och blåskatetern.
3. Kalibrera registreringen av blåstrycket enligt den procedur som föreslås av tillverkaren av tryckgivaren och/eller datainsamlingsprogramvaran.
4. Infusera Krebs-lösningen genom den suprapubiska katetern med en hastighet av 0,1 ml / min och låt vätskan rinna ut från urinrörskatetern i 1 timme för att tvätta bort eventuell kvarvarande ATP som frigörs under kateterimplantationerna.
5. Efter denna wash-out period, täck urinrörskatetern med en Luer-Lock-plugg och mät trycket i urinblåsan. Leta efter en långsam ökning av det intravesikala trycket till ett tryck på 30 cm_H2Outan en kraftig ökning av trycket, vilket skulle indikera en blåskontraktion (se figur 2). Ta bort pluggen från urinrörskatetern när trycket når 30 cm_H2Oför att förhindra skador på urinblåsan.
   OBS: Om blåssammandragningar fortsätter att inträffa efter 1 timme, ge en extra dos hexametonium (5 mg/kg dos i.p.).

6. Provtagning

1. Infusera blåsan vid 0,1 ml/min och samla eluatet från urinrörskatetern. Testa omedelbart 100 μl alikvoter av eluatet för ATP (se nedan) eller frys för senare satskvantifiering.
2. För att testa effekten av blåsans utspänning på luminala ATP-koncentrationer, täck urinrörskatetern med pluggen och övervaka blåstrycket tills den når önskad nivå. Ta sedan bort locket på urinrörskatetern och samla eluatet för ATP-mätning eller frysning, som beskrivits ovan.
3. Efter varje utspändhet, låt blåsan vila och tvätta ut i 10-15 minuter innan du tar ytterligare prover. Ta totalt 3-5 förspänningsprov och 3-5 prover vid varje önskat distanstryck för att visa repeterbarhet.
4. För att testa effekten av läkemedel vid frisättning av ATP, byt Krebs-lösningen som infunderar blåsan till Krebs som innehåller det valfria läkemedlet. Perfusera vid 0,1 ml / min i 10-15 min för att läkemedlet ska ha effekt och samla sedan proverna från icke-utspända och utspända blåsor som beskrivs i steg 6.1 och 6.2.

7. Kvantifiering av ATP från insamlade prover

1. Kvantifiera ATP i de insamlade 100 μl-proverna med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt luciferin-/luciferasanalyskit enligt tillverkarens anvisningar och en luminometer.
   1. För att kvantifiera ATP, kombinera 100 μL perfusatprover med 50 μL av analysblandningen och placera dem i luminometern för avläsning. För att omvandla de relativa ljusenheterna (RLU) som rapporteras av luminometern till en koncentration av ATP, gör seriella utspädningar av ATP i Krebs-lösning som sträcker sig från 1 μM till 10 pM i 10-faldiga utspädningar för att skapa en standardkurva och läsa dem i luminometern. Plotta de resulterande avläsningarna på ett diagram och utför en icke-linjär (kvadratisk) regression för att extrapolera koncentrationer från proverna som tagits från djuret.
      OBS: Det är viktigt att göra ATP-standarder för alla läkemedelslösningar som testas i experimentet, eftersom många läkemedel stör luciferin / luciferasreaktionen, som måste korrigeras för.

8. Avlivning av djur

1. När experimentet är klart och alla prover samlas in, avlivar djuret humant enligt USDA-riktlinjerna och National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
   1. Ta bort det bedövade djuret från experimentuppställningen, placera det i en sluten låda och gasa det med 100% CO₂. Se till att fyllningshastigheten är lika med 30% -70% av kammarvolymen per minut (t.ex. 3-7 L / min för en låda med en volym på 10 L). Fortsätt CO_2-flödet i minst 1 minut efter att andningen upphört.
2. Använd en sekundär form av eutanasi för att säkerställa döden.
   1. Utför en thorakotomi som en sekundär form av eutanasi genom att ta tag i den lilla fliken av huden vid bröstbenets kaudala ände och skära ett litet hål i huden och muskulaturen vid membranet med en vass sax. Slutför thorakotomin genom att sätta in saxen i öppningen och skära rostralt genom bröstkorgen och exponera brösthålan.
      OBS: Det avlivade djuret ska kasseras enligt institutionella riktlinjer.

Representative Results

Det beskrivna protokollet möjliggör noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning in vivo från blåsans lumen med användning av en modifierad version av standardinställningen för gnagarecystometri (se figur 1). Detta gör det möjligt för forskaren att undersöka effekterna av läkemedel på sträckmedierad ATP-frisättning i en fysiologisk miljö.

Bild 1: Experimentell installation. (A) Bild som visar experimentuppställningen, med de olika utrustningarna märkta. Djurets område som skisseras i en röd rektangel visas i B. (B) Fotografi som visar buken på råtta efter operationen. Notera den suprapubiska katetern som sätts in och binds i blåskupolen, liksom urinrörskatetern som sätts in genom den yttre öppningen. Urinrörskatetern är inkopplad i bilden för att visa att blåstrycket ökar under perfusion genom blåskatetern. Under experimentet skulle buköppningen sutureras stängd, men lämnades öppen här för att möjliggöra visualisering av urinblåsan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Av primär betydelse för framgångsrik mätning av sträckmedierad ATP-frisättning i gnagarblåsan är att säkerställa att miktionsreflexen blockeras, vilket gör att blåsan kan utvidgas utöver det tröskeltryck som normalt är tillräckligt för att aktivera miktionsreflexen. Som visas i figur 2A, när urinrörskatetern är igensatt, orsakar infusion av lösningen i urinblåsan att intravesikalt tryck stiger kraftigt när blåsan kontraherar. Eftersom vi är intresserade av effekterna av passiv stretch, inte kontraktion, på urotelial ATP-frisättning, behandlas djuret med en ganglieblockerare, hexametonium, för att förhindra miktionsreflexen. Som framgår av figur 2B, när hexametonium administreras, resulterar instillation av lösningen i blåsan med urinrörskatetern blockerad i en mycket mer gradvis ökning av intravesikalt tryck, vilket gör att trycket kan stiga så högt som 30 cm_H2Outan sammandragning. Detta möjliggör mätning av luminal ATP-frisättning vid tryck som är tillräckligt höga för att vara relevanta för patologi, såsom de som observerats i en underaktiv blåsa, partiell blåsutloppsobstruktion eller under detrusor-sfinkterdyssynergi efter ryggmärgsskada. Även om det kan kräva en extra dos av hexametonium för att helt blockera urineringsreflexen, bör försiktighet iakttas för att inte administrera tillräckligt för att resultera i en överdosering. Detta kan leda till signifikant minskad hjärtminutvolym och äventyra experimentets kvalitet. Det bör noteras att samma hämmande effekt på blåsreflexen kan erhållas genom att antingen skära bäckens nerver bilateralt eller skära ryggmärgen vid nivå L4 eller högre. Detta ökar naturligtvis svårigheten med experimentuppställningen och den tid som krävs för att slutföra experimentet avsevärt.

Figur 2: Tryckregistreringar från råttor. Före (A) och efter (B) ganglieblock. Pilar indikerar när urinrörskatetern var ansluten. Observera att trycket i det övre spåret snabbt ökar när trycket når tröskeln för att inducera urinering, medan trycket i bottenspåret gradvis stiger. Klicka här för att se en större version av denna figur.

