In vivo Luminal måling af distension-fremkaldt urothelial ATP-frigivelse hos gnavere

Summary

Denne protokol beskriver proceduren til måling af ATP-koncentrationer i blærens lumen i en bedøvet gnaver.

Abstract

ATP, frigivet fra urothelium som reaktion på blæreudspiling, menes at spille en væsentlig sensorisk rolle i kontrollen af mikturering. Derfor er nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse i en fysiologisk indstilling et vigtigt første skridt i at studere de mekanismer, der styrer purinerg signalering i urinblæren. Eksisterende teknikker til at studere mekanisk fremkaldt urothelial ATP-frigivelse udnytter dyrkede celler belagt på fleksible understøtninger eller blærevæv fastgjort i Ussing-kamre; Imidlertid efterligner hver af disse teknikker ikke fuldt ud forholdene i den intakte blære. Derfor blev der udviklet en eksperimentel opsætning til direkte måling af ATP-koncentrationer i lumen i gnaverurinblæren.

I denne opsætning perfuseres blærerne af bedøvede gnavere gennem katetre i både blærens kuppel og via den ydre urinrørsåbning. Trykket i blæren øges ved at dække urinrørets kateter, mens steril væske perfuseres ind i blæren gennem kuplen. Måling af intravesikalt tryk opnås ved hjælp af en tryktransducer, der er fastgjort til blærekuppelkateteret, svarende til den opsætning, der anvendes til cystometri. Når det ønskede tryk er nået, fjernes urinrørets kateterhætte, og væske opsamles til ATP-kvantificering ved luciferin-luciferase-assay. Gennem denne eksperimentelle opsætning kan mekanismerne, der styrer både mekanisk og kemisk stimulering af urothelial ATP-frigivelse, undersøges ved at inkludere forskellige agonister eller antagonister i perfusatet eller ved at sammenligne resultater mellem vildtype og genetisk modificerede dyr.

Introduction

Urin ATP menes at spille en væsentlig sensorisk rolle i kontrollen af mikturering¹. For eksempel menes det, at ATP frigives fra urothelium som reaktion på distension, hvor det kan virke på receptorer på blæreafferente nerver for at øge deres excitabilitet, hvilket fører til fornemmelser af fylde². Således menes det også, at urin-ATP kan være en vigtig aktør i udviklingen af blærepatologier. Til støtte for denne hypotese øges ATP-koncentrationerne i urinen signifikant hos patienter, der lider af overaktiv blære (OAB)³, blærepinesyndrom/interstitiel cystitis (BPS/IC)⁴ eller en urinvejsinfektion (UTI)^5,6, alle tilstande karakteriseret ved øget haster^, hyppighed og undertiden smerte. Omvendt har patienter, der lider af underaktiv blære (UAB), som er karakteriseret ved manglende evne til at tømme blæren og undertiden kan omfatte en nedsat evne til at mærke blærens fylde, vist sig at have nedsat ATP-koncentrationer i urinen⁷. Eksperimentelt kan manipulation af ATP-koncentrationer i urinen ændre blærereflekser hos rotten; stigende ATP-koncentrationer ved at blokere endogene ATPaser i blærens lumen kan øge tømningsfrekvensen, mens faldende ATP-koncentrationer ved at indføre eksogene ATPaser i blæren reducerer tømningsfrekvensen⁸. Således er betydningen af urin ATP til blærefunktion klar.

I betragtning af den tilsyneladende betydning af urin-ATP for blærepatologi er nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse et vigtigt skridt i forståelsen af de mekanismer, der styrer frigivelsen. Mange undersøgelser er afsluttet ved hjælp af forskellige eksperimentelle modeller til måling af urothelial ATP-frigivelse. Først og fremmest blandt disse er cellekulturer, enten primære kulturer eller cellelinjer. Imidlertid kompliceres brugen af dyrkede urothelceller af det faktum, at urothelceller ikke påtager sig deres fysiologiske polariserede morfologi, medmindre de dyrkes på specielle permeable membraner (såsom Transwell-teknologi [brøndindsatser])⁹. Det er således vanskeligt at relatere enhver ATP-frigivelse målt til fysiologi. Urotelceller dyrket på brøndindsatser kan polarisere og danne en barriere, der ligner det, der ses in vivo; Imidlertid kan væksten af et fuldt differentieret urothelium tage dage eller uger. Derudover, mens det er muligt at montere brøndindsatser i et Ussing-kammer og lægge pres på den apikale side for at forårsage strækning, er det vanskeligt at anvende tilstrækkeligt tryk til at efterligne tilstande inde i blæren under patologi (dvs. tryk på 30 cm H₂O eller derover). Hele blærevæv kan også monteres i et Ussing-kammer til strækforsøg, men dette fjerner blæren fra organismen sammen med de trofiske faktorer, der opretholder urothelialcellesundhed og dermed urothelial barrierefunktion. Derfor er den mest fysiologisk relevante måde at studere frigivelsen af ATP fra urothelium som reaktion på strækning eller tryk in vivo. De kirurgiske teknikker, der er nødvendige for at gennemføre forsøget, er identiske med dem, der almindeligvis anvendes i dyrecystometri, og bør derfor let udføres af alle, der er fortrolige med denne teknik.

I denne protokol vil vi beskrive den teknik, der anvendes til at undersøge luminal ATP hos kvindelige Sprague Dawley-rotter, der vejer ca. 200-250 g, da den transurethrale kateterisering beskrevet nedenfor er meget lettere hos kvinder; Imidlertid kan transuretral kateterisering også udføres hos mandlige gnavere¹⁰. Da transuretral kateterisering nu også er udført på mus af begge køn¹¹, kan disse eksperimenter let tilpasses mus eller rotter af begge køn eller af varierende størrelse afhængigt af forskerholdets behov.

Protocol

Alle procedurer, der udføres på gnavere, skal overholde de gældende retningslinjer og godkendes af den lokale institutionelle etiske vurderingskomité. Eksperimenterne udført til dette manuskript blev udført i overensstemmelse med National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 for en modificeret version af standardopsætningen af gnavercystometri, der anvendes i denne protokol.

1. Forsøgsdyr

1. Hold rotterne i sociale boliger (flere gnavere i et bur) med en 12 timers lys/mørk cyklus og ad libitum adgang til vand og madpiller.

2. Anæstesi og ganglionisk blok

1. Inducer indledende anæstesi ved at placere dyret i en lukket kasse gasset med 4% -5% isofluran i_O2 (1 l / min).
2. Bedøv dyret ved hjælp af urethan.
   1. Uretan injiceres subkutant bilateralt (1/2 dosis på hver side af dyret) i en dosis på 1,2 g/kg. Placer dyret i et bur for at lade urethanen træde i kraft, hvilket generelt tager 2 timer.
   2. Alternativt kan du administrere uretan intraperitonealt (i.p.) ved at injicere den fulde dosis i to separate doser ~ 10 min fra hinanden.
3. Efter at have ventet på det passende tidspunkt for urethanen at træde i kraft (sc: 2 timer, i.p.: 30 min), test for et korrekt anæstesiplan ved at klemme dyrets fod ved hjælp af tang. Hvis der observeres en refleks, skal du administrere en ekstra dosis uretan (0,05-0,1 ml i.p.), vente i 15 minutter og teste igen. Fortsæt med at overvåge dyret for det korrekte anæstesiplan under hele proceduren.
4. For at forhindre sammentrækning af blæren under udspiling injiceres dyret med et ganglionisk blokerende middel, såsom hexamethonium (20 mg / kg, i.p.).
5. Påfør oftalmisk salve på dyrets øjne for at forhindre tørring under eksperimentet.

3. Kirurgisk procedure-suprapubisk blærekateterisering

1. Barber dyrets underliv og udfør en midterlinie laparotomi for at udsætte urinblæren.
2. Forbered et kateter ved at flaring den ene ende af en kort (~ 10-15 cm) længde PE50 intramedic slange ved hjælp af en flamme. Anbring en 22 G kanyle i den anden ende af slangen og fyld med Krebs-opløsning (se Materialetabel for sammensætningen).
3. Placer en lille løkke af 3-0 silkesutur over blærens kuppel og udfør en lille cystostomi (ved hjælp af fin saks eller en 18 G nål), der er stor nok til at indsætte den flared ende af kateteret lavet ovenfor. Med den ene hånd, der holder kateteret på plads, skal du bruge den anden hånd til at stramme suturens løkke for at fastgøre kateteret på plads. Afslut fastgørelsen af kateteret ved at binde to knuder i suturen og trække kateteret tilbage, indtil det udstrakte hoved er i kontakt med blærevæggen.
   1. Alternativt kan du fastgøre kateteret ved hjælp af en klassisk pungstrengsuturteknik, som tidligere beskrevet for cystometri¹².
      BEMÆRK: Det er bydende nødvendigt ikke at indføre luftbobler i blæren under denne procedure.
4. Test opsætningen for lækager ved at infundere en lille mængde Krebs-opløsning gennem kateteret. Hvis væsken lækker ud af cystostomien, skal kateteret fastgøres igen med yderligere sutur omkring cystostomien.

4. Transuretral kateterisering

1. Dyp enden af et 20 G x 1" IV-kateter (med nålen fjernet) i kirurgisk smøremiddel.
2. Hold forsigtigt den ydre urethral meatus med et par tang og indsæt spidsen af kateteret i urinrørets åbning i retning af halen, indtil spidsen får væggen i den tilstødende vaginale åbning til at deformere. Drej kateteret 90° (før Luer-Lock-enden af kateteret mod halen) og gå forsigtigt frem. Indsæt kateteret helt, indtil Luer-Lock-navet er ca. 5 mm distalt fra den udvendige urinrørsåbning.
   BEMÆRK: Indsæt ikke kateteret for langt, da det kan få spidsen til at stikke blærens indvendige væg. Hvis der mærkes modstand under fremrykning af kateteret, skal du stoppe og begynde igen eller risikere at punktere urinrøret. Se diskussionsafsnittet om tips til at øge vellykket kateterisering.
3. Fastgør kateteret og forhindre lækage omkring kateteret ved at løkke en kort længde på 3-0 silkesutur omkring den ydre urinrørskød og binde den tæt af. Fastgør kateteret til halen med tape for at forhindre, at det ved et uheld trækkes ud.
4. Når det er kateteriseret, skal Krebs-opløsningen forsigtigt tilføres blæren gennem det suprapubiske blærekateter og bekræfte, at væsken strømmer ud af urinrøret kateteret og ikke omkring det. Retie om nødvendigt suturen omkring den ydre urinrørsåbning.
5. Luk abdominalsnittet over blæren ved hjælp af en 3-0 silkesutur.

5. Eksperimentel opsætning

1. Fastgør dyret på et bræt, der kan være tilbøjelig til at hjælpe med dræning af intravesikal væske gennem urinrøret. Placer en varmepude og absorberende underpude mellem dyret og brættet for at opretholde kropsvarmen og absorbere væske, der drænes fra urinrøret.
2. Tilslut det suprapubiske kateter til en trevejs stophane, som forbinder kateteret med en sprøjtepumpe og en tryktransducer. Tilslut tryktransduceren til en computer ved hjælp af en forstærker og et dataindsamlingssystem.
   BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at forhindre, at der dannes luftbobler i slangen, der forbinder sprøjtepumpen, transduceren og blærekateteret.
3. Registrering af blæretryk kalibreres ved hjælp af den procedure, der er foreslået af producenten af tryktransduceren og/eller dataindsamlingssoftwaren.
4. Krebs-opløsningen tilføres gennem det suprapubiske kateter med en hastighed på 0,1 ml/min., og væsken ledes ud af urethralkateteret i 1 time for at udvaske eventuel resterende ATP, der frigives under kateterimplantationerne.
5. Efter denne udvaskningsperiode skal du hætte urethralkateteret ved hjælp af en Luer-Lock-prop og måle trykket i blæren. Se efter en langsom stigning i det intravesiske tryk til et tryk på 30 cm H 2 Ouden en kraftig stigning i trykket, hvilket ville indikere en blærekontraktion (se figur 2). Fjern stikket fra urinrørets kateter, når trykket når 30 cm H₂O for at forhindre beskadigelse af blæren.
   BEMÆRK: Hvis blærekontraktioner fortsætter efter 1 time, gives en ekstra dosis hexamethonium (5 mg/kg dosis i.p.).

6. Indsamling af prøver

1. Blæren tilføres 0,1 ml/min., og eluatet opsamles fra urinrørets kateter. Der testes straks 100 μL alikvoter af eluatet for ATP (se nedenfor), eller der fryses med henblik på senere batchkvantificering.
2. For at teste effekten af blæreudspiling på luminale ATP-koncentrationer skal du hætte urethralkateteret med stikket og overvåge blæretrykket, indtil det når det ønskede niveau. Fjern derefter hætten på urethralkateteret og saml eluatet til ATP-måling eller frysning som beskrevet ovenfor.
3. Efter hver udspiling skal du lade blæren hvile og vaske ud i 10-15 minutter, før du tager yderligere prøver. Der udtages i alt 3-5 prædistensionsprøver og 3-5 prøver ved hvert ønsket afstandstryk for at demonstrere repeterbarhed.
4. For at teste virkningen af lægemidler på frigivelsen af ATP skal du skifte Krebs-opløsningen, der infunderer blæren, til Krebs, der indeholder det valgte lægemiddel. Perfus ved 0,1 ml / min i 10-15 minutter for lægemidlet at have en effekt, og opsaml derefter prøverne fra ikke-udspilede og udspilede blærer som beskrevet i trin 6.1 og 6.2.

7. Kvantificering af ATP fra indsamlede prøver

1. Kvantificer ATP i de indsamlede 100 μL prøver ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt luciferin/luciferase assaysæt efter producentens anvisninger og et luminometer.
   1. For at kvantificere ATP kombineres 100 μL prøver af perfusat med 50 μL af analyseblandingen og placeres i luminometeret til aflæsning. For at konvertere de relative lysenheder (RLU'er), der rapporteres af luminometeret, til en koncentration af ATP, skal der foretages serielle fortyndinger af ATP i Krebs-opløsning, der spænder fra 1 μM til 10 pM i 10 gange fortyndinger for at skabe en standardkurve og læse dem i luminometeret. De resulterende aflæsninger plottes på en graf og udfører en ikke-lineær (kvadratisk) regression for at ekstrapolere koncentrationer fra prøverne taget fra dyret.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at lave ATP-standarder for enhver lægemiddelopløsning, der testes i eksperimentet, da mange lægemidler interfererer med luciferin / luciferase-reaktionen, som skal korrigeres for.

8. Eutanasi af dyr

1. Når forsøget er afsluttet, og alle prøverne er indsamlet, aflives dyret humant i henhold til USDA-retningslinjerne og National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
   1. Fjern det bedøvede dyr fra forsøgsopsætningen, læg det i en lukket kasse og gas det med 100% CO₂. Sørg for, at fyldningshastigheden er lig med 30% -70% af kammerets volumen pr. minut (f.eks. 3-7 l / min for en kasse med et volumen på 10 L). Fortsæt CO₂ -strømmen i mindst 1 minut efter respirationen ophører.
2. Brug en sekundær form for eutanasi for at sikre døden.
   1. Udfør en thoracotomi som en sekundær form for eutanasi ved at tage fat i den lille hudflap i brystbenets kaudale ende og skære et lille hul i huden og muskulaturen ved mellemgulvet med en skarp saks. Afslut thoracotomien ved at indsætte saksen i åbningen og skære rostralt gennem brystkassen og udsætte brysthulen.
      BEMÆRK: Det aflivede dyr skal bortskaffes i henhold til institutionelle retningslinjer.

Representative Results

Den beskrevne protokol muliggør nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse in vivo fra blærens lumen ved hjælp af en modificeret version af standard gnavercystometriopsætningen (se figur 1). Dette gør det muligt for forskeren at undersøge virkningerne af lægemidler på stretch-medieret ATP-frigivelse i en fysiologisk indstilling.

Figur 1: Eksperimentel opsætning . (A) Billede, der viser forsøgsopstillingen med det forskellige udstyr mærket. Det område af dyret, der er skitseret i et rødt rektangel, er vist i B. (B) Fotografi, der viser rottens mave efter operationen. Bemærk det suprapubiske kateter, der indsættes og bindes i blærekuplen, samt urethralkateteret indsat gennem den ydre åbning. Urethralkateteret er tilsluttet billedet for at vise, at blæretrykket øges under perfusion gennem blærekateteret. Under eksperimentet ville abdominalåbningen blive sutureret lukket, men blev efterladt åben her for at muliggøre visualisering af urinblæren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Af primær betydning for en vellykket måling af strækmedieret ATP-frigivelse i gnaverblæren er at sikre, at miktureringsrefleksen er blokeret, så blæren kan udspiles ud over det tærskeltryk, der normalt er tilstrækkeligt til at aktivere miktureringsrefleksen. Som vist i figur 2A, når urethralkateteret er tilsluttet, forårsager infusion af opløsningen i blæren, at intravesikalt tryk stiger kraftigt, når blæren trækker sig sammen. Da vi er interesserede i virkningerne af passiv strækning, ikke sammentrækning, på urothelial ATP-frigivelse, behandles dyret med en ganglionisk blokker, hexamethonium, for at forhindre miktureringsrefleksen. Som det fremgår af figur 2B, når hexamethonium administreres, resulterer instillation af opløsningen i blæren med urinrøret kateteret blokeret i en meget mere gradvis stigning i intravesikalt tryk, hvilket gør det muligt for tryk at stige så højt som 30 cm_H2Ouden sammentrækning. Dette muliggør måling af luminal ATP-frigivelse ved tryk, der er høje nok til at være relevante for patologi, såsom dem, der observeres i en underaktiv blære, delvis blæreudløbsobstruktion eller under detrusor-sphincter dyssynergi efter rygmarvsskade. Selvom det kan kræve en supplerende dosis hexamethonium for fuldstændigt at blokere miktureringsrefleksen, skal man passe på ikke at administrere nok til at resultere i en overdosis. Dette kan føre til signifikant nedsat hjerteudgang og kompromittere eksperimentets kvalitet. Det skal bemærkes, at den samme hæmmende virkning på blærerefleksen kan opnås ved enten at skære bækkennerverne bilateralt eller skære rygmarven på niveau L4 eller derover. Dette øger naturligvis vanskeligheden ved den eksperimentelle opsætning og den tid, der kræves for at gennemføre eksperimentet, betydeligt.

Figur 2: Trykoptagelser fra rotter. Før (A) og efter (B) ganglionisk blok. Pile angiver, hvornår urethralkateteret blev tilsluttet. Bemærk, at trykket i det øverste spor hurtigt stiger, når trykket når tærsklen for at fremkalde mikturering, mens trykket i bundsporet gradvist stiger. Klik her for at se en større version af denne figur.

En anden meget vigtig overvejelse for disse eksperimenter er at sikre korrekt konvertering af luminometeraflæsningerne (normalt udtrykt i RLU'er) til en koncentration af ATP ved hjælp af standardkurver. Luciferin/luciferase-reaktionen er meget modtagelig for interfererende stoffer¹³. Denne interferens kan komme fra en direkte interaktion med luciferin / luciferase. For eksempel kan en række forbindelser virke som konkurrencedygtige eller ikke-konkurrencedygtige hæmmere af luciferase; en undersøgelse foreslog, at ~ 3% af forbindelserne i Molecular Libraries Small Molecule Repository kunne hæmme firefly luciferase i koncentrationer under 11 μM¹⁴. Desuden er luciferin modtageligt for oxidationsmidler, hvilket reducerer mængden af substrat, der er tilgængeligt for den luminescensproducerende reaktion¹⁵. Det er også muligt at forstyrre luciferin/luciferase-reaktionen ved at ændre tilgængeligheden af reaktionens cofaktor, magnesium. For eksempel er en almindelig teknik til efterligning af mekanisk strækning i in vitro ATP-eksperimenter at fremkalde cellehævelse ved at reducere osmolariteten af perfuseringsopløsningen. Imidlertid opnår mange forskere denne reduktion ved at fortynde opløsningen med vand, hvilket reducerer koncentrationen af magnesium, der er tilgængelig for at fungere som en co-faktor i luciferin / luciferase-reaktionen. Derudover sælges nogle lægemidler som magnesiumsalte, hvilket i høj grad kan øge mængden af magnesium i opløsningen, hvilket også fører til målbare forskelle i luminescensaflæsninger. Endelig er det muligt for en lægemiddelopløsning at forstyrre evnen til nøjagtigt at måle det lys, der produceres af luciferin / luciferase-reaktionen. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, også kendt som erioglaucin eller FD&C Blue dye #1) er en specifik hæmmer af pannexin-medieret ATP-frigivelse¹⁶. Ved effektive doser har Brilliant Blue FCF-opløsningen en tydelig blå nuance, som absorberer lys ved en top på omkring 600 nm¹⁷. Dette er inden for området for bølgelængder af lys, der udsendes af ildflue luciferase; derfor reduceres lysemission i forsøg med BB-FCF kraftigt. Det er således afgørende, at standardkurver ved hjælp af kendte mængder ATP opløst i opløsninger indeholdende hvert eksperimentelt lægemiddel anvendes til at kvantificere ATP-frigivelsen under eksperimentet. Som vist i figur 3 reducerer BB-FCF (100 μM) signifikant standardkurvens hældning, hvilket er tilstrækkeligt til signifikant at ændre de beregnede værdier for koncentrationen af ATP i prøven. Som vist nederst i figur 3 kan brug af Krebs-standarden til beregning af ATP-koncentrationen i en prøve, der indeholder BB-FCF, resultere i en undervurdering af ATP-koncentrationen med ~50%. I nogle tilfælde kan brug af den forkerte standardkurve skjule en lægemiddelmedieret ændring i ATP-frigivelse eller få det til fejlagtigt at se ud som om der er sket en ændring. I eksperimentet afbildet i figur 3 ville brugen af Krebs-standarden for alle prøver for eksempel have fået det til at se ud til, at Brilliant Blue FCF reducerede ATP-frigivelsen med ~ 67% (16,6 til 5,5 nM), når den i virkeligheden kun var faldet ~ 42% (16,6 til 9,6 nM).

Figur 3: Effekter af eksperimentelle lægemidler på ATP-standardkurven. Bemærk, at pannexinkanalantagonisten, Brilliant Blue, signifikant ændrer RLU'erne målt for en given koncentration af ATP, hvilket ville resultere i en undervurdering af ATP målt, hvis ikke korrigeret for. Forkortelse: RLU'er = relative lette enheder; BB-FCF = Strålende blå FCF. Klik her for at se en større version af denne figur.

En anden overvejelse at huske på er, at ATP almindeligvis frigives fra væv som følge af skade, og at disse kirurgiske procedurer og indsættelse af urethrale kateter vil resultere i unormalt høje ATP-aflæsninger, hvis de tages for hurtigt efter opsætningen. Denne procedure beskriver en udvaskningsperiode på 1 time efter eksperimentets opsætning, som ikke bør springes over. Vi har fundet ud af, at efter 1 time er ATP-koncentrationer målt i prøver taget, når blæren ikke er udspilet, relativt lave (~ 10-30 nM), mens prøver taget før udvaskningsperioden kan læse en størrelsesorden højere. Korte, 5 minutters udvaskninger bør også udføres mellem udspiling, da ATP-niveauer kan forblive forhøjede i en kort periode. En god tommelfingerregel ville være at måle ATP i flere prøver i begyndelsen af eksperimentet og efter hver distension og kun fortsætte, når ATP-aflæsningerne udjævnes. I figur 4 viser vi en repræsentation af et typisk eksperiment med målinger foretaget på forskellige tidspunkter. Bemærk de høje aflæsninger taget før udvaskning (prøver #1 og #5) versus dem, der er taget efter udvaskning (prøver #2 og #6).

Figur 4: Repræsentation af et typisk eksperiment. En stiliseret gengivelse af en typisk trykoptagelse. Hvert tal repræsenterer et tidspunkt, hvor en prøve blev taget og målt for ATP: 1) umiddelbart efter opsætningen er afsluttet, før udvaskningsperioden, 2) efter en 1 times udvaskningsperiode, 3) umiddelbart før en udspiling, 4) under udspiling, 5) umiddelbart efter en udspiling og 6) efter en kort udvaskningsperiode efter udspilingen. Den indsatte tabel viser repræsentative RLU-værdier og ATP-koncentrationer for hver prøve. Forkortelse: RLU'er = relative lette enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5 viser repræsentative grafer over eksperimentelle resultater, der undersøger mekanismen for ATP-frigivelse fra urothelium. Som vist i figur 5A forårsager stigende tryk en signifikant stigning i koncentrationen af ATP i blærens lumen, med tryk på 30 cm vand, der øger koncentrationerne næsten 2,5x af ikke-udspilede kontroller. Intravesikal perfusion af 2 E / ml apyrase, et enzym, der katalyserer hydrolysen af ATP, reducerer signifikant den målte koncentration af ATP i blærens lumen. Omvendt øger intravesikal perfusion af ARL67156, en hæmmer af NTPDaser, der er til stede på urothelium, signifikant luminale ATP-koncentrationer. Figur 5B viser eksperimenterne i mekanismen for stretch-induceret ATP-frigivelse fra urothelium. Perfusion med pannexinkanalantagonisterne Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) eller carbenoxolon (CBX, 100 μM) reducerer signifikant frigivelsen af ATP i blærens lumen ved alle tryk. Luminal ATP-koncentrationer reduceres ikke, når connexinblokkeren 18a-glycyrrhetinsyre perfuseres, hvilket indikerer, at distension-fremkaldt ATP-frigivelse medieres af pannexinkanaler og ikke connexinkanaler.

Figur 5: Repræsentative målinger af distension-fremkaldt ATP-frigivelse i urinblærens lumen. (A) Udspiling af blæren øger luminale ATP-koncentrationer, som kan mindskes ved tilstedeværelse af NTPDase-apyrase (2 E / ml) eller øges, når endogene NTPDaser hæmmes med ARL67156 (10 μM). (B) Distension-fremkaldt ATP-frigivelse blokeres af pannexinkanalantagonisterne Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) og carbenoxolon (CBX, 100 μM), men ikke connexinkanalantagonisten 18α-glycyrrhetinsyre (18α-GA, 50 μM). Data præsenteres som middelværdien med standardfejlbjælker. ** p < 0,05 mellem de to søjler angivet med linjen, ## p < 0,05 sammenlignet med Krebs-kontroller ved samme udspiling. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Beckel et ^al.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Størstedelen af forskningen i urothelial ATP-frigivelse udføres i dyrkede celler ved hjælp af enten udødeliggjorte cellelinjer eller primære kulturer af gnaverurothelceller . Mens disse modeller har fordelen ved at være relativt høj gennemstrømning (dvs. en kultur / passage kan lave mange plader / skåle af celler), mindskes deres fysiologiske relevans på grund af: 1) urothelcellers manglende evne til at vokse polariseret, medmindre de dyrkes på specielle understøtninger og 2) vanskeligheden ved at udsætte dyrkede celler for fysiologiske niveauer af strækning / tryk. En måde at håndtere disse begrænsninger på er ved at fjerne blæren fra en gnaver, skære den åben og placere den i et Ussing-kammer og indsætte blærevævet mellem to halvkamre fyldt med fysiologisk opløsning. Dette gør det muligt for forskeren at udsætte urothelium i sin oprindelige polariserede tilstand for distension ved at tilføje volumen til den urotheliale side af kammeret, hvilket forårsager strækning af blærevævet i kammeret. Det er imidlertid vanskeligt at relatere denne strækning til den distension, der ses af urothelium in vivo. Desuden frigives distension-fremkaldt ATP i Ussing-kammeret i det store volumen fysiologisk væske indeholdt i kammeret, hvilket fortynder koncentrationen af ATP flere gange. Ved hjælp af denne procedure måles blæretrykket direkte, således at distension kan holdes inden for et område, der er relevant for fysiologi eller patofysiologi. Da vi måler ATP-koncentrationen direkte fra luminalvæsken og ikke fra en vilkårlig og overdreven mængde væske, der bruges til at opretholde væv in vitro, behøver den målte koncentration ikke korrigeres. Således giver proceduren beskrevet i dette papir forskeren mulighed for at undersøge ATP-frigivelse i blærens lumen under forhold, der meget mere ligner fysiologiske eller patofysiologiske tilstande i blæren.

Den beskrevne teknik ligner meget standard cystometriteknikker, der bruges til at studere virkningerne af lægemidler på refleksblæreaktivitet og bør let udføres af enhver, der rutinemæssigt udfører disse eksperimenter. For de forskere, der er nye inden for blærekateterisering, er der dog et par advarsler at være opmærksomme på. For det første kan transuretral kateterisering være vanskelig for de uerfarne på grund af krumningen af gnaverurinrøret. Dette kan også vanskeliggøres af tætheden af den eksterne urethrale sphincter, selv under urethanbedøvelse. Det er afgørende, at forskeren ikke forsøger at tvinge kateteret ind i urinrøret, da det højst sandsynligt vil forårsage øget betændelse og hævelse, hvilket igen vil gøre urinrøret endnu sværere at kateterisere med succes. Derudover er det muligt at stikke kateteret gennem urinrørets væg og ødelægge hele eksperimentet.

Vi har udviklet nogle tips og tricks til at øge succesraten. For eksempel er det undertiden nødvendigt at give dyret en anden kort dosis inhaleret isofluran (0,5% -1,0%) for at slappe af urinrørets lukkemuskel. Dette bør udføres sparsomt og forsigtigt, da kombinationen af urethan og isofluran kan resultere i respirationsdepression. Et andet trick er at dyppe spidsen af kateteret i en 2% lidokainopløsning, før den indsættes i den ydre urinrørsåbning; Dette vil ofte få lukkemusklen til at slappe af efter et par minutter. Tømning af blæren ved forsigtigt at trykke på dyrets underliv kan også hjælpe med at slappe af urinrørets sphincter. Endelig kan det være nødvendigt at bruge et mindre gauge kateter; Vi bruger nogle gange et 24 G kateter, især med mindre dyr. Vær dog opmærksom på, at det kan være nødvendigt at reducere infusionshastigheden i blæren, når du bruger et transurethralt kateter med mindre måler, for at matche den langsommere dræning fra urethralkateteret. Undladelse af at gøre det ville få blæretrykket til at stige, på trods af at urinrørskateteret ikke er lukket.

Det skal bemærkes, at uretan anvendes som bedøvelsesmiddel i denne protokol. Uretan er almindeligt anvendt i laboratorier, der studerer den nedre urinvej, da det sparer miktureringsrefleksen, mens andre anæstetika ikke gør det. På grund af dette vil udspiling af blæren over et tryk på ~ 7-10 cm_H2Ounder urethanbedøvelse udløse en miktureringsrefleks. Da vi er interesserede i ATP-frigivelse som reaktion på passiv distension, kræver denne protokol blokering af blærekontraktioner ved hjælp af ganglionblokkeren hexamethonium. Dette muliggør måling af ATP-frigivelse som reaktion på de højere intravesikale tryk (dvs. 30 cm_H2O), der almindeligvis ses i blærepatologi, der involverer udløbsobstruktion. Derfor tillader brugen af uretan / hexamethonium måling af distension-fremkaldt luminal ATP-frigivelse i lange perioder (virkningsvarigheden af begge lægemidler måles i timer). Nogle laboratorier kan dog foretrække at bruge et bedøvelsesmiddel, der ikke sparer miktureringsrefleksen, såsom ketamin, og eliminerer behovet for en ganglionisk blokker. Dette vil også fungere godt for denne procedure, selvom det vil kræve hyppigere (eller kontinuerlig) administration på grund af den kortere virkningsvarighed af bedøvelsesmidlet.

En bemærkelsesværdig forskel mellem denne teknik til måling af ATP og den almindelige cystometri opsætning urologi forskere kan være bekendt med er brugen af bufret Krebs opløsning som et perfusat i stedet for standard isotonisk saltopløsning. ATP er et ret labil molekyle og stabiliseres noget i en bufret opløsning. Derudover er sammensætningen af Krebs-opløsningen meget tættere på urinens end saltvand, hvilket yderligere tilføjer klinisk relevans til disse eksperimenter. Dette er en vigtig overvejelse, da kontrollen af urothelial ATP-frigivelse har vist sig at være moduleret af calciumgennemtrængelige kanaler, og manglen på calcium i normalt saltvand kan påvirke ATP-frigivelsen negativt. Ustabiliteten af ATP i opløsning er også grunden til, at vi foreslår, at prøver straks kvantificeres ved hjælp af luciferin-luciferase-reaktionen. Men hvis forskeren ikke er i stand til at læse prøverne med det samme, skal prøverne fryses så hurtigt som muligt for at begrænse nedbrydningen af ATP.

En begrænsning ved denne teknik er, at den kun måler luminal ATP-frigivelse og ikke kan måle ATP-frigivelse fra den serosale side af urothelium. Det antages, at ATP frigives fra den serosale side for direkte at påvirke afferent excitabilitet; Imidlertid er direkte måling af denne udgivelse vanskelig. I dette tilfælde er det den foretrukne teknik at bruge celler dyrket på permeable membranstøtter såsom Transwell-plader eller kirurgisk fjernelse af urothelium til Ussing-kammereksperimenter. I betragtning af den tilsyneladende betydning af luminal ATP i blærepatologi er denne eksperimentelle model imidlertid et nyttigt værktøj til at belyse de cellulære mekanismer, der styrer urothelial ATP-frigivelse under patologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose