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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

संभावित रेडियोसेंसिटाइज़र या रक्षक ों का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में ज़ेबराफिश लार्वा

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64233
Automatic Translation
*1,3, *1,3, 1,4, 2,3, 2, 1
1Tumor microenvironment and animal models lab, Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab, Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

जेब्राफिश को हाल ही में संभावित विकिरण संशोधक को मान्य करने के लिए एक मॉडल के रूप में शोषण किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल विकिरण-आधारित स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए ज़ेबराफ़िश भ्रूण का उपयोग करने के लिए विस्तृत चरणों और विभिन्न उपचारों और विकिरण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए कुछ अवलोकन संबंधी दृष्टिकोणों का वर्णन करता है।

Abstract

ज़ेबराफ़िश का बड़े पैमाने पर कई प्रकार के अनुसंधान में उपयोग किया जाता है क्योंकि वे आसानी से बनाए रखे गए कशेरुक मॉडल में से एक हैं और एक अद्वितीय और सुविधाजनक मॉडल प्रणाली की कई विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। चूंकि अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं, जेब्राफिश भ्रूण विकिरण अनुसंधान में विवो मॉडल में एक फ्रंट-लाइन हैं। इसके अलावा, यह मॉडल प्रमुख जैविक घटनाओं और संबंधित प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ थोड़े समय के भीतर विकिरण और विभिन्न दवाओं के प्रभाव को प्रोजेक्ट करता है। कई कैंसर अध्ययनों ने ज़ेबराफ़िश का उपयोग किया है, और यह प्रोटोकॉल रेडियोथेरेपी और कैंसर के संदर्भ में विकिरण संशोधक के उपयोग पर आधारित है। इस विधि का उपयोग विकिरणित और नियंत्रण (गैर-विकिरणित) भ्रूण पर विभिन्न दवाओं के प्रभावों को मान्य करने के लिए आसानी से किया जा सकता है, इस प्रकार दवाओं को रेडियो संवेदीकरण या सुरक्षात्मक दवाओं के रूप में पहचाना जा सकता है। यद्यपि इस पद्धति का उपयोग अधिकांश दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों में किया जाता है, एक्स-रे विकिरण जोखिम की पृष्ठभूमि के साथ प्रयोग और विषाक्तता मूल्यांकन का विवरण सीमित या केवल संक्षेप में संबोधित किया जाता है, जिससे प्रदर्शन करना मुश्किल हो जाता है। यह प्रोटोकॉल इस मुद्दे को संबोधित करता है और एक विस्तृत चित्रण के साथ प्रक्रिया और विषाक्तता मूल्यांकन पर चर्चा करता है। प्रक्रिया बहुत विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता के साथ विकिरण अध्ययन और विकिरण-आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का वर्णन करती है।

Introduction

ज़ेबराफ़िश (डेनियो रेरियो) एक प्रसिद्ध पशु मॉडल है जिसका व्यापक रूप से पिछले 3 दशकों में अनुसंधान में उपयोग किया गया है। यह एक छोटी मीठे पानी की मछली है जिसे प्रयोगशाला की स्थितियों में पालना और प्रजनन करना आसान है। जेब्राफिश का व्यापक रूप से विभिन्न विकासात्मक और विष विज्ञान अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया है 1,2,3,4,5,6,7,8। ज़ेबराफ़िश में उच्च प्रजनन क्षमता और छोटी भ्रूण पीढ़ी होती है; भ्रूण विभिन्न विकास चरणों को ट्रैक करने के लिए उपयुक्त हैं, नेत्रहीन पारदर्शी हैं, और आनुवंशिक हेरफेर और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म 9,10,11,12,13,14 की किस्मों के लिए उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, जेब्राफिश टोटो और लाइव इमेजिंग प्रदान करता है जिसके लिए इसकी विकास प्रक्रिया और विभिन्न विषाक्त पदार्थों या कारकों की उपस्थिति में विभिन्न विकृतियों का स्टीरियो या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 7,15,16 का उपयोग करके आसानी से अध्ययन किया जा सकता है।

रेडियोथेरेपी कैंसर 17,18,19,20,21,22,23,24 के इलाज में उपयोग किए जाने वाले प्रमुख चिकित्सीय तरीकों में से एक है। हालांकि, कैंसर रेडियोथेरेपी संभावित रेडियोप्रोटेक्टर्स की मांग करती है ताकि घातक कोशिकाओं को मारते समय सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं को मरने से बचाया जा सके या उच्च ऊर्जा विकिरण 25,26,27,28,29 से जुड़े चिकित्सा के दौरान मानव स्वास्थ्य की रक्षा की जा सके। इसके विपरीत, घातक कोशिकाओं को मारने के लिए विकिरण की दक्षता बढ़ाने के लिए शक्तिशाली रेडियोसेंसिटाइज़र की भी जांच की जा रही है, विशेष रूप से लक्षित और सटीक उपचार30,31,32,33 में। इसलिए, शक्तिशाली रेडियोप्रोटेक्टर्स और सेंसिटाइज़र को मान्य करने के लिए, अर्ध-उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त एक मॉडल और विकिरण प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए अत्यधिक मांग की जाती है। विकिरण अध्ययन में कई उपलब्ध मॉडल का उपयोग किया जाता है और दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों में शामिल किया जाता है। हालांकि, उच्च कशेरुक और यहां तक कि विवो मॉडल, चूहों में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले, बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए अनुपयुक्त हैं क्योंकि इन मॉडलों के साथ इस तरह के स्क्रीनिंग प्रयोगों को डिजाइन करना समय लेने वाला, महंगा और चुनौतीपूर्ण है। इसी तरह, सेल कल्चर मॉडल उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों34,35 की किस्मों के लिए आदर्श हैं। हालांकि, सेल संस्कृति से जुड़े प्रयोग हमेशा व्यावहारिक, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य या विश्वसनीय नहीं होते हैं क्योंकि संस्कृति में कोशिकाएं विकास की स्थिति और कैनेटीक्स के अनुसार अपने व्यवहार को स्पष्ट रूप से बदल सकती हैं। इसके अलावा, सेल प्रकारों की किस्में अंतर विकिरण संवेदीकरण दिखाती हैं। विशेष रूप से, 2 डी और 3 डी सेल कल्चर सिस्टम पूरे जीव परिदृश्य का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, और, इस प्रकार, प्राप्त परिणाम रेडियोटॉक्सिसिटी36,37 के वास्तविक स्तर को पुन: उत्पन्न नहीं कर सकते हैं। इस संबंध में, ज़ेबराफ़िश उपन्यास रेडियोसेंसिटाइज़र और रेडियोप्रोटेक्टर्स के लिए स्क्रीनिंग में कई फायदे प्रदान करता है। हैंडलिंग में आसानी, बड़े क्लच आकार, छोटे जीवन काल, तेजी से भ्रूण का विकास, भ्रूण पारदर्शिता और छोटे शरीर का आकार ज़ेबराफ़िश को बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाता है। उपरोक्त लाभों के कारण, प्रयोगों को थोड़े समय में आसानी से दोहराया जा सकता है, और प्रभाव को मल्टी-वेल प्लेटों में विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से देखा जा सकता है। इसलिए, जेब्राफिश विकिरण अध्ययन38,39 से जुड़े दवा स्क्रीनिंग अनुसंधान में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है।

विकिरण संशोधक को स्क्रीन करने के लिए एक बोनाफाइड मॉडल के रूप में जेब्राफिश की क्षमता विभिन्न अध्ययनों 40,41,42,43,44,45 में प्रदर्शित की गई है। संभावित रेडियो संशोधक, जैसे नैनोपार्टिकल डीएफ 1, एमिफोस्टाइन (डब्ल्यूआर -2721), डीएनए मरम्मत प्रोटीन केयू 80 और एटीएम, और प्रत्यारोपित हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के रेडियोप्रोटेक्टिव प्रभाव, और जेब्राफिश मॉडल में फ्लेवोपिरिडोल और एजी 1478 जैसे रेडियोसेंसिटाइज़र के प्रभाव 19,41,42,43,44,45,46 बताए गए हैं।. उसी प्रणाली का उपयोग करते हुए, डीएफ -1 (फुलरीन नैनोपार्टिकल) के रेडियोप्रोटेक्टिव प्रभाव का मूल्यांकन प्रणालीगत और अंग-विशिष्ट दोनों स्तरों पर किया गया था, और रेडियोप्रोटेक्टर स्क्रीनिंग के लिए जेब्राफिश भ्रूण के उपयोग का भी पता लगाया गयाथा। हाल ही में, केलुलुट शहद को ज़ेबराफिश भ्रूण में एक रेडियोप्रोटेक्टर के रूप में रिपोर्ट किया गया था और भ्रूण के अस्तित्व को बढ़ाने और अंग-विशिष्ट क्षति, सेलुलर डीएनए क्षति और एपोप्टोसिस48 को रोकने के लिए पाया गया था।

इसी तरह, हंट्ज़श की प्रतिक्रिया के माध्यम से उत्पन्न पॉलिमर के रेडियोप्रोटेक्टिव प्रभावों को एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग में ज़ेबराफिश भ्रूण पर जांचा गया था, और सुरक्षा मुख्य रूप सेडीएनए क्षति से कोशिकाओं की रक्षा करके प्रदान की गई थी। पिछले अध्ययनों में से एक में, लिपोफिलिक स्टेटिन फ्लुवास्टेटिन को इस दृष्टिकोण50 के साथ ज़ेबराफिश मॉडल का उपयोग करके एक संभावित रेडियोसेंसिटाइज़र के रूप में पाया गया था। इसी तरह, सोने के नैनोकणों को एक आदर्श रेडियोसेंसिटाइज़र माना जाता है और इसका उपयोग कई अध्ययनों में किया गया है।

ज़ेबराफ़िश में भ्रूण के विकास में प्रारंभिक 3 घंटे में दरार शामिल होती है जिसमें एक एकल-कोशिका वाला युग्मनज 2 कोशिकाओं, 4 कोशिकाओं, 8 कोशिकाओं, 16 कोशिकाओं, 32 कोशिकाओं और 64 कोशिकाओं को बनाने के लिए विभाजित होता है जो आसानी से स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ पहचाने जाते हैं। फिर, यह 128 कोशिकाओं (2.25 घंटे पोस्ट-फर्टिलाइजेशन, एचपीएफ) के साथ ब्लास्टुला चरण प्राप्त करता है, जहां कोशिकाएं हर 15 मिनट में दोगुनी हो जाती हैं और इन निम्नलिखित चरणों से गुजरती हैं: 256 कोशिकाएं (2.5 एचपीएफ), 512 कोशिकाएं (2.75 एचपीएफ), और केवल 3 घंटे में 1,000+ कोशिकाओं तक पहुंचती हैं (चित्रा 1)। 4 घंटे में, अंडा गोले के चरण को प्राप्त करता है, इसके बाद भ्रूण द्रव्यमान 7,53,54 में गुंबद के आकार का निर्माण होता है। जेब्राफिश में गैस्ट्रुलेशन 5.25 एचपीएफ54 से शुरू होता है, जहां यह ढाल चरण तक पहुंचता है। ढाल स्पष्ट रूप से जर्म रिंग (चित्रा 1) के एक तरफ कोशिकाओं के तेजी से अभिसरण आंदोलन को इंगित करती है और गैस्ट्रुलटिंग भ्रूण का एक प्रमुख और विशिष्ट चरण है जिसे आसानी से53,54 पहचाना जा सकता है। यद्यपि भ्रूण के विकिरण जोखिम को उनके विकास के किसी भी चरण में किया जा सकता है, गैस्ट्रुलेशन के दौरान विकिरण जोखिम में अधिक विशिष्ट रूपात्मक परिवर्तन हो सकते हैं जो विकिरण-प्रेरित विषाक्तता के बेहतर रीडआउट की सुविधा प्रदानकरते हैं। इसी तरह, भ्रूण के लिए दवाओं का प्रशासन 2 एचपीएफ54 के रूप में शुरू किया जा सकता है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन संस्थागत पशु नैतिक समिति, जीवन विज्ञान संस्थान, भुवनेश्वर के दिशानिर्देशों से पूर्व अनुमोदन और पालन के साथ आयोजित किया गया था। सभी ज़ेबराफ़िश रखरखाव और प्रजनन 28.5 डिग्री सेल्सियस पर एक परिवेश मछली संस्कृति सुविधा में आयोजित किए गए थे, और भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर जैविक ऑक्सीजन मांग (बीओडी) इनक्यूबेटर में बनाए रखा गया था। यहां, ज़ेबराफ़िश एबी स्ट्रेन का उपयोग किया गया था, और किमेल एट अल .54 के अनुसार मंचन किया गया था। एक्स-रे विकिरण 6 एचपीएफ (शील्ड चरण) पर दिया गया था, और 120 एचपीएफ तक विभिन्न फेनोटाइप देखे गए थे।

1. प्रजनन सेटअप और भ्रूण संग्रह

  1. प्रजनन टैंक सेट करें (पॉली कार्बोनेट से बना, क्षमता 1 एल, सामग्री की तालिका देखें)। प्रजनन टैंक में सिस्टम पानी (पीएच, 6.8-7.5; चालकता, 500 μS; और तापमान, 28.5 डिग्री सेल्सियस) डालें जो इसकी मात्रा का लगभग 40% कवर करते हैं। टैंक में डिवाइडर को दो कक्ष बनाने के लिए रखें, एक महिलाओं के लिए और दूसरा पुरुषों के लिए।
  2. मूल टैंकों से, जाल की मदद से दो स्वस्थ महिलाओं और एक स्वस्थ पुरुष को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें, उन्हें अपने संबंधित हिस्सों में रखें, और उन्हें 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (न्यूनतम 10 घंटे) अंधेरे में रखें।
  3. अगली सुबह, डिवाइडर को हटा दें और प्रजनन टैंक को परेशान किए बिना मछलियों को संभोग करने की अनुमति दें।
    नोट: मादाएं प्रजनन शुरू कर देंगी, और मछलियों को56,57,58 संभोग करने की अनुमति देने के बाद 10-15 मिनट के भीतर अंडे टैंक के तल पर पड़े हुए दिखाई देंगे।
  4. प्रजनन के बाद मछलियों को उनके टैंक ों में वापस करें, एक छन्नी का उपयोग करके प्रजनन टैंक से भ्रूण एकत्र करें, उन्हें सिस्टम के पानी से ठीक से धोएं, और एकत्र किए गए अंडे को ई -3 मीडिया के साथ एक पेट्री प्लेट में रखें (4.94 एमएम एनएसीएल, 0.17 एमएम केसीएल, 0.43 एमएम सीएसीएल 2, 0.85 एमएम एमजीसीएल2 लवण, 1% डब्ल्यू / सामग्री की तालिका देखें)।
  5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत अंडे का निरीक्षण करें, पाश्चर पिपेट का उपयोग करके अनिषेचित या मृत भ्रूण को हटा दें, और ई -3 माध्यम में निषेचित अंडे वाले पेट्री प्लेटों को उनके उचित विकास और रखरखाव के लिए इनक्यूबेटर में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: अनफर्टिलाइज्ड अंडे को दूधिया सफेद उपस्थिति के साथ पहचाना जा सकता है, जिसमें एक कोगुलेटेड कोरियन या कोरियन के अंदर टूटी हुई कोशिकाएं होती हैं। अनफर्टिलाइज्ड अंडे के साथ, क्लीवेज से नहीं गुजरने वाले अंडे और दरार के दौरान अनियमितताजैसी विकृतियों वाले अंडे, जैसे, विषमता, पुटिका गठन, या कोरियन की चोटें, या सक्रिय रूप से विकसित नहीं हो रही हैं, एकत्र किए गए भ्रूण को स्वस्थ रखने और मीडियाको साफ रखने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए।

2. विकिरण प्रयोगों के लिए भ्रूण और चयन की निगरानी

  1. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बढ़ते भ्रूण की निगरानी करें, उचित चरण 7,54 की पहचान करें, और किसी भी मृत या अस्वास्थ्यकर भ्रूण को हटा दें। पर्याप्त भ्रूण स्टेजिंग सुनिश्चित करें क्योंकि विकिरण और दवा की खुराक एक विशेष गैस्ट्रुलेशन चरण में दी जाएगी।
    नोट: हर दिन, संस्कृति व्यंजनों में मीडिया के स्तर और गुणवत्ता की जांच करें। मृत भ्रूण को हटाने के साथ-साथ हर 24 घंटे में मीडिया बदलें। पाश्चर पिपेट का उपयोग भ्रूण चुनने या मीडिया बदलने के लिए किया जाता है।
  2. प्रयोग शुरू करने से पहले, पाश्चर पिपेट की मदद से प्रयोगात्मक प्लेटों में स्वस्थ भ्रूण को सावधानीपूर्वक वितरित करें। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए, 15-20 भ्रूण लें।
    नोट: प्रयोगात्मक प्लेट में वांछित विकास चरणों के केवल स्वस्थ भ्रूण रखें। मान लीजिए कि दवा उपचार 6 एचपीएफ पर भ्रूण के साथ किया जाना है, तो उन्हें कम से कम 30-60 मिनट पहले प्रयोगात्मक प्लेटों में बोना शुरू करें।

3. दवा उपचार

  1. जेब्राफिश भ्रूण में वांछित एकाग्रता की दवाएं जोड़ें। दवा युक्त ई -3 मीडिया को पहले से अच्छी तरह से तैयार करें। सुनिश्चित करें कि जेब्राफिश भ्रूण के इलाज के लिए काम करने वाले मीडिया को तैयार करने से पहले दवा के स्टॉक समाधान में कोई अघुलनशील दवा नहीं है।
  2. विकिरण स्क्रीनिंग के लिए किसी भी दवा को माध्यम में जोड़ने से पहले, दवा की सांद्रता के ग्रेड के साथ दवा के साइटोटोक्सिक प्रभाव की जांच करें। मूल्यांकन के तहत दवाओं के एलसी 50 का मूल्यांकन करने के लिए ओईसीडी दिशानिर्देशों का पालन करें 59,60,61।
    नोट: विकिरण या अवलोकन समय के दौरान प्लेटों और व्यंजनों को स्थानांतरित करते समय सावधान रहें। इस बात की कई संभावनाएं हैं कि इस हैंडलिंग के दौरान प्लेटें परेशान हो जाएंगी, जिससे मीडिया कुओं से बाहर निकल जाएगा या भ्रूण अपने संबंधित कुओं से बाहर निकल जाएगा, संभावित रूप से आस-पास के कुओं को दूषित कर देगा और प्रयोग को बर्बाद कर देगा।

4. एक्स-रे विकिरण

  1. विकिरण प्रयोग स्थापित करते समय, एक नियंत्रण / गैर-विकिरणित और एक विकिरण-केवल समूह शामिल करें। इसी तरह, दवा स्क्रीनिंग करते समय, एक और समूह शामिल करें जहां दवाओं को विकिरण के साथ स्क्रीनिंग प्रयोग में प्रशासित दवाओं के समान एकाग्रता के साथ दिया जाएगा।
    नोट: अच्छी तरह से प्लेटों या संस्कृति व्यंजनों के ढक्कन और आधार दोनों को लेबल करें ताकि ढक्कन गलत न हों।
  2. भ्रूण को एक अच्छी प्लेट में वितरित करें यदि विकिरण ढाल विकिरण से अतिरिक्त कुओं को कवर और रक्षा कर सकते हैं जबकि अन्य कुएं एक विशेष विकिरण खुराक के संपर्क में हैं; अन्यथा, प्रति विकिरण खुराक भ्रूण को बीज देने के लिए अलग-अलग प्लेटों या डिस्क का उपयोग करें।
  3. एक्स-रे इरेडिएटर मशीन चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें), और मशीन प्रारंभ और वार्म-अप शुरू करें।
    नोट: स्रोत से विषय दूरी (एसएसडी) मान 50 सेमी होना चाहिए; कोई फिर से विभिन्न एसएसडी का उपयोग कर सकता है, जिसके लिए मानकीकरण की आवश्यकता होती है।
  4. प्रयोगात्मक प्लेट को केंद्र में मशीन के अंदर इरेडिएटर के नीचे रखें, यह सुनिश्चित करें कि प्लेट सीधे एक्स-रे स्रोत के नीचे है, और फिर खुराक (जैसे, 5 जीवाई) सेट करें और एक्स-रे शुरू करें।
    नोट: इनक्यूबेटर से इरेडिएटर और वापस प्लेटों के परिवहन के दौरान किसी भी अवांछित फैलाव या संदूषण से बचने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें।
  5. विकिरण के पूरा होने के बाद, प्लेटों को बाहर निकालें, मशीन प्रोग्राम को बंद करें, मशीन को बंद करें, और विकिरण के तुरंत बाद माइक्रोस्कोप के तहत प्लेटों की जांच करें। मृत भ्रूण को हटा दें और प्लेटों को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस कर दें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन करने के बाद मृत भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें।
    नोट: अलग-अलग समूहों के बीच बहुत देरी के बिना निर्दिष्ट विकिरण खुराक के साथ भ्रूण के विभिन्न समूहों को विकिरणित करें क्योंकि विकास के चरण में अंतर से विकिरण का प्रभाव काफी प्रभावित हो सकता है।
    सावधानी: एक्स-रे मशीन का संचालन करते समय, उचित सुरक्षात्मक उपाय करें।

5. डेटा संग्रह, इमेजिंग और विश्लेषण

  1. पूर्व निर्धारित समय अंतराल पर डेटा एकत्र करें, जैसे कि विकिरण दिए जाने के बाद हर 24 घंटे। सभी संभावित अवलोकनों को रिकॉर्ड करें जैसे कि जीवित रहना, हैचिंग दक्षता, विकास का चरण, दिल की धड़कन की गिनती, शरीर और पूंछ वक्रता, पेरिकार्डियल एडिमा, जर्दी थैली का विस्तार, माइक्रोसेफली, तैरने वाले मूत्राशय का विकास, सामान्य गतिशीलता या गतिविधि, आदि 62,63,64।
  2. छवियों को कैप्चर करने के लिए, एक साफ स्लाइड पर प्रतिनिधि भ्रूण चुनें, माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करें, उन्हें एक विशेष दिशा में उन्मुख करें, और छवियों पर क्लिक करें। समूह और समय के अनुसार छवि फ़ाइलों का नाम बदलें।
    नोट: अलग-अलग समय अंतराल पर चित्रों को कैप्चर करते समय एक ही आवर्धन और रोशनी का उपयोग किया जाना चाहिए।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का समग्र लेआउट चित्रा 2 में दर्शाया गया है। खुराक-निर्भर तरीके से विकिरण और लक्षण वर्णन के प्रभाव का मूल्यांकन निम्नलिखित विश्लेषणों के साथ किया गया था।

एक्स-रे-प्रेरित विषाक्तता का आकलन
एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, दवा उपचार और / या विकिरण के बाद निम्नलिखित असामान्यताओं का मूल्यांकन और विशेषता की गई थी। ओईसीडी दिशानिर्देशों61 के अनुसार, मछलियों में विषाक्तता मूल्यांकन के लिए, भ्रूण के जमावट, सोमाइट गठन में विकृति, जर्दी थैली से पूंछ की गैर-अलगाव, और दिल की धड़कन में कमी या अनुपस्थिति सहित चार प्रमुख एपिकल समापन बिंदुओं को समग्र विषाक्तताका विश्लेषण करने के लिए शामिल किया गया था। उपरोक्त असामान्यताओं में से किसी में सकारात्मक परिणाम के आधार पर तीव्र विषाक्तता निर्धारित की गई थी। इन चार प्रमुख समापन बिंदुओं के अलावा, रीढ़ या पूंछ झुकने, सिर की विकृति और माइक्रोसेफली, विकास में दोष, पेरिकार्डियल एडिमा, जर्दी थैली विकृति, तैरने वाले मूत्राशय की विकृति, और आंखों की संरचना में परिवर्तन के लिए रूपात्मक अवलोकन भी किया गया था (चित्रा 3 सी और चित्रा 4)। रेडियोटॉक्सिसिटी के लिए स्कोरिंग जीवित रहने के प्रतिशत और / या विभिन्न रूपात्मक असामान्यताओं के स्कोरिंग पर आधारित हो सकती है।

उत्तरजीविता प्रतिशत और उत्तरजीविता वक्र
जीवित रहने के प्रतिशत की गणना कुल जीवित भ्रूण को शुरू में एक समूह में लिए गए भ्रूण की कुल संख्या से विभाजित करके और परिणाम को 100 38,50,65 से गुणा करके की गई थी। फिर, उत्तरजीविता वक्र प्राप्त करने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं और विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के अनुरूप मूल्यों को प्लॉट किया गया था। यह अध्ययन 6 एचपीएफ (चित्रा 3 ए) पर विकिरणित भ्रूण के लिए उत्तरजीविता वक्र प्रदान करता है।

विकिरण-प्रेरित विषाक्तता से जुड़ी प्रमुख असामान्यताएं (चित्रा 3 और चित्रा 4)।
शरीर की वक्रता और पूंछ झुकना।
यह जेब्राफिश भ्रूण50,65,66 में किसी भी विषाक्तता-प्रेरित विकृति का आकलन करने के लिए सबसे आम मापदंडों में से एक है। शरीर की वक्रता विकृति को निम्न, से मध्यम से लेकर गंभीर तक के विभिन्न पैटर्न ों में देखा जा सकता है, पोस्ट-हेपेटिक पूंछ क्षेत्र में या मुख्य शरीर की धुरी में झुकने के साथ या यहां तक कि पूरी तरह से अर्धवृत्ताकार रीढ़ या शरीर की धुरी और पूंछ में एक से अधिक झुकने के साथ। कम विकिरण खुराक पर, झुकने वाले सभी भ्रूणों में दिखाई नहीं दे सकते हैं लेकिन अधिकांश भ्रूणों में विकसित हो सकते हैं। खुराक में वृद्धि के साथ, झुकने की गंभीरता भी बढ़ जाती है और सभी व्यक्तियों को प्रभावित करती है। इस अध्ययन में, विकिरण की 10 GY खुराक के साथ इलाज किए गए भ्रूण में इन विकृतियों को देखा गया था।

पेरिकार्डियल और कार्डियक एडिमा
सहनीय सीमा से परे या विषाक्त खुराक में विकिरण और दवाओं जैसे विषाक्त एक्सपोजर के साथ इलाज किए गए भ्रूण भी पेरिकार्डियल एडिमा65,66 विकसित करते हैं। एक्स-रे विकिरण के संपर्क में आने वाले भ्रूण पेरिकार्डियल और कार्डियक एडिमा दिखाते हैं, जिसमें पेरिकार्डियल गुहा और हृदय में तरल पदार्थ जमा होता है, जिसके परिणामस्वरूप पेरिकार्डियम और हृदय में सूजन होती है।

जर्दी थैली एडिमा, जर्दी का मोटा होना, और जर्दी थैली कसना
एक्स-रे एक्सपोजर के बाद, कुछ मछलियों में जर्दी की थैली को मोटा या बरकरार रखा जाता है, जिसका अर्थ है एक्स-रे विकिरण की विषाक्तता। कुछ मामलों में, समग्र जर्दी थैली कसना, जहां जर्दी विस्तार छोटा है, या जर्दी क्षेत्र में एडिमा विकास भी देखा जा सकता है।

सिर के आकार में कमी (माइक्रोसेफली)
भारी विकिरण का एक अपेक्षित परिणाम सिर, या माइक्रोसेफली के आकार में कमी है, जिसे तब पहचाना जा सकता है जब उपचारित भ्रूण की तुलना नियंत्रण समूह में भ्रूण के साथ की जाती है।

मूत्राशय की विकृति तैरना
विकिरण के बाद, तैरने वाले मूत्राशय को कुछ भ्रूणों में कम या समझौता किया जाता है, और उच्च विकिरण खुराक के अधीन भ्रूण के मामले में तैरने वाले मूत्राशय की विकृति अधिक होती है, जो उच्च एक्स-रे खुराक के संपर्क में आने वाले भ्रूण में कम हरकत या कम तैराकी क्षमताओं में योगदान कर सकती है।

आंखों की संरचना में परिवर्तन
विकिरण भारी डीएनए क्षति और प्रोटीन परिवर्तन का कारण बन सकता है, जो अंततः कोशिका मृत्यु और सेल संख्या में कमी या विशिष्ट सेल प्रकार65 की मृत्यु का कारण बनता है। आंख तीव्र विकिरण खुराक से प्रभावित हो सकती है, और छोटी आंख का आकार और इसकी कोशिका परतों मेंकमी देखी गई है।

दिल की धड़कन प्रति मिनट (बीपीएम)
स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण का अवलोकन करके प्रति मिनट दिल की धड़कन की गणना की गई थी। जैसे-जैसे विकिरण की खुराक बढ़ती है, बीपीएम कम हो जाता है (चित्रा 3 बी)। प्रति समूह प्रत्येक समय बिंदु पर बीपीएम की गणना करने के लिए पांच लार्वा पर विचार किया गया था। दिल की धड़कन की गिनती में कमी कार्डियक डिसफंक्शन66 का संकेत दे सकती है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 10 जीवाई की एक्स-रे विकिरण खुराक 6 एचपीएफ पर विकिरणित ज़ेबराफिश भ्रूण में स्पष्ट रूप से विषाक्त थी। नियंत्रण समूह और 2 GY और 5 GY के संपर्क में आने वाले भ्रूण में, भ्रूण में कोई महत्वपूर्ण मृत्यु नहीं हुई (चित्रा 3 ए)। इसी तरह, दिल की धड़कन प्रति मिनट गिनती ने सुझाव दिया कि एक्स-रे विकिरण की बढ़ी हुई खुराक के साथ हृदय गति में काफी कमी आई है। नियंत्रण समूह में, हर 24 घंटे के अंतराल पर, हृदय गति में वृद्धि देखी गई (चित्रा 3 बी)। हालांकि, प्रत्येक समय बिंदु पर, हृदय गति बढ़ी हुई विकिरण खुराक के साथ कम हो गई। हालांकि, 5 GY और 10 GY के संपर्क में आने वाले भ्रूण ने निषेचन के बाद 5 दिन तक कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। 15 GY और 20 GY विकिरण के संपर्क में आने वाले भ्रूण में गंभीर कार्डियोवैस्कुलर विकृति का संदेह है क्योंकि दिल की धड़कन बहुत कम हो गई है (चित्रा 3 बी)। जैसा कि पहले चर्चा की गई है, विभिन्न समय बिंदुओं पर विकिरण की अलग-अलग खुराक के संपर्क में आने वाले भ्रूण के लिए विभिन्न फेनोटाइपिक और विकासात्मक दोषों को चित्रित और मूल्यांकन किया जाता है (चित्रा 3 सी और चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: ज़ेबराफ़िश भ्रूण के विकास के चरण। प्रारंभिक ज़ेबराफ़िश विकास के विभिन्न चरणों की प्रतिनिधि छवियां। 75% एपिबोली (8 एचपीएफ) तक के चरणों को कवर किया जाता है। ढाल चरण में भ्रूण; 6 एचपीएफ (हरा रंग) विकिरण मानकीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है। स्केल बार = 276.4 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल की सामान्यीकृत रूपरेखा । (ए) प्रजनन, भ्रूण का संग्रह, और मंचन। (बी) प्रायोगिक सेटअप: अच्छी तरह से प्लेटों और दवा उपचार में भ्रूण को सीडिंग करना। (सी) विकिरण के संपर्क में आने वाले आवश्यक चरणों के भ्रूण और विकिरण के बाद देखे गए फेनोटाइपिक परिवर्तन। (डी) एक्स-रे मशीन और इसके सेटअप की एक रूपरेखा। (ई) अवलोकन, डेटा अधिग्रहण और इमेजिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 6 एचपीएफ जेब्राफिश भ्रूण पर एक्स-रे विकिरण की विभिन्न खुराक का प्रभाव । (ए) उत्तरजीविता वक्र 2 जीवाई से 20 जीवाई तक शुरू होने वाले व्यक्तिगत विकिरण खुराक के संपर्क में आने वाले ज़ेबराफिश भ्रूण के कुल जीवित अंश को दर्शाता है। (बी) निषेचन के बाद के दिनों में 6 एचपीएफ पर एक्स-रे विकिरण की विभिन्न खुराक के संपर्क में आने वाले जेब्राफिश भ्रूण के प्रति मिनट दिल की धड़कन की गिनती। (सी) विकिरण की अलग-अलग खुराक (2 GY से 20 GY तक) के संपर्क में आने वाले ज़ेबराफिश भ्रूण की प्रतिनिधि छवियां, 6 एचपीएफ पर विकिरणित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विकिरण-प्रेरित विषाक्तता के कारण विभिन्न रूपात्मक असामान्यताओं का प्रतिनिधित्व। (ए) 72 एचपीएफ पर जेब्राफिश भ्रूण और (बी) 72 एचपीएफ पर विकीर्ण भ्रूण; ऊपरी भ्रूण मध्यम विकृति दिखाता है, जबकि निचले भ्रूण में गंभीर विकृति होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ज़ेबराफ़िश का उपयोग कई अध्ययनों में मूल्यवान मॉडल के रूप में किया जाता है, जिसमें कई प्रकार के कैंसर अनुसंधान शामिल हैं। यह मॉडल बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग67,68 के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है। किसी भी अन्य विषाक्तता मूल्यांकन विधि की तरह, विकिरण और / या दवा उपचार पर प्रमुख जैविक परिवर्तनों का मात्रात्मक मूल्यांकन इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। इस प्रकार के अध्ययनों में, विषाक्तता का निरीक्षण करने के लिए अस्तित्व एकमात्र मानदंड नहीं होना चाहिए; इसे उचित स्कोरिंग सिस्टम द्वारा शारीरिक या विकासात्मक दोषों के मूल्यांकन के साथ समर्थित करने की आवश्यकता है। इस मामले में, 72 एचपीएफ तक, भ्रूण में अस्तित्व उन समूहों के बीच बहुत अलग नहीं है जिनमें भ्रूण 5 जीवाई, 10 जीवाई और 20 जीवाई की एक्स-रे विकिरण खुराक के संपर्क में हैं; हालांकि, जब इन विशेष खुराक पर भ्रूण के समग्र आकृति विज्ञान और फेनोटाइप की जांच की जाती है, तो यह स्पष्ट है कि एक्स-रे विषाक्तता जीवित रहने के ग्राफ के माध्यम से दिखाई देने की तुलना में अधिक गंभीर है। इन खुराकों में भ्रूण में रूपात्मक विकृति की गंभीरता बहुत अधिक है, जो उनके समग्र शरीर के आकार में परिवर्तन, विकास में दोष, महत्वपूर्ण अंगों की विकृति और उनकी समग्र गतिविधि में परिवर्तन को दर्शाती है। यहां तक कि 15 GY और 20 GY के समूह में, भ्रूण अपने कोरियन से बाहर भी नहीं निकल सकते हैं और खुराक-निर्भर तरीके से पर्याप्त विकृति प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, अत्यधिक घातक एक्स-रे विकिरण सहित विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, रूपात्मक, विकासात्मक और शारीरिक दोषों के स्कोरिंग को सभी संभावित तरीकों से शामिल किया जाना चाहिए, और इसका उपयोग प्रयोग के दौरान प्रशासित ज़ेब्राफिश भ्रूण या विभिन्न दवाओं की समग्र प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए किया जाना चाहिए।

यद्यपि विशेष रूप से ज़ेब्राफिश भ्रूण मॉडल में रेडियोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए कोई निश्चित स्कोरिंग सिस्टम नहीं हैं, लेकिन शरीर में झुकने, पेरिकार्डियल एडिमा, जर्दी थैली में परिवर्तन, माइक्रोसेफली, तैरने वाले मूत्राशय और आंख में परिवर्तन, दिल की धड़कन में परिवर्तन, और हरकत में दोष जैसे समग्र अस्तित्व और / या रूपात्मक परिवर्तनों कोविभिन्न अध्ययनों में ध्यान में रखा गया है। 63,64. भ्रूण के अस्तित्व का मूल्यांकन दिल की धड़कन या ओईसीडी दिशानिर्देशों में वर्णित एपिकल एंडपॉइंट के मूल्यांकन के आधार पर किया जा सकता है। इसी समय, ऐसे प्रयोगों में देखी गई रूपात्मक असामान्यताओं को व्यक्तिगत रूप से स्कोर किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, पूंछ झुकने के स्कोरिंग को कई जांचकर्ताओं द्वारा अपनाया गयाहै।

ज़ेबराफ़िश के साथ काम करते समय और इस प्रोटोकॉल का संचालन करते समय, किसी को कुछ विचारों के बारे में सावधान रहना चाहिए। इनमें प्रजनन समूह शामिल है, जो हमेशा मछली के एक ही तनाव से संबंधित होना चाहिए। सभी प्रयोगों में ज़ेबराफ़िश भ्रूण का एक पूर्वनिर्धारित तनाव शामिल होना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक भ्रूण चरण है; किसी को विकास के चरण के साथ सावधानीपूर्वक रहने की आवश्यकता होती है जिस पर भ्रूण को विकिरणित किया जाता है क्योंकि समय या चरण में थोड़ा बदलाव अलग-अलग परिणामों को जन्म देगा। कुछ दवाएं विकास को प्रभावित कर सकती हैं या भ्रूण को गंभीर नुकसान पहुंचा सकती हैं जब विकास के प्रारंभिक चरण में प्रशासित किया जाता है, जैसे 2 एचपीएफ। उस स्थिति में, दवा की उचित उप-घातक खुराक निर्धारित की जानी चाहिए, और फिर स्क्रीनिंग की जा सकती है।

एक्स-रे विकिरण पैरामीटर किए गए सभी प्रयोगों के लिए समान होना चाहिए। एक मानक एक्स-रे इरेडिएटर के तीन महत्वपूर्ण पहलू फिल्टर प्रकार, विकिरण खुराक और विकिरण का पैटर्न, और एक्स-रे स्रोत और वस्तु के बीच की दूरी है। एक्स-रे बीम उत्पन्न करने के लिए मुख्य रूप से दो प्रकार के फिल्टर का उपयोग किया जाता है: एल्यूमीनियम फिल्टर और कॉपर फिल्टर; हालांकि, तांबे और एल्यूमीनियम या अन्य धातुओं के अलग-अलग संयोजन वाले फिल्टर का उपयोगअन्य मामलों में एक्स-रे उत्पन्न करने के लिए भी किया जाता है। ज़ेबराफ़िश भ्रूण के लिए, एक्स-रे का उत्पादन करने के लिए यहां पर कुपर फिल्टर का उपयोग किया जाता है। एक्स-रे स्रोत से प्रयोगात्मक विषय तक की दूरी को स्रोत से विषय दूरी (एसएसडी) कहा जाता है। इस अध्ययन में, एसएसडी 50 सेमी निर्धारित किया गया था। एक्स-रे विकिरण 0.3 मिमी क्यू फिल्टर का उपयोग करके दिया गया था। वांछित खुराक का एक एकल एक्सपोजर 0.01-10 एनएम तरंग दैर्ध्य सीमा के भीतर 140.32 सीजीवाई / मिनट की खुराक दर पर दिया गया था। किसी भी रेडियोलॉजिकल प्रयोग को करने से पहले, प्रयोग और उद्देश्य के लिए उपयुक्त विकिरण खुराक को मानकीकृत किया जाना चाहिए। अध्ययन का उद्देश्य, विकिरण का समय, और विकिरण खुराक विकिरण खुराक मानकीकरण के लिए तीन प्रमुख मानदंड हैं। विकिरण के समय में भ्रूण के विकास के किस चरण में विकिरण दिया जाना चाहिए और समय अवधि जिसके लिए भ्रूण को एक निर्धारित खुराक के विकिरण के संपर्क में लाया जाएगा, दोनों शामिल होंगे। यह सर्वविदित है कि, प्रारंभिक विकास चरणों में, विकिरण का प्रभाव अधिकतम होता है। इस प्रोटोकॉल में, भ्रूण को विकिरण की विभिन्न खुराक (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY, और 20 GY) के साथ 6 hpf के विकास चरण में विकिरणित किया गया था और निषेचन के बाद 5 दिनों के लिए देखा गया था। सामान्य प्रोटोकॉल से किसी भी विचलन को स्पष्ट रूप से परिभाषित और मानकीकृत किया जाना चाहिए।

इस मॉडल में लगभग अनुदैर्ध्य अध्ययन में रेडियोसेंसिटाइज़र या रक्षक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कई फायदे हैं, जैसे कि व्यक्तिगत प्रजनन से कई भ्रूण प्राप्त करने की क्षमता, एक ही मूल टैंक से हर हफ्ते प्रजनन करना, प्रयोगात्मक समूहों में भ्रूण की एक महत्वपूर्ण संख्या रखना, उपचार के बाद कुछ दिनों में फेनोटाइपिक प्रभावों का निरीक्षण करना, और उपचार के बाद फेनोटाइपिक चर का एक स्पेक्ट्रम देखने के लिए। यह मॉडल भ्रूण के लगभग सभी प्रणालियों पर विकिरण के प्रभाव को प्रतिबिंबित कर सकता है, और अच्छी तरह से प्लेट प्रारूपों में एक समय में कई दवाओं का परीक्षण किया जा सकता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण को कुछ सीमाओं का भी सामना करना पड़ता है। उदाहरण के लिए, यह मॉडल उच्च जानवरों और मनुष्यों में विकिरण द्वारा दिखाए गए सभी विकृतियों को पुन: प्राप्त नहीं कर सकता है। इसके अलावा, इन मछलियों में कई प्रोटीन-आधारित या यंत्रवत अध्ययन अभिकर्मक उपलब्धता के मुद्दों के कारण सीमित हैं, जैसे कि एंटीबॉडी के साथ। हालांकि, इन सीमाओं के बावजूद, ज़ेबराफ़िश रेडियोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल साबित होता है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

एसएस की प्रयोगशाला और आरकेएस की प्रयोगशाला को डीबीटी और एसईआरबी, भारत से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। एपीएम भारत सरकार के आईसीएमआर फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं। डीपी सीएसआईआर फैलोशिप, भारत सरकार के प्राप्तकर्ता हैं। संयुक्त राष्ट्र भारत सरकार के डीएसटी-इंस्पायर फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। चित्रा 2 बायोरेंडर (https://biorender.com) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Well plates Corning CLS3335 Polystyrene
B.O.D Incubator Oswald JRIC-10
Calcium Chloride Fisher Scientific 10101-41-4
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTE Polycarbonate
Glass petriplates Borosil 3165A75 Glass
GraphpadPrism GraphPad Software, Inc. Version 5.01
Kline concavity slides Himedia GW092-1PK Glass
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Methylene blue hydrate Sigma-Aldrich 66720-100G
Parafilm Tarsons 380020 Paraffin film
Pasteur pipettes Himedia PW1212-1X500NO Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTI Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTD Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTL Polycarbonate
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet SRL 1949181
Stereo Microscope Leica M205FA Leica Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray Precision X-Ray X-RAD 225XL

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