Summary
O peixe-zebra tem sido recentemente explorado como um modelo para validar potenciais modificadores de radiação. O presente protocolo descreve as etapas detalhadas para o uso de embriões de zebrafish para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o efeito de diferentes tratamentos e radiação.
Abstract
Os peixes-zebra são amplamente utilizados em vários tipos de pesquisa porque são um dos modelos de vertebrados de fácil manutenção e exibem várias características de um sistema modelo único e conveniente. Como as células altamente proliferativas são mais suscetíveis a danos no DNA induzidos por radiação, os embriões de peixe-zebra são um modelo in vivo de linha de frente na pesquisa de radiação. Além disso, esse modelo projeta o efeito da radiação e de diferentes fármacos em um curto espaço de tempo, juntamente com os principais eventos biológicos e respostas associadas. Vários estudos sobre câncer têm utilizado peixe-zebra, e este protocolo é baseado no uso de modificadores de radiação no contexto da radioterapia e do câncer. Este método pode ser facilmente utilizado para validar os efeitos de diferentes fármacos em embriões irradiados e controles (não irradiados), identificando fármacos como radiossensibilizadores ou protetores. Embora essa metodologia seja usada na maioria dos experimentos de triagem de drogas, os detalhes do experimento e a avaliação da toxicidade com o histórico de exposição à radiação de raios X são limitados ou abordados apenas brevemente, dificultando sua execução. Este protocolo aborda essa questão e discute o procedimento e a avaliação da toxicidade com uma ilustração detalhada. O procedimento descreve uma abordagem simples para o uso de embriões de peixe-zebra para estudos de radiação e triagem de drogas baseadas em radiação com muita confiabilidade e reprodutibilidade.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal bem conhecido que tem sido amplamente utilizado em pesquisas nas últimas 3 décadas. É um pequeno peixe de água doce que é fácil de criar e reproduzir em condições de laboratório. O zebrafish tem sido extensivamente utilizado para diversos estudos de desenvolvimento e toxicológicos 1,2,3,4,5,6,7,8. O zebrafish tem alta fecundidade e curta geração embrionária; Os embriões são adequados para rastrear diferentes estágios de desenvolvimento, são visualmente transparentes e são passíveis de variedades de manipulação genética e plataformas de triagem de alto rendimento 9,10,11,12,13,14. Além disso, o zebrafish fornece imagens in toto e ao vivo para as quais seu processo de desenvolvimento e diferentes deformidades na presença de várias substâncias ou fatores tóxicos podem ser facilmente estudados usando microscopia estéreo ou fluorescente 7,15,16.
A radioterapia é uma das principais modalidades terapêuticas utilizadas no tratamento do câncer 17,18,19,20,21,22,23,24. No entanto, a radioterapia do câncer exige potenciais radioprotetores para proteger as células normais saudáveis da morte enquanto matam células malignas ou salvaguardar a saúde humana durante a terapia envolvendo radiações de alta energia 25,26,27,28,29. Por outro lado, radiossensibilizadores potentes também estão sendo investigados para aumentar a eficiência da radiação em matar células malignas, especialmente em terapias direcionadas e de precisão30,31,32,33. Portanto, para validar radioprotetores e sensibilizadores potentes, um modelo adequado para triagem de drogas de nível semi-alto e exibindo efeitos de radiação de forma mensurável é altamente solicitado. Vários modelos disponíveis são usados em estudos de radiação e envolvidos em experimentos de triagem de drogas. No entanto, vertebrados superiores e até mesmo o modelo in vivo mais comumente usado, camundongos, são inadequados para triagem de drogas em larga escala porque é demorado, caro e desafiador projetar tais experimentos de triagem com esses modelos. Da mesma forma, modelos de cultura celular são ideais para variedades de experimentos de triagem de drogas de alto rendimento34,35. No entanto, experimentos envolvendo cultura celular nem sempre são pragmáticos, altamente reprodutíveis ou confiáveis, pois as células em cultura podem mudar marcadamente seu comportamento de acordo com as condições de crescimento e cinética. Além disso, variedades de tipos celulares apresentam sensibilização diferencial à radiação. Notadamente, os sistemas de cultura de células 2D e 3D não representam todo o cenário do organismo e, portanto, os resultados obtidos podem não recapitular o real nível de radiotoxicidade36,37. Nesse sentido, o zebrafish oferece diversas vantagens na triagem de novos radiossensibilizadores e radioprotetores. A facilidade de manuseio, o grande tamanho da ninhada, a curta vida útil, o rápido desenvolvimento embrionário, a transparência do embrião e o pequeno tamanho do corpo tornam o peixe-zebra um modelo adequado para triagem de drogas em larga escala. Devido às vantagens acima, os experimentos podem ser prontamente repetidos em um curto espaço de tempo, e o efeito pode ser observado facilmente sob um microscópio dissecante em placas de poços múltiplos. Assim, o peixe-zebra vem ganhando popularidade em pesquisas de triagem de drogas envolvendo estudos de radiação38,39.
O potencial do zebrafish como modelo de triagem de modificadores de radiação tem sido demonstrado em vários estudos 40,41,42,43,44,45. O efeito radioprotetor de potenciais modificadores de rádio, como a nanopartícula DF1, amifostina (WR-2721), proteínas de reparo de DNA KU80 e ATM, e células-tronco hematopoéticas transplantadas, e os efeitos de radiossensibilizadores, como flavopiridol e AG1478, no modelo de zebrafishtêm sido relatados 19,41,42,43,44,45,46 . Usando o mesmo sistema, o efeito radioprotetor da DF-1 (nanopartícula de fulereno) foi avaliado em nível sistêmico e órgão-específico, e também o uso de embriões de peixe-zebra para triagem de radioprotetores foi mais explorado47. Recentemente, o mel de Kelulut foi relatado como um radioprotetor em embriões de peixe-zebra e foi encontrado para aumentar a sobrevivência embrionária e prevenir danos órgão-específicos, danos ao DNA celular e apoptose48.
Da mesma forma, os efeitos radioprotetores dos polímeros gerados pela reação de Hantzsch foram verificados em embriões de peixe-zebra em uma triagem de alto rendimento, e a proteção foi conferida principalmente pela proteção das células contra danos ao DNA49. Em um dos estudos anteriores, a estatina lipofílica fluvastatina foi encontrada como um potencial radiossensibilizador usando o modelo zebrafish com esta abordagem50. Da mesma forma, as nanopartículas de ouro são consideradas um radiossensibilizador ideal e têm sido utilizadas em muitosestudos51,52.
O desenvolvimento embrionário em peixe-zebra envolve clivagem nas 3 h iniciais em que um zigoto unicelular se divide para formar 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, 32 células e 64 células que são facilmente identificadas com um estereomicroscópio. Em seguida, atinge o estágio de blástula com 128 células (2,25 h pós-fecundação, hpf), onde as células dobram a cada 15 min e passam pelas seguintes etapas: 256 células (2,5 hpf), 512 células (2,75 hpf), e atingindo 1.000+ células em apenas 3 h (Figura 1). Às 4 h, o ovo atinge o estágio esférico, seguido da formação de uma forma de cúpula na massa embrionária 7,53,54. A gastrulação em peixe-zebra começa a partir de 5,25 hpf54, onde atinge o estágio de escudo. O escudo indica claramente o rápido movimento de convergência das células para um lado do anel germinativo (Figura 1) e é uma fase proeminente e distinta de embriões gastrulantes que pode ser facilmente identificada53,54. Embora a exposição à radiação em embriões possa ser feita em qualquer estágio de seu desenvolvimento, a exposição à radiação durante a gastrulação pode ter alterações morfológicas mais distintas, facilitando uma melhor leitura das toxicidades induzidas pela radiação55; Da mesma forma, a administração de fármacos em embriões pode ser iniciada já a partir de 2HPF54.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O presente estudo foi conduzido com aprovação prévia e seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto de Ciências da Vida de Bhubaneswar. Todas as manutenções e reproduções de zebrafish foram conduzidas em uma instalação de piscicultura ambiente a 28,5 °C, e os embriões foram mantidos em uma incubadora de demanda biológica de oxigênio (DBO) a uma temperatura de 28,5 °C. Neste caso, foi utilizada a linhagem AB do zebrafish, e o estadiamento foi realizado de acordo com Kimmel et al.54. A radiação de raios X foi administrada a 6 hpf (estágio de escudo), e diferentes fenótipos foram observados até 120 hpf.
1. Melhoramento genético e coleta de embriões
- Definir os tanques de reprodução (compostos de policarbonato, capacidade 1 L, ver Tabela de Materiais). Despeje água do sistema (pH, 6,8-7,5; condutividade, 500 μS; e temperatura, 28,5 °C) nos tanques de reprodução cobrindo quase 40% de seu volume. Coloque a divisória no tanque para criar duas câmaras, uma para fêmeas e outra para machos.
- Dos tanques parentais, colete cuidadosamente duas fêmeas saudáveis e um macho saudável com a ajuda de uma rede, coloque-os em suas respectivas metades e mantenha-os no escuro durante a noite (mínimo de 10 h) a 28,5 °C.
- Na manhã seguinte, remova o divisor e permita que os peixes acasalem sem perturbar os tanques de reprodução.
NOTA: As fêmeas começarão a desovar e os ovos serão vistos deitados no fundo do tanque dentro de 10-15 minutos após os peixes acasalarem56,57,58. - Devolver os peixes aos tanques após a desova, coletar os embriões do tanque de reprodução com filtro de filtro, lavá-los adequadamente com água do sistema e manter os ovos coletados em placa de Petri com meio E-3 (4,94 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,43 mM de CaCl 2, 0,85 mM de sais de MgCl2, 1% p/v de azul de metileno, ver Tabela de Materiais).
- Observar os ovos em microscópio dissecante, remover os embriões não fertilizados ou mortos com pipeta de Pasteur e manter as placas de Petri contendo ovos fertilizados em meio E-3 a 28,5 °C em incubadora para seu adequado crescimento e manutenção.
NOTA: Os ovos não fertilizados podem ser identificados com uma aparência branca leitosa com um córion coagulado ou com células rompidas dentro do córion. Juntamente com os óvulos não fertilizados, ovos que não sofreram clivagem e ovos com deformidades como irregularidades durante a clivagem, por exemplo, assimetria, formação de vesículas ou lesões do córion, ou não se desenvolvendo ativamente, devem ser descartados para manter os embriões coletados saudáveis e limpos 7,56.
2. Monitoramento de embriões e seleção para experimentos de radiação
- Monitorar os embriões em crescimento sob o microscópio dissecante, identificar o estágio adequado 7,54 e remover os embriões mortos ou insalubres. Garantir o estadiamento embrionário adequado, pois as doses de radiação e drogas serão administradas em um estágio específico de gastrulação.
OBS: Todos os dias, verifique o nível e a qualidade da mídia nos pratos de cultura. Troque o meio a cada 24 h, além de remover embriões mortos. As pipetas de Pasteur são preferidas para serem usadas para a colheita de embriões ou troca de meios. - Antes de iniciar o experimento, distribua cuidadosamente os embriões saudáveis nas placas experimentais com a ajuda de uma pipeta de Pasteur. Para cada grupo experimental, tomar 15-20 embriões.
OBS: Coloque na placa experimental apenas embriões sadios dos estágios de desenvolvimento desejados. Suponha que o tratamento medicamentoso tenha que ser feito com embriões a 6 hpf, em seguida, começar a semeá-los em placas experimentais pelo menos 30-60 minutos antes.
3. Tratamento medicamentoso
- Adicione drogas da concentração desejada aos embriões de peixe-zebra. Prepare o meio E-3 contendo o medicamento com bastante antecedência. Certifique-se de que a solução estoque da droga não tem nenhuma droga não dissolvida antes de preparar o meio de trabalho para tratar embriões de peixe-zebra.
- Antes de adicionar qualquer droga a um meio para triagem de radiação, verifique o efeito citotóxico da droga com os graus de concentrações da droga. Seguir as diretrizes da OCDE para avaliar a LC 50 dos medicamentos sob avaliação 59,60,61.
NOTA: Tenha cuidado ao mover as placas e pratos durante o tempo de irradiação ou observação. Há muitas chances de que as placas sejam perturbadas durante esse manuseio, fazendo com que o meio vaze para fora dos poços ou os embriões vazem de seus respectivos poços, potencialmente contaminando poços próximos e arruinando o experimento.
4. Irradiação de raios X
- Ao montar um experimento de radiação, inclua um grupo controle/não irradiado e um grupo somente de radiação. Da mesma forma, ao realizar uma triagem de drogas, inclua outro grupo onde as drogas serão administradas com a mesma concentração que as administradas no experimento de triagem juntamente com a radiação.
OBS: Rotule tanto a tampa quanto a base de pratos de poço ou pratos de cultura para que as tampas não fiquem extraviadas. - Distribuir os embriões em uma placa de poço se os escudos de radiação puderem cobrir e proteger os poços extras da radiação enquanto os outros poços são expostos a uma dose de radiação específica; caso contrário, use placas ou discos individuais para semear os embriões por dose de radiação.
- Ligue a máquina irradiadora de raios X (consulte Tabela de Materiais) e inicie a inicialização e o aquecimento da máquina.
NOTA: O valor da distância entre a origem e o assunto (SSD) deve ser de 50 cm; pode-se usar diferentes SSDs mais uma vez, o que requer padronização. - Coloque a placa experimental sob o irradiador dentro da máquina no centro, garantindo que a placa esteja diretamente abaixo da fonte de raios X, e então ajuste a dose (por exemplo, 5 GY) e inicie o raio-X.
OBS: Selar as placas com filme de parafina para evitar qualquer derramamento indesejado ou contaminação durante o transporte das placas da incubadora para o irradiador e vice-versa. - Após a conclusão da irradiação, retire as placas, desligue o programa da máquina, desligue a máquina e verifique as placas sob o microscópio imediatamente após a radiação. Remover os embriões mortos e devolver as placas à incubadora a 28,5 °C. Registrar o número de embriões mortos após avaliá-los ao microscópio dissecante.
NOTA: Irradiar os diferentes grupos de embriões com doses de radiação designadas sem muito atraso entre grupos individuais, pois o efeito da radiação pode ser significativamente afetado pela diferença no estágio de desenvolvimento.
CUIDADO: Ao operar o aparelho de raios-X, tome as medidas de proteção adequadas.
5. Coleta, imagem e análise de dados
- Coletar dados em intervalos de tempo pré-determinados, como a cada 24 h após a radiação ser administrada. Registrar todas as observações possíveis, como sobrevivência, eficiência de eclosão, estágio de desenvolvimento, contagem de batimentos cardíacos, curvatura do corpo e da cauda, edema pericárdico, extensão do saco vitelino, microcefalia, desenvolvimento da bexiga natatória, motilidade ou atividade geral, etc.62,63,64.
- Para capturar imagens, escolha embriões representativos em uma lâmina limpa, verifique os embriões ao microscópio, oriente-os em uma direção específica e clique nas imagens. Renomeie os arquivos de imagem de acordo com o grupo e a hora.
NOTA: A mesma ampliação e iluminação devem ser usadas durante a captura de imagens em intervalos de tempo diferentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O layout geral do protocolo está representado na Figura 2. O efeito da radiação e a caracterização de forma dose-dependente foram avaliados com as seguintes análises.
Avaliação da toxicidade induzida por raios X
Com o uso de estereomicroscópio, as seguintes anormalidades foram avaliadas e caracterizadas após o tratamento medicamentoso e/ou radiação. De acordo com as diretrizes da OCDE 61, para avaliação da toxicidade em peixes, quatro desfechos apicais principais, incluindo coagulação de embriões, deformidades na formação de somitos, não descolamento da cauda do saco vitelínico e redução ou ausência de batimentos cardíacos, foram incluídos para analisar a toxicidade global61. A toxicidade aguda foi determinada com base em um desfecho positivo em qualquer uma das anormalidades acima. Além desses quatro desfechos principais, também foram realizadas observações morfológicas para flexão da coluna ou cauda, malformação da cabeça e microcefalia, defeitos de desenvolvimento, edema pericárdico, deformidades do saco vitelino, deformidades da bexiga natatória e alterações da estrutura ocular (Figura 3C e Figura 4). A pontuação para a radiotoxicidade poderia ser baseada na porcentagem de sobrevivência e/ou pontuação de diferentes anormalidades morfológicas.
Porcentagem de sobrevida e curva de sobrevida
A porcentagem de sobrevivência foi calculada dividindo-se o total de embriões vivos pelo número total de embriões inicialmente colhidos em grupo e multiplicando-se o resultado por 100 38,50,65. Em seguida, os valores correspondentes aos diferentes momentos e aos diferentes grupos experimentais foram plotados para obtenção da curva de sobrevida. Este estudo fornece a curva de sobrevivência para embriões irradiados a 6 hpf (Figura 3A).
Principais anormalidades associadas à toxicidade induzida pela radiação (Figura 3 e Figura 4)
Curvatura do corpo e flexão da cauda
Este é um dos parâmetros mais comuns para avaliar qualquer deformidade induzida por toxicidade em embriões de peixe-zebra 50,65,66. As deformidades da curvatura corporal podem ser vistas em diferentes padrões, variando de baixa, moderada a grave, com flexão na região pós-hepática da cauda ou no eixo principal do corpo ou ainda com uma coluna completamente semicircular ou mais de uma flexão no eixo do corpo e na cauda. Em doses de radiação mais baixas, a flexão pode não aparecer em todos os embriões, mas pode se desenvolver na maioria dos embriões. Com um aumento na dose, a gravidade da flexão também aumenta e afeta todos os indivíduos. Neste estudo, essas deformidades foram observadas nos embriões tratados com dose de radiação de 10 GY.
Edema pericárdico e cardíaco
Embriões tratados com exposições tóxicas como radiação e drogas além dos limites toleráveis ou em doses tóxicas também desenvolvem edema pericárdico65,66. Embriões expostos à radiação de raios X apresentam edema pericárdico e cardíaco, no qual o líquido se acumula na cavidade pericárdica e no coração, resultando em edema do pericárdio e do coração.
Edema do saco vitelino, espessamento da gema e constrição do saco vitelino
Após a exposição aos raios X, o saco vitelínico em alguns peixes é visto como espessado ou retido, implicando a toxicidade da radiação de raios-X. Em alguns casos, constrição geral do saco vitelino, onde a extensão da gema é curta, ou desenvolvimento de edema na região da gema também podem ser observados.
Redução do tamanho da cabeça (microcefalia)
Um resultado esperado da radiação pesada é a redução do tamanho da cabeça, ou microcefalia, que pode ser identificada quando os embriões tratados são comparados com os embriões do grupo controle.
Deformidades da bexiga natatória
Após a irradiação, a bexiga natatória mostra-se reduzida ou comprometida em alguns embriões, e a deformidade da bexiga natatória é maior no caso de embriões submetidos a doses mais altas de radiação, o que pode contribuir para a baixa locomoção ou redução da habilidade de nado em embriões expostos a altas doses de raios-X.
Alteração na estrutura ocular
A radiação pode causar enormes danos ao DNA e alterações proteicas, que eventualmente causam morte celular e redução do número de células ou morte de tipos celulares específicos65. O olho pode ser afetado por doses intensas de radiação, e o tamanho pequeno do olho e a diminuição de suas camadas celulares têm sido observados55.
Batimentos cardíacos por minuto (bpm)
Os batimentos cardíacos por minuto foram contados observando-se os embriões sob o estereomicroscópio. À medida que a dose de radiação aumenta, o bpm tende a diminuir (Figura 3B). Cinco larvas foram consideradas para calcular bpm em cada momento por grupo. A diminuição dos batimentos cardíacos poderia indicar disfunção cardíaca66.
Usando este protocolo, a dose de radiação de raios X de 10 GY foi visivelmente tóxica em embriões de zebrafish irradiados a 6 hpf. No grupo controle e embriões expostos a 2 GY e 5 GY, não houve morte significativa nos embriões (Figura 3A). Da mesma forma, a contagem de batimentos cardíacos por minuto sugeriu que a frequência cardíaca diminuiu enormemente com o aumento das doses de radiação de raios-X. No grupo controle, a cada intervalo de 24 h, observou-se aumento da frequência cardíaca (Figura 3B). No entanto, a cada momento, a frequência cardíaca diminuía com o aumento da dose de radiação. Entretanto, os embriões expostos a 5 GY e 10 GY não apresentaram diferenças significativas até o 5º dia pós-fecundação. Suspeita-se de deformação cardiovascular grave em embriões expostos à radiação 15 GY e 20 GY à medida que os batimentos cardíacos caem enormemente (Figura 3B). Como discutido anteriormente, diferentes defeitos fenotípicos e de desenvolvimento são descritos e avaliados para embriões expostos a doses variáveis de radiação em diferentes momentos (Figura 3C e Figura 4).
Figura 1: Estágios de desenvolvimento do embrião do peixe-zebra. Imagens representativas de diferentes estágios do desenvolvimento inicial do peixe-zebra. Estágios até 75% epibólico (8 hpf) são cobertos. Embriões em fase de escudo; 6 HPF (cor verde) é usado para padronização da radiação. Barra de escala = 276,4 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema generalizado do protocolo . (A) Melhoramento, coleta de embriões e estadiamento. (B) Montagem experimental: semeadura de embriões em placas de poço e tratamento medicamentoso. (C) Embriões de estágios requeridos expostos à radiação e alterações fenotípicas observadas após a radiação. (D) Um esboço do aparelho de raios X e sua configuração. (E) Observações, aquisição de dados e obtenção de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito de diferentes doses de irradiação de raios X em embriões de zebrafish de 6 hpf . (A) Curva de sobrevivência mostrando a fração total sobrevivente de embriões de peixe-zebra expostos a doses individuais de radiação de 2 GY a 20 GY. (B) Contagem de batimentos cardíacos por minuto de embriões de peixe-zebra expostos a diferentes doses de radiação de raios X a 6 hpf nos dias subsequentes da fecundação. (C) Imagens representativas de embriões de zebrafish expostos a doses variáveis de radiação (de 2 GY a 20 GY), irradiados a 6 hpf. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação de diferentes anormalidades morfológicas devido à toxicidade induzida pela radiação. (A) A controlar embriões de zebrafish a 72 hpf e (B) embriões irradiados a 72 hpf; O embrião superior apresenta deformidades moderadas, enquanto o embrião inferior apresenta deformidades graves. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish são usados como modelos valiosos em muitos estudos, incluindo vários tipos de pesquisa de câncer. Esse modelo fornece uma plataforma útil para a triagem de drogas em larga escala67,68. Como qualquer outro método de avaliação de toxicidade, a avaliação quantitativa das principais alterações biológicas decorrentes da radiação e/ou tratamento medicamentoso é a parte mais crucial deste protocolo. Nesses tipos de estudos, a sobrevida não deve ser o único critério para observar a toxicidade; ela precisa ser apoiada com a avaliação de defeitos físicos ou de desenvolvimento por sistemas de pontuação adequados. Neste caso, também, até 72 hpf, a sobrevivência em embriões não é muito diferente entre os grupos em que os embriões são expostos a doses de radiação de raios X de 5 GY, 10 GY e 20 GY; no entanto, quando a morfologia geral e os fenótipos dos embriões são verificados nessas doses específicas, fica claro que a toxicidade por raios X é mais grave do que parece através do gráfico de sobrevivência. A gravidade da deformidade morfológica em embriões nessas doses é muito alta, refletindo mudanças no tamanho total do corpo, defeitos no desenvolvimento, malformação de órgãos vitais e mudanças em sua atividade global. Mesmo no grupo de 15 GY e 20 GY, os embriões não conseguem sequer eclodir de seu córion e exibem deformidades amplas de forma dose-dependente. Assim, para avaliar o efeito de substâncias tóxicas, incluindo radiação de raios X altamente fatal, a pontuação de defeitos morfológicos, de desenvolvimento e fisiológicos deve ser incluída de todas as maneiras possíveis, e isso deve ser usado para avaliar a resposta global de embriões de peixe-zebra ou diferentes drogas administradas no decorrer do experimento.
Embora não existam sistemas de pontuação definitivos para avaliar a radiotoxicidade no modelo embrionário do peixe-zebra especificamente, a sobrevida global e/ou alterações morfológicas como flexão no corpo, edema pericárdico, alterações no saco vitelino, microcefalia, alterações na bexiga natatória e no olho, alterações nos batimentos cardíacos e defeitos de locomoção têm sido levados em consideração em vários estudos62, 63,64. A sobrevivência dos embriões pode ser avaliada com base nos batimentos cardíacos ou na avaliação dos desfechos apicais, conforme descrito nas diretrizes da OCDE. Ao mesmo tempo, as anormalidades morfológicas observadas em tais experimentos puderam ser pontuadas individualmente; por exemplo, a pontuação de flexão da cauda foi adotada por vários investigadores61.
Ao trabalhar com peixe-zebra e conduzir este protocolo, deve-se ter cuidado com certas considerações. Estes incluem o grupo reprodutor, que deve pertencer sempre à mesma estirpe de peixes. Todos os experimentos devem envolver uma cepa predefinida de embrião de peixe-zebra. Outro fator importante é o estágio embrionário; É preciso ser meticuloso com o estágio de desenvolvimento em que os embriões são irradiados, porque uma pequena mudança no tempo ou estágio levará a resultados diferentes. Algumas drogas podem afetar o desenvolvimento ou causar danos graves aos embriões quando administradas em um estágio inicial de desenvolvimento, como 2 hpf. Nesse caso, a dose sub-letal adequada da droga deve ser determinada e, em seguida, a triagem pode ser realizada.
Os parâmetros de irradiação de raios X devem ser uniformes para todos os experimentos realizados. Os três aspectos importantes de um irradiador de raios X padrão são o tipo de filtro, a dose e o padrão de irradiação de radiação e a distância entre a fonte de raios X e o objeto. Existem basicamente dois tipos de filtros usados para gerar feixes de raios X: filtros de alumínio e filtros de cobre; entretanto, filtros com combinações variadas de cobre e alumínio ou outros metais também são utilizados para gerar raios X em outros casos69. Para embriões de peixe-zebra, o filtro de cupper é usado aqui para produzir raios-X. A distância da fonte de raios X ao sujeito experimental é denominada como distância fonte-sujeito (SSD). Neste estudo, o TF foi regulado para ser de 50 cm. A radiação de raios X foi dada com filtro de 0,3 mm. Uma única exposição da dose desejada foi administrada a uma taxa de dose de 140,32 cGY/min dentro da faixa de comprimento de onda de 0,01-10 nm. Antes da realização de qualquer experimento radiológico, deve-se padronizar a dose de radiação adequada para o experimento e o objetivo. O objetivo do estudo, o momento da irradiação e a dose de radiação são os três principais critérios para padronização da dose de radiação. O momento da radiação incluirá tanto a fase do desenvolvimento do embrião em que a radiação deve ser administrada como o período de tempo durante o qual o embrião será exposto a uma radiação de uma dose definida. Sabe-se que, nos estágios iniciais de desenvolvimento, o efeito da radiação é maximizado. Neste protocolo, os embriões foram irradiados em um estágio de desenvolvimento de 6 hpf com diferentes doses de radiação (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY e 20 GY) e observados por 5 dias após a fecundação. Qualquer desvio do protocolo usual deve ser claramente definido e padronizado.
Este modelo tem várias vantagens para estudar o efeito de radiossensibilizadores ou protetores em um estudo quase longitudinal, tais como a capacidade de obter vários embriões a partir de reprodução individual, de procriar todas as semanas a partir de um tanque monoparental, de colocar um número significativo de embriões em grupos experimentais, de observar efeitos fenotípicos em poucos dias após o tratamento, e ver um espectro de variáveis fenotípicas após os tratamentos. Este modelo pode refletir o impacto da radiação em quase todos os sistemas do embrião, e várias drogas podem ser testadas ao mesmo tempo em formatos de placas poço. No entanto, essa abordagem também enfrenta algumas limitações. Por exemplo, este modelo não pode recapitular todas as deformidades mostradas pelas radiações em animais superiores e humanos. Além disso, muitos estudos baseados em proteínas ou mecanísticos nesses peixes são limitados devido a problemas de disponibilidade de reagentes, como com anticorpos. No entanto, apesar dessas limitações, o zebrafish mostra-se um excelente modelo para estudos radiológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declararam não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
O laboratório da SS e o laboratório da RKS são financiados por subsídios da DBT e da SERB, Índia. A APM recebeu a bolsa ICMR