En annan mycket viktig faktor för dessa experiment är att säkerställa korrekt omvandling av luminometeravläsningarna (normalt uttryckta i RLU) till en koncentration av ATP med standardkurvor. Luciferin/luciferasreaktionen är mycket känslig för interfererande medel¹³. Denna störning kan komma från en direkt interaktion med luciferin / luciferas. Till exempel kan ett antal föreningar fungera som kompetitiva eller icke-kompetitiva hämmare av luciferas; en studie föreslog att ~ 3% av föreningarna i Molecular Libraries Small Molecule Repository kunde hämma eldfluga luciferas vid koncentrationer under 11 μM¹⁴. Dessutom är luciferin mottagligt för oxidationsmedel, vilket minskar mängden substrat tillgängligt för den luminiscensproducerande reaktionen¹⁵. Det är också möjligt att störa luciferin / luciferasreaktionen genom att ändra tillgängligheten av reaktionens co-faktor, magnesium. Till exempel är en vanlig teknik för att efterlikna mekanisk stretch i in vitro ATP-experiment att inducera cellsvullnad genom att minska osmolariteten hos perfuseringslösningen. Men många forskare uppnår denna minskning genom att späda lösningen med vatten, vilket minskar koncentrationen av magnesium som är tillgänglig för att fungera som en co-faktor i luciferin / luciferasreaktionen. Dessutom säljs vissa läkemedel som magnesiumsalter, vilket kraftigt kan öka mängden magnesium i lösningen, vilket också leder till mätbara skillnader i luminiscensavläsningar. Slutligen är det möjligt för en läkemedelslösning att störa förmågan att noggrant mäta ljuset som produceras av luciferin / luciferasreaktionen. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, även känd som erioglaucin eller FD&C Blue dye #1) är en specifik hämmare av pannexinmedierad ATP-frisättning¹⁶. Vid effektiva doser har Brilliant Blue FCF-lösningen en distinkt blå nyans som absorberar ljus vid en topp på cirka 600 nm¹⁷. Detta ligger inom intervallet av våglängder av ljus som avges av firefly luciferase; därför reduceras ljusemissionen i experiment med BB-FCF kraftigt. Således är det absolut nödvändigt att standardkurvor med användning av kända mängder ATP upplöst i lösningar innehållande varje experimentellt läkemedel används för att kvantifiera ATP-frisättningen under experimentet. Som visas i figur 3 minskar BB-FCF (100 μM) signifikant standardkurvans lutning, vilket är tillräckligt för att signifikant ändra de beräknade värdena för koncentrationen av ATP i provet. Som visas längst ner i figur 3 kan användning av Krebs-standarden för att beräkna koncentrationen av ATP i ett prov som innehåller BB-FCF resultera i en underskattning av ATP-koncentrationen med ~ 50%. I vissa fall kan användning av fel standardkurva dölja en läkemedelsmedierad förändring i ATP-frisättning eller få det felaktigt att se ut som om en förändring har inträffat. I experimentet som avbildas i figur 3 skulle till exempel användning av Krebs-standarden för alla prover ha fått det att se ut som att Brilliant Blue FCF minskade ATP-frisättningen med ~ 67% (16,6 till 5,5 nM) när den i själva verket bara hade minskat ~ 42% (16,6 till 9,6 nM).

Figur 3: Effekter av experimentella läkemedel på ATP-standardkurvan. Observera att pannexinkanalantagonisten, Brilliant Blue, signifikant förändrar RLU som uppmätts för en given koncentration av ATP, vilket skulle resultera i en underskattning av den uppmätta ATP, om den inte korrigeras för. Förkortning: RLUs = Relative Light Units; BB-FCF = Briljantblått FCF. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Ett annat övervägande att tänka på är att ATP vanligtvis frigörs från vävnader till följd av skada, och att dessa kirurgiska ingrepp och urinrörskateterinsättning kommer att resultera i onormalt höga ATP-avläsningar om de tas för snart efter installationen. Denna procedur beskriver en tvättperiod på 1 timme efter att experimentet har ställts in, vilket inte bör hoppas över. Vi har funnit att efter 1 h är ATP-koncentrationer uppmätta i prover som tas när blåsan inte är utspänd relativt låga (~ 10-30 nM) medan prover som tagits före wash-out-perioden kan läsa en storleksordning högre. Korta, 5 min washouts bör också utföras mellan distensioner eftersom ATP-nivåerna kan förbli förhöjda under en kort period. En bra tumregel skulle vara att mäta ATP i flera prover i början av experimentet och efter varje distension och bara fortsätta när ATP-avläsningarna planar ut. I figur 4 visar vi en representation av ett typiskt experiment med mätningar som gjorts vid olika tidpunkter. Notera de höga avläsningar som gjorts före washout (prov #1 och #5) jämfört med de som tagits efter washout (prov #2 och #6).

Figur 4: Representation av ett typiskt experiment. En stiliserad representation av en typisk tryckregistrering. Varje nummer representerar en tidpunkt då ett prov togs och mättes för ATP: 1) omedelbart efter att installationen är klar, före wash-out-perioden, 2) efter en wash-out-period på 1 timme, 3) omedelbart före en distension, 4) under distension, 5) omedelbart efter en distension och 6) efter en kort wash-out-period efter distensionen. Den infällda tabellen visar representativa RLU-värden och ATP-koncentrationer för varje prov. Förkortning: RLUs = Relative Light Units. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5 visar representativa grafer över experimentella resultat som undersöker mekanismen för ATP-frisättning från urotelet. Som visas i figur 5A orsakar ökande tryck en signifikant ökning av koncentrationen av ATP i blåsans lumen, med tryck på 30 cm vatten som ökar koncentrationerna nästan 2,5x av icke-utspända kontroller. Intravesikal perfusion av 2 E/ml apyras, ett enzym som katalyserar hydrolysen av ATP, minskar signifikant den uppmätta koncentrationen av ATP i blåsans lumen. Omvänt ökar intravesikal perfusion av ARL67156, en hämmare av NTPDaser närvarande på urotelet, signifikant luminala ATP-koncentrationer. Figur 5B visar experimenten i mekanismen för sträckinducerad ATP-frisättning från urotelet. Perfusion med pannexinkanalantagonisterna Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) eller karbenoxolon (CBX, 100 μM) minskar signifikant frisättningen av ATP i blåsans lumen vid alla tryck. Luminala ATP-koncentrationer minskar inte när connexinblockeraren 18a-glycyrrhetinsyra perfuseras, vilket indikerar att distension-framkallad ATP-frisättning medieras av pannexinkanaler och inte connexinkanaler.

Figur 5: Representativa mätningar av utspänd ATP-frisättning i urinblåsans lumen. (A) Blåsans distinktion ökar luminala ATP-koncentrationer, som kan minskas i närvaro av NTPDasapyras (2 E/ml) eller ökas när endogena NTPDaser hämmas med ARL67156 (10 μM). (B) Distension-framkallad ATP-frisättning blockeras av pannexinkanalantagonisterna Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) och karbenoxolon (CBX, 100 μM) men inte konnexinkanalantagonisten 18a-glycyrrhetinsyra (18a-GA, 50 μM). Data presenteras som medelvärdet med standardfelstaplar. ** p < 0,05 mellan de två staplarna som indikeras av linjen, ## p < 0,05 jämfört med Krebs-kontroller vid samma distension. Denna figur återges med tillstånd från Beckel et ^al.8. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Majoriteten av forskningen om urotelial ATP-frisättning utförs i odlade celler, med användning av antingen odödliga cellinjer eller primära kulturer av gnagare urotelceller. Medan dessa modeller har fördelen av att vara relativt hög genomströmning (dvs en kultur / passage kan göra många plattor / rätter av celler), minskar deras fysiologiska relevans på grund av: 1) urotelcellernas oförmåga att växa polariserade om de inte odlas på speciella stöd och 2) svårigheten att utsätta odlade celler för fysiologiska nivåer av sträckning / tryck. Ett sätt att hantera dessa begränsningar är genom att ta bort blåsan från en gnagare, skära upp den och placera den i en Ussing-kammare, sätta in blåsvävnaden mellan två halvkammare fyllda med fysiologisk lösning. Detta gör det möjligt för forskaren att utsätta urotelet, i sitt ursprungliga polariserade tillstånd, för distension genom att lägga till volym till kammarens uroteliala sida, vilket orsakar sträckning av blåsvävnaden i kammaren. Det är emellertid svårt att relatera denna sträcka till den distension som urotelet ser in vivo. Dessutom frigörs distension-framkallad ATP i Ussing-kammaren i den stora volymen fysiologisk vätska som finns i kammaren, vilket spädar koncentrationen av ATP flera gånger. Med hjälp av denna procedur mäts blåstrycket direkt, så att distension kan hållas i ett intervall som är relevant för fysiologi eller patofysiologi. Dessutom, eftersom vi mäter ATP-koncentrationen direkt från luminalvätskan och inte från en godtycklig och överdriven mängd vätska som används för att upprätthålla vävnad in vitro, behöver den uppmätta koncentrationen inte korrigeras. Således tillåter proceduren som beskrivs i detta dokument forskaren att undersöka ATP-frisättning i blåsans lumen under förhållanden som mycket mer liknar fysiologiska eller patofysiologiska tillstånd i urinblåsan.

Den beskrivna tekniken är mycket lik standard cystometri tekniker som används för att studera effekterna av läkemedel på reflexblåsans aktivitet och bör lätt utföras av alla som rutinmässigt utför dessa experiment. För de forskare som är nya för blåskateterisering finns det dock några försiktighetsåtgärder att vara medvetna om. För det första kan transuretral kateterisering vara svår för de oerfarna på grund av krökningen hos gnagareurinröret. Detta kan också försvåras av tätheten i den yttre urinrörsfinkteren, även under uretanbedövning. Det är absolut nödvändigt att forskaren inte försöker tvinga katetern in i urinröret, eftersom det sannolikt kommer att orsaka ökad inflammation och svullnad, vilket i sin tur kommer att göra urinröret ännu svårare att framgångsrikt kateterisera. Dessutom är det möjligt att sticka katetern genom urinrörets vägg och förstöra hela experimentet.

Vi har utvecklat några tips och tricks för att öka framgångsgraden. Till exempel är det ibland nödvändigt att ge djuret ytterligare en kort dos inhalerad isofluran (0,5% -1,0%) för att slappna av urinrörets sfinkter. Detta bör utföras sparsamt och med försiktighet, eftersom kombinationen av uretan och isofluran kan leda till andningsdepression. Ett annat knep är att doppa kateterns spets i en 2% lidokainlösning innan den sätts in i den yttre urinrörsöppningen; Detta kommer ofta att få sfinkteren att slappna av efter några minuter. Tömning av blåsan genom att försiktigt trycka på djurets buk kan också hjälpa till att slappna av urinrörets sfinkter. Slutligen kan det vara nödvändigt att använda en mindre gauge kateter; Vi använder ibland en 24 G-kateter, särskilt med mindre djur. Tänk dock på att det kan vara nödvändigt att minska infusionshastigheten i urinblåsan när du använder en mindre gauge transuretralkateter, för att matcha den långsammare dräneringen från urinrörskatetern. Underlåtenhet att göra det skulle orsaka blåstrycket att stiga, trots att urinrörskatetern inte är täckt.

Det bör noteras att uretan används som ett bedövningsmedel i detta protokoll. Uretan används ofta i laboratorier som studerar de nedre urinvägarna, eftersom det sparar miktionsreflexen medan andra anestetika inte gör det. På grund av detta kommer distension av blåsan över ett tryck på ~ 7-10 cm_H2Ounder uretanbedövning att utlösa en miktionsreflex. Eftersom vi är intresserade av ATP-frisättning som svar på passiv distension, kräver detta protokoll blockering av blåskontraktioner med hjälp av ganglieblockeraren hexametonium. Detta möjliggör mätning av ATP-frisättning som svar på de högre intravesikala trycken (dvs. 30 cm_H2O) som vanligtvis ses i blåspatologi som involverar utloppsobstruktion. Därför möjliggör användningen av en uretan / hexametonium mätning av distension-framkallad luminal ATP-frisättning under långa tidsperioder (verkningstiden för båda läkemedlen mäts i timmar). Vissa laboratorier kan dock föredra att använda ett bedövningsmedel som inte sparar miktionsreflexen, såsom ketamin, och eliminerar behovet av en ganglieblockerare. Detta kommer också att fungera bra för denna procedur, även om det kommer att kräva mer frekvent (eller kontinuerlig) administrering på grund av bedövningsmedlets kortare verkningstid.

En anmärkningsvärd skillnad mellan denna teknik för att mäta ATP och den vanliga cystometriuppsättningen urologiforskare kan vara bekanta med är användningen av buffrad Krebs-lösning som perfusat istället för den vanliga isotoniska saltlösningen. ATP är en ganska labil molekyl och stabiliseras något i en buffrad lösning. Dessutom är sammansättningen av Krebs-lösningen mycket närmare urinen än saltlösning, vilket ytterligare ger klinisk relevans för dessa experiment. Detta är ett viktigt övervägande, eftersom kontrollen av urotelial ATP-frisättning har visat sig moduleras av kalciumpermeabla kanaler, och bristen på kalcium i normal saltlösning kan påverka ATP-frisättningen negativt. Instabiliteten hos ATP i lösning är också anledningen till att vi föreslår att prover omedelbart kvantifieras med användning av luciferin-luciferasreaktionen. Om forskaren inte kan läsa proverna omedelbart bör proverna frysas så snabbt som möjligt för att begränsa nedbrytningen av ATP.

En begränsning med denna teknik är att den endast mäter luminal ATP-frisättning och inte kan mäta ATP-frisättning från urotelets serosala sida. Man tror att ATP frigörs från den serösa sidan för att direkt påverka afferent excitabilitet; Direkt mätning av denna utgåva är dock svår. I detta fall är användning av celler odlade på permeabla membranstöd såsom Transwell-plattor eller kirurgiskt avlägsnande av urotelet för Ussing-kammarexperiment den föredragna tekniken. Men med tanke på den uppenbara betydelsen av luminal ATP i blåspatologi är denna experimentella modell ett användbart verktyg för att belysa de cellulära mekanismerna som styr urotelial ATP-frisättning under patologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose