Summary
Este protocolo describe el procedimiento para medir las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga en un roedor anestesiado.
Abstract
Se cree que el ATP, liberado del urotelio en respuesta a la distensión de la vejiga, desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción. Por lo tanto, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP en un entorno fisiológico es un primer paso importante en el estudio de los mecanismos que controlan la señalización purinérgica en la vejiga urinaria. Las técnicas existentes para estudiar la liberación urotelial de ATP evocada mecánicamente utilizan células cultivadas en soportes flexibles o tejido vesical fijado en cámaras de Ussing; Sin embargo, cada una de estas técnicas no emula completamente las condiciones en la vejiga intacta. Por lo tanto, se desarrolló una configuración experimental para medir directamente las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga urinaria de roedor.
En esta configuración, las vejigas de los roedores anestesiados se perfunden a través de catéteres tanto en la cúpula de la vejiga como a través del orificio uretral externo. La presión en la vejiga aumenta al tapar el catéter uretral mientras se perfunde líquido estéril en la vejiga a través de la cúpula. La medición de la presión intravesical se logra utilizando un transductor de presión conectado al catéter domo de la vejiga, similar a la configuración utilizada para la cistometría. Una vez que se alcanza la presión deseada, se retira la tapa del catéter uretral y se recoge líquido para la cuantificación de ATP mediante el ensayo de luciferina-luciferasa. A través de esta configuración experimental, los mecanismos que controlan la estimulación mecánica y química de la liberación urotelial de ATP pueden ser interrogados mediante la inclusión de varios agonistas o antagonistas en el perfusiónto o mediante la comparación de los resultados entre animales salvajes y genéticamente modificados.
Introduction
Se cree que el ATP urinario desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción1. Por ejemplo, se cree que el ATP se libera del urotelio en respuesta a la distensión donde puede actuar sobre los receptores sobre los nervios aferentes de la vejiga para aumentar su excitabilidad, dando lugar a sensaciones de plenitud2. Por lo tanto, también se piensa que el ATP urinario podría ser un jugador importante en el desarrollo de patologías de la vejiga. En apoyo de esta hipótesis, las concentraciones urinarias de ATP están significativamente aumentadas en pacientes con vejiga hiperactiva (VH)3, síndrome de dolor vesical/cistitis intersticial (BPS/IC)4 o infección urinaria (ITU)5,6, todas ellas condiciones caracterizadas por mayor urgencia, frecuencia y, a veces, dolor. Por el contrario, se ha demostrado que los pacientes que sufren de vejiga hipoactiva (BAU), que se caracteriza por una incapacidad para vaciar la vejiga y a veces puede incluir una disminución de la capacidad para detectar la plenitud de la vejiga, tienen concentraciones urinarias de ATP disminuidas7. Experimentalmente, la manipulación de las concentraciones urinarias de ATP puede alterar los reflejos vesicales en la rata; El aumento de las concentraciones de ATP mediante el bloqueo de las ATPasas endógenas en la luz de la vejiga puede aumentar la frecuencia miccional, mientras que la disminución de las concentraciones de ATP mediante la instilación de ATPasas exógenas en la vejiga reduce la frecuencia miccional8. Por lo tanto, la importancia del ATP urinario para la función de la vejiga es clara.
Dada la aparente importancia del ATP urinario para la patología de la vejiga, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP es un paso importante para comprender los mecanismos que controlan la liberación. Se han completado muchos estudios utilizando diferentes modelos experimentales para medir la liberación urotelial de ATP. Los más importantes son los cultivos celulares, ya sean cultivos primarios o líneas celulares. Sin embargo, el uso de células uroteliales cultivadas se complica por el hecho de que las células uroteliales no adquieren su morfología fisiológica polarizada a menos que se cultiven en membranas permeables especiales (como la tecnología Transwell [insertos de pozo])9. Por lo tanto, es difícil relacionar cualquier liberación de ATP medida con la fisiología. Las células uroteliales cultivadas en insertos de pozos pueden polarizarse y formar una barrera similar a lo que se ve in vivo; Sin embargo, el crecimiento de un urotelio completamente diferenciado puede tardar días o semanas. Además, si bien es posible montar inserciones de pozo en una cámara de Ussing y aplicar presión al lado apical para causar estiramiento, es difícil aplicar suficiente presión para imitar las condiciones dentro de la vejiga durante la patología (es decir, presiones de 30 cm H2O o más). El tejido de toda la vejiga también se puede montar en una cámara de Ussing para experimentos de estiramiento, pero esto elimina la vejiga del organismo junto con los factores tróficos que mantienen la salud de las células uroteliales y, por lo tanto, la función de barrera urotelial. Por lo tanto, la forma fisiológicamente más relevante de estudiar la liberación de ATP del urotelio en respuesta al estiramiento o la presión es in vivo. Las técnicas quirúrgicas necesarias para establecer el experimento son idénticas a las comúnmente utilizadas en la cistometría animal y, por lo tanto, deben ser realizadas fácilmente por cualquier persona familiarizada con esa técnica.
En este protocolo, describiremos la técnica utilizada para examinar el ATP luminal en ratas hembras Sprague Dawley que pesan aproximadamente 200-250 g, ya que el cateterismo transuretral descrito a continuación es mucho más fácil en hembras; Sin embargo, el cateterismo transuretral también puede ser realizado en roedores machos10. Como el cateterismo transuretral también se ha realizado en ratones de ambos sexos11, estos experimentos pueden adaptarse fácilmente para ratones o ratas de cualquier sexo o de diferentes tamaños, dependiendo de las necesidades del equipo de investigación.
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Protocol
Todos los procedimientos llevados a cabo en roedores deben cumplir con las pautas aplicables y ser aprobados por el comité local de revisión de ética institucional. Los experimentos realizados para este manuscrito se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh. Consulte la Figura 1 para obtener una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores utilizada en este protocolo.
1. Animales de laboratorio
- Mantener a las ratas en viviendas sociales (múltiples roedores en una jaula) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y acceso ad libitum a agua y pellets de comida.
2. Anestesia y bloqueo ganglionar
- Inducir la anestesia inicial colocando al animal en una caja cerrada gaseada con isoflurano al 4%-5% enO2 (1 L/min).
- Anestesiar al animal usando uretano.
- Inyectar uretano por vía subcutánea bilateralmente (1/2 dosis en cada lado del animal) a una dosis de 1,2 g/kg. Coloque al animal en una jaula para permitir que el uretano haga efecto, lo que generalmente toma 2 h.
- Alternativamente, administre uretano por vía intraperitoneal (i.p.) inyectando la dosis completa en dos dosis separadas ~ 10 min de diferencia.
- Después de esperar el momento adecuado para que el uretano haga efecto (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), pruebe un plano adecuado de anestesia pellizcando el pie del animal con fórceps. Si se observa un reflejo, administre una dosis adicional de uretano (0.05-0.1 ml i.p.), espere 15 min y vuelva a realizar la prueba. Continúe monitoreando al animal para el plano adecuado de anestesia durante todo el procedimiento.
- Para evitar una contracción de la vejiga durante la distensión, inyecte al animal un agente bloqueador ganglionar, como hexametonio (20 mg / kg, i.p.).
- Aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar que se seque durante el experimento.
3. Procedimiento quirúrgico: cateterismo vesical suprapúbico
- Afeitar el abdomen del animal y realizar una laparotomía de línea media para exponer la vejiga urinaria.
- Prepare un catéter quemando un extremo de un tubo intramédico PE50 de longitud corta (~10-15 cm) con una llama. Coloque una aguja de 22 G en el otro extremo del tubo y llénela con solución de Krebs (consulte la Tabla de materiales para la composición).
- Coloque un pequeño lazo de sutura de seda 3-0 sobre la cúpula de la vejiga y realice una pequeña cistostomía (usando tijeras finas o una aguja de 18 G) lo suficientemente grande como para insertar el extremo ensanchado del catéter hecho arriba. Con una mano sosteniendo el catéter en su lugar, use la otra mano para apretar el asa de la sutura para asegurar el catéter en su lugar. Termine de asegurar el catéter atando dos nudos en la sutura y tirando del catéter hacia atrás hasta que la cabeza ensanchada esté en contacto con la pared de la vejiga.
- Alternativamente, asegure el catéter utilizando una técnica clásica de sutura con cuerdas de bolso, como se describió anteriormente para la cistometría12.
NOTA: Es imperativo no introducir burbujas de aire en la vejiga durante este procedimiento.
- Alternativamente, asegure el catéter utilizando una técnica clásica de sutura con cuerdas de bolso, como se describió anteriormente para la cistometría12.
- Pruebe la configuración para detectar fugas infundiendo una pequeña cantidad de solución de Krebs a través del catéter. Si el líquido se escapa de la cistostomía, vuelva a asegurar el catéter con sutura adicional alrededor de la cistostomía.
4. Cateterismo transuretral
- Sumerja el extremo de un catéter intravenoso de 20 G x 1" (sin la aguja) en lubricante quirúrgico.
- Sostenga suavemente el meato uretral externo con un par de fórceps e inserte la punta del catéter en el orificio uretral en la dirección de la cola hasta que la punta haga que la pared de la abertura vaginal adyacente se deforme. Gire el catéter 90° (llevando el extremo Luer-Lock del catéter hacia la cola) y avance suavemente. Inserte completamente el catéter hasta que el cubo Luer-Lock esté aproximadamente a 5 mm distal de la abertura uretral externa.
NOTA: No inserte el catéter demasiado lejos, ya que puede hacer que la punta pinche la pared interior de la vejiga. Si se siente resistencia al avanzar el catéter, deténgase y comience de nuevo o corra el riesgo de perforar la uretra. Consulte la sección de discusión sobre consejos para aumentar el éxito del cateterismo. - Asegure el catéter y evite fugas alrededor del catéter enrollando una longitud corta de sutura de seda 3-0 alrededor del meato uretral externo y átelo firmemente. Asegure el catéter a la cola con cinta adhesiva para evitar que se saque accidentalmente.
- Una vez cateterizado, infunda suavemente la solución de Krebs en la vejiga a través del catéter suprapúbico de la vejiga y confirme que el líquido fluye fuera del catéter uretral y no alrededor de él. Si es necesario, vuelva a colocar la sutura alrededor del orificio uretral externo.
- Cierre la incisión abdominal sobre la vejiga con una sutura de seda 3-0.
5. Configuración experimental
- Asegure al animal en una tabla capaz de inclinarse para ayudar en el drenaje del líquido intravesical a través del catéter uretral. Coloque una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente entre el animal y la tabla para mantener el calor corporal y absorber el líquido que drena del catéter uretral.
- Conecte el catéter suprapúbico a una llave de paso de tres vías, que conecta el catéter a una bomba de jeringa y un transductor de presión. Conecte el transductor de presión a una computadora por medio de un amplificador y un sistema de adquisición de datos.
NOTA: Se debe tener cuidado para evitar que se formen burbujas de aire en el tubo que conecta la bomba de jeringa, el transductor y el catéter vesical. - Calibre el registro de la presión de la vejiga utilizando el procedimiento sugerido por el fabricante del transductor de presión y/o del software de adquisición de datos.
- Infundir la solución de Krebs a través del catéter suprapúbico a una velocidad de 0,1 ml/min y dejar que el líquido drene del catéter uretral durante 1 h para eliminar cualquier ATP residual liberado durante los implantes del catéter.
- Después de este período de lavado, tapa el catéter uretral con un tapón Luer-Lock y mide la presión en la vejiga. Busque un aumento lento de la presión intravesical a una presión de 30 cmH2Osin un aumento brusco de la presión, lo que indicaría una contracción de la vejiga (ver Figura 2). Retire el tapón del catéter uretral cuando la presión alcance los 30 cm deH2Opara evitar daños en la vejiga.
NOTA: Si las contracciones de la vejiga continúan ocurriendo después de 1 h, administre una dosis adicional de hexametonio (dosis de 5 mg/kg i.p.).
6. Recogida de muestras
- Infundir la vejiga a 0,1 ml/min y recoger el elueido del catéter uretral. Pruebe inmediatamente las alícuotas de 100 μL del eluido para detectar ATP (véase más adelante) o congele para la posterior cuantificación del lote.
- Para probar el efecto de la distensión vesical en las concentraciones luminales de ATP, tapa el catéter uretral con el tapón y monitorea la presión de la vejiga hasta que alcance el nivel deseado. Luego, destape el catéter uretral y recoja el eluyido para la medición o congelación de ATP, como se describió anteriormente.
- Después de cada distensión, deje que la vejiga descanse y se lave durante 10-15 minutos antes de tomar muestras adicionales. Tome un total de 3-5 muestras de predistensión y 3-5 muestras a cada presión de distensión deseada para demostrar la repetibilidad.
- Para probar el efecto de los medicamentos en la liberación de ATP, cambie la solución de Krebs que infunde la vejiga a Krebs que contiene el medicamento de elección. Perfundir a 0,1 ml/min durante 10-15 min para que el fármaco tenga un efecto, y luego recoger las muestras de vejigas no distendidas y distendidas como se describe en los pasos 6.1 y 6.2.
7. Cuantificación de ATP a partir de muestras recogidas
- Cuantificar ATP en las muestras de 100 μL recolectadas utilizando un kit de ensayo de luciferina / luciferasa disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante y un luminómetro.
- Para cuantificar el ATP, combine muestras de 100 μL de perfusión con 50 μL de la mezcla de ensayo y colóquelas en el luminómetro para su lectura. Para convertir las unidades de luz relativa (RLU) informadas por el luminómetro a una concentración de ATP, realice diluciones seriadas de ATP en solución de Krebs que van de 1 μM a 10 pM en diluciones de 10 veces para crear una curva estándar y léalas en el luminómetro. Trazar las lecturas resultantes en un gráfico y realizar una regresión no lineal (cuadrática) para extrapolar las concentraciones de las muestras tomadas del animal.
NOTA: Es importante hacer estándares de ATP para cualquier solución farmacológica probada en el experimento, ya que muchos medicamentos interfieren con la reacción luciferina / luciferasa, que debe corregirse.
- Para cuantificar el ATP, combine muestras de 100 μL de perfusión con 50 μL de la mezcla de ensayo y colóquelas en el luminómetro para su lectura. Para convertir las unidades de luz relativa (RLU) informadas por el luminómetro a una concentración de ATP, realice diluciones seriadas de ATP en solución de Krebs que van de 1 μM a 10 pM en diluciones de 10 veces para crear una curva estándar y léalas en el luminómetro. Trazar las lecturas resultantes en un gráfico y realizar una regresión no lineal (cuadrática) para extrapolar las concentraciones de las muestras tomadas del animal.
8. Eutanasia de animales
- Cuando se complete el experimento y se recojan todas las muestras, sacrificar humanamente al animal de acuerdo con las pautas del USDA y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación.
- Retire al animal anestesiado de la configuración experimental, colóquelo en una caja cerrada y gaseo con 100% deCO2. Asegúrese de que la tasa de llenado sea igual al 30% -70% del volumen de la cámara por minuto (por ejemplo, 3-7 L / min para una caja con un volumen de 10 L). Continúe el flujo deCO2 durante al menos 1 minuto después de que cese la respiración.
- Use una forma secundaria de eutanasia para asegurar la muerte.
- Realice una toracotomía como una forma secundaria de eutanasia agarrando el pequeño colgajo de piel en el extremo caudal del esternón y cortando un pequeño agujero en la piel y la musculatura en el diafragma con un par de tijeras afiladas. Complete la toracotomía insertando las tijeras en la abertura y cortando rostralmente a través de la caja torácica y exponiendo la cavidad torácica.
NOTA: El animal sacrificado debe ser eliminado de acuerdo con las directrices institucionales.
- Realice una toracotomía como una forma secundaria de eutanasia agarrando el pequeño colgajo de piel en el extremo caudal del esternón y cortando un pequeño agujero en la piel y la musculatura en el diafragma con un par de tijeras afiladas. Complete la toracotomía insertando las tijeras en la abertura y cortando rostralmente a través de la caja torácica y exponiendo la cavidad torácica.
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Representative Results
El protocolo descrito permite la medición precisa de la liberación urotelial de ATP in vivo desde el lumen de la vejiga, utilizando una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores (ver Figura 1). Esto permite al investigador examinar los efectos de los fármacos en la liberación de ATP mediada por estiramiento en un entorno fisiológico.
Figura 1: Configuración experimental. (A) Imagen que muestra la configuración experimental, con los diversos equipos etiquetados. El área del animal delineada en un rectángulo rojo se muestra en B. (B) Fotografía que muestra el abdomen de la rata después de la cirugía. Tenga en cuenta el catéter suprapúbico insertado y atado en la cúpula de la vejiga, así como el catéter uretral insertado a través del orificio externo. El catéter uretral se conecta en la foto para mostrar que la presión de la vejiga aumenta durante la perfusión a través del catéter vesical. Durante el experimento, la abertura abdominal se suturaba cerrada, pero se dejaba abierta aquí para permitir la visualización de la vejiga urinaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
De importancia primordial para la medición exitosa de la liberación de ATP mediada por estiramiento en la vejiga de roedores es garantizar que el reflejo miccional esté bloqueado, permitiendo que la vejiga se distienda más allá de la presión umbral normalmente suficiente para activar el reflejo miccional. Como se muestra en la Figura 2A, cuando el catéter uretral está tapado, la infusión de la solución en la vejiga hace que la presión intravesical aumente bruscamente a medida que la vejiga se contrae. Como estamos interesados en los efectos del estiramiento pasivo, no de la contracción, sobre la liberación urotelial de ATP, el animal es tratado con un bloqueador ganglionar, hexametonio, para prevenir el reflejo miccional. Como se evidencia en la Figura 2B, cuando se administra hexametonio, la instilación de la solución en la vejiga con el catéter uretral bloqueado da como resultado un aumento mucho más gradual de la presión intravesical, permitiendo que las presiones aumenten hasta 30 cmH2Osin contracción. Esto permite medir la liberación de ATP luminal a presiones lo suficientemente altas como para ser relevantes para la patología, como las observadas en una vejiga poco activa, obstrucción parcial de la salida de la vejiga o durante la dissinergia detrusor-esfínter después de una lesión de la médula espinal. Si bien puede requerir una dosis suplementaria de hexametonio para bloquear completamente el reflejo miccional, se debe tener cuidado de no administrar lo suficiente como para provocar una sobredosis. Esto podría conducir a una disminución significativa del gasto cardíaco y comprometer la calidad del experimento. Cabe señalar que el mismo efecto inhibitorio sobre el reflejo de la vejiga se puede obtener cortando los nervios pélvicos bilateralmente o cortando la médula espinal en el nivel L4 o superior. Esto, por supuesto, aumenta significativamente la dificultad de la configuración experimental y el tiempo requerido para completar el experimento.
Figura 2: Registros de presión de ratas. Antes (A) y después de (B) bloqueo ganglionar. Las flechas indican cuándo se tapó el catéter uretral. Observe que la presión en la traza superior aumenta rápidamente cuando la presión alcanza el umbral para inducir la micción, mientras que la presión en la traza inferior aumenta gradualmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Otra consideración muy importante para estos experimentos es asegurar la conversión adecuada de las lecturas del luminómetro (normalmente expresadas en RLU) a una concentración de ATP utilizando curvas estándar. La reacción luciferina/luciferasa es muy susceptible a los agentes interferentes13. Esta interferencia puede provenir de una interacción directa con luciferina/luciferasa. Por ejemplo, varios compuestos pueden actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de la luciferasa; un estudio sugirió que ~ 3% de los compuestos en el Repositorio de Moléculas Pequeñas de Bibliotecas Moleculares podrían inhibir la luciferasa luciérnaga a concentraciones inferiores a 11 μM14. Además, la luciferina es susceptible a agentes oxidantes, reduciendo la cantidad de sustrato disponible para la reacción productora de luminiscencia15. También es posible interferir con la reacción luciferina/luciferasa alterando la disponibilidad del cofactor de la reacción, el magnesio. Por ejemplo, una técnica común para imitar el estiramiento mecánico en experimentos de ATP in vitro es inducir la hinchazón celular al reducir la osmolaridad de la solución perfundida. Sin embargo, muchos investigadores logran esta reducción diluyendo la solución con agua, reduciendo la concentración de magnesio disponible para actuar como un cofactor en la reacción luciferina / luciferasa. Además, algunos medicamentos se venden como sales de magnesio, lo que puede aumentar en gran medida la cantidad de magnesio en la solución, lo que también conduce a diferencias medibles en las lecturas de luminiscencia. Finalmente, es posible que una solución farmacológica interfiera con la capacidad de medir con precisión la luz producida por la reacción luciferina / luciferasa. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, también conocido como erioglaucina o FD&C Blue dye #1) es un inhibidor específico de la liberación de ATP16 mediada por pannexina. En dosis efectivas, la solución Brilliant Blue FCF tiene un tono azul distintivo, que absorbe la luz en un pico de alrededor de 600 nm17. Esto está dentro del rango de longitudes de onda de la luz que es emitida por luciferasa luciérnaga; por lo tanto, la emisión de luz en experimentos con BB-FCF se reduce considerablemente. Por lo tanto, es imperativo que las curvas estándar que utilizan cantidades conocidas de ATP disuelto en soluciones que contienen cada fármaco experimental se utilicen para cuantificar la liberación de ATP durante el experimento. Como se muestra en la Figura 3, BB-FCF (100 μM) disminuye significativamente la pendiente de la curva estándar, lo que es suficiente para alterar significativamente los valores calculados para la concentración de ATP en la muestra. Como se muestra en la parte inferior de la Figura 3, el uso del estándar de Krebs para calcular la concentración de ATP en una muestra que contiene BB-FCF puede resultar en una subestimación de la concentración de ATP en ~ 50%. En algunos casos, el uso de la curva estándar incorrecta podría oscurecer un cambio mediado por fármacos en la liberación de ATP, o hacer que parezca erróneamente como si se hubiera producido un cambio. En el experimento representado en la Figura 3, por ejemplo, el uso del estándar Krebs para todas las muestras habría hecho parecer que Brilliant Blue FCF redujo la liberación de ATP en ~ 67% (16.6 a 5.5 nM) cuando, en realidad, solo había disminuido ~ 42% (16.6 a 9.6 nM).
Figura 3: Efectos de los fármacos experimentales en la curva estándar de ATP. Tenga en cuenta que el antagonista del canal de pannexina, Brilliant Blue, altera significativamente las RLU medidas para cualquier concentración dada de ATP, lo que resultaría en una subestimación del ATP medido, si no corregido. Abreviatura: RLUs = Unidades de luz relativa; BB-FCF = FCF azul brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Otra consideración a tener en cuenta es que el ATP se libera comúnmente de los tejidos como resultado del daño, y que estos procedimientos quirúrgicos y la inserción del catéter uretral darán como resultado lecturas de ATP anormalmente altas si se toman demasiado pronto después de la configuración. Este procedimiento describe un período de lavado de 1 hora después de configurar el experimento, que no debe omitirse. Hemos encontrado que después de 1 h, las concentraciones de ATP medidas en muestras tomadas cuando la vejiga no está distendida son relativamente bajas (~ 10-30 nM), mientras que las muestras tomadas antes del período de lavado pueden leer un orden de magnitud mayor. También se deben realizar lavados cortos de 5 minutos entre distensiones, ya que los niveles de ATP pueden permanecer elevados durante un período corto. Una buena regla general sería medir ATP en múltiples muestras al comienzo del experimento y después de cada distensión y solo proceder cuando las lecturas de ATP se nivelan. En la Figura 4, mostramos una representación de un experimento típico con mediciones tomadas en varios puntos de tiempo. Tenga en cuenta las altas lecturas tomadas antes del lavado (muestras # 1 y # 5) frente a las tomadas después del lavado (muestras # 2 y # 6).
Figura 4: Representación de un experimento típico. Una representación estilizada de un registro de presión típico. Cada número representa un punto de tiempo cuando se tomó una muestra y se midió para ATP: 1) inmediatamente después de que se complete la configuración, antes del período de lavado, 2) después de un período de lavado de 1 h, 3) inmediatamente anterior a una distensión, 4) durante la distensión, 5) inmediatamente después de una distensión y 6) después de un corto período de lavado después de la distensión. La tabla de recuadro muestra valores representativos de RLU y concentraciones de ATP para cada muestra. Abreviatura: RLUs = Relative Light Units. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 5 muestra gráficos representativos de resultados experimentales que examinan el mecanismo de liberación de ATP del urotelio. Como se muestra en la Figura 5A, el aumento de la presión provoca un aumento significativo de la concentración de ATP en la luz de la vejiga, con presiones de 30 cm de agua que aumentan las concentraciones de casi 2,5 veces de los controles no distendidos. La perfusión intravesical de 2 U/mL de apirasa, una enzima que cataliza la hidrólisis de ATP, disminuye significativamente la concentración medida de ATP en la luz de la vejiga. Por el contrario, la perfusión intravesical de ARL67156, un inhibidor de las NTPDasas presentes en el urotelio, aumenta significativamente las concentraciones luminales de ATP. La Figura 5B muestra los experimentos sobre el mecanismo de liberación de ATP inducida por estiramiento del urotelio. La perfusión con los antagonistas del canal de pannexina Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) o carbenoxolona (CBX, 100 μM) reduce significativamente la liberación de ATP en la luz de la vejiga a todas las presiones. Las concentraciones luminales de ATP no disminuyen cuando se perfunde el bloqueador de conexina ácido 18α-glicirretínico, lo que indica que la liberación de ATP evocada por distensión está mediada por canales de pannexina y no por canales de conexina.
Figura 5: Mediciones representativas de la liberación de ATP evocada por distensión en la luz de la vejiga urinaria. (A) La distensión de la vejiga aumenta las concentraciones luminales de ATP, que pueden disminuir en presencia de la NTPDasa apirasa (2 U/ml) o aumentar cuando las NTPDasas endógenas se inhiben con ARL67156 (10 μM). (B) La liberación de ATP evocada por distensión es bloqueada por los antagonistas del canal de la anexina Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) y carbenoxolona (CBX, 100 μM), pero no por el antagonista del canal de conexina ácido 18α-glicirretínico (18α-GA, 50 μM). Los datos se presentan como la media con barras de error estándar. ** p < 0.05 entre las dos barras indicadas por la línea, ## p < 0.05 en comparación con los controles de Krebs a la misma distensión. Esta figura se reproduce con permiso de Beckel et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La mayor parte de la investigación sobre la liberación urotelial de ATP se lleva a cabo en células cultivadas, utilizando líneas celulares inmortalizadas o cultivos primarios de células uroteliales de roedores. Si bien estos modelos tienen la ventaja de tener un rendimiento relativamente alto (es decir, un cultivo / pasaje puede hacer muchas placas / platos de células), su relevancia fisiológica disminuye debido a: 1) la incapacidad de las células uroteliales para crecer polarizadas a menos que se cultiven en soportes especiales y 2) la dificultad de exponer las células cultivadas a niveles fisiológicos de estiramiento / presión. Una forma de lidiar con estas limitaciones es quitando la vejiga de un roedor, abriéndola y colocándola en una cámara de Ussing, insertando el tejido de la vejiga entre dos medias cámaras llenas de solución fisiológica. Esto permite al investigador someter el urotelio, en su estado polarizado nativo, a la distensión agregando volumen al lado urotelial de la cámara, causando el estiramiento del tejido de la vejiga en la cámara. Sin embargo, es difícil relacionar este tramo con la distensión observada por el urotelio in vivo. Además, el ATP evocado por distensión en la cámara de Ussing se libera en el gran volumen de fluido fisiológico contenido en la cámara, diluyendo la concentración de ATP varias veces. Usando este procedimiento, la presión de la vejiga se mide directamente, de modo que la distensión se puede mantener en un rango relevante para la fisiología o fisiopatología. Además, dado que estamos midiendo la concentración de ATP directamente del fluido luminal y no de una cantidad arbitraria y excesiva de fluido utilizado para mantener el tejido in vitro, la concentración medida no tiene que ser corregida. Por lo tanto, el procedimiento descrito en este documento permite al investigador examinar la liberación de ATP en la luz de la vejiga en condiciones que se asemejan mucho más a las condiciones fisiológicas o fisiopatológicas de la vejiga.
La técnica descrita es muy similar a las técnicas de cistometría estándar utilizadas para estudiar los efectos de los fármacos sobre la actividad de la vejiga refleja y debe ser llevada a cabo fácilmente por cualquier persona que realice rutinariamente esos experimentos. Sin embargo, para aquellos investigadores nuevos en el cateterismo de vejiga, hay algunas advertencias a tener en cuenta. En primer lugar, el cateterismo transuretral puede ser difícil para los inexpertos debido a la curvatura de la uretra de roedores. Esto también puede hacerse más difícil por la rigidez del esfínter uretral externo, incluso bajo anestesia con uretano. Es imperativo que el investigador no intente forzar el catéter en la uretra, ya que lo más probable es que cause un aumento de la inflamación y la hinchazón, lo que a su vez hará que la uretra sea aún más difícil de cateterizar con éxito. Además, es posible empujar el catéter a través de la pared de la uretra, arruinando todo el experimento.
Hemos desarrollado algunos consejos y trucos para aumentar la tasa de éxito. Por ejemplo, a veces es necesario administrar al animal otra dosis corta de isoflurano inhalado (0,5%-1,0%) para relajar el esfínter uretral. Esto debe realizarse con moderación y cuidado, ya que la combinación de uretano e isoflurano puede provocar depresión respiratoria. Otro truco es sumergir la punta del catéter en una solución de lidocaína al 2% antes de insertarla en el orificio uretral externo; Esto a menudo hará que el esfínter se relaje después de unos minutos. Vaciar la vejiga presionando suavemente el abdomen del animal también puede ayudar a relajar el esfínter uretral. Finalmente, puede ser necesario usar un catéter de menor calibre; a veces usamos un catéter de 24 G, especialmente con animales más pequeños. Sin embargo, tenga en cuenta que puede ser necesario reducir la velocidad de infusión en la vejiga cuando se usa un catéter transuretral de calibre más pequeño, para que coincida con el drenaje más lento del catéter uretral. De lo contrario, la presión de la vejiga aumentaría, a pesar de que el catéter uretral no estuviera tapado.
Cabe señalar que el uretano se utiliza como anestésico en este protocolo. El uretano se usa comúnmente en laboratorios que estudian el tracto urinario inferior, ya que preserva el reflejo miccional, mientras que otros anestésicos no lo hacen. Debido a esto, la distensión de la vejiga por encima de una presión de ~ 7-10 cm H2O bajo anestesia con uretano desencadenará un reflejo miccional. Dado que estamos interesados en la liberación de ATP en respuesta a la distensión pasiva, este protocolo requiere el bloqueo de las contracciones de la vejiga utilizando el bloqueador ganglionar hexametonio. Esto permite la medición de la liberación de ATP en respuesta a las presiones intravesicales más altas (es decir, 30 cm H2O) comúnmente observadas en la patología de la vejiga que implica obstrucción de la salida. Por lo tanto, el uso de un uretano/hexametonio permite medir la liberación luminal de ATP evocada por distensión durante largos períodos de tiempo (la duración de la acción de ambos fármacos se mide en horas). Sin embargo, algunos laboratorios pueden preferir usar un anestésico que no ahorre el reflejo miccional, como la ketamina, y elimine la necesidad de un bloqueador ganglionar. Esto también funcionará bien para este procedimiento, aunque requerirá una administración más frecuente (o continua) debido a la menor duración de la acción del anestésico.
Una diferencia notable entre esta técnica para medir ATP y la configuración de cistometría común con la que los investigadores de urología pueden estar familiarizados es el uso de la solución tamponada de Krebs como perfusión en lugar de la solución salina isotónica estándar. El ATP es una molécula bastante lábil y se estabiliza un poco en una solución tamponada. Además, la composición de la solución de Krebs es mucho más cercana a la de la orina que a la solución salina, lo que agrega relevancia clínica a estos experimentos. Esta es una consideración importante, ya que se ha demostrado que el control de la liberación urotelial de ATP está modulado por canales permeables al calcio, y la falta de calcio en la solución salina normal puede influir negativamente en la liberación de ATP. La inestabilidad del ATP en solución es también la razón por la que sugerimos que las muestras se cuantifiquen inmediatamente utilizando la reacción luciferina-luciferasa. Sin embargo, si el investigador no puede leer las muestras inmediatamente, las muestras deben congelarse lo más rápido posible para limitar la degradación del ATP.
Una limitación de esta técnica es que solo mide la liberación luminal de ATP y no puede medir la liberación de ATP desde el lado serosal del urotelio. Se cree que el ATP se libera desde el lado seroso para influir directamente en la excitabilidad aferente; Sin embargo, la medición directa de esta versión es difícil. En este caso, el uso de células cultivadas en soportes de membrana permeables como placas Transwell o la extirpación quirúrgica del urotelio para experimentos de cámara de Ussing es la técnica preferida. Sin embargo, dada la aparente importancia del ATP luminal en la patología vesical, este modelo experimental es una herramienta útil para dilucidar los mecanismos celulares que controlan la liberación urotelial de ATP durante la patología.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) a JMB (DK117884).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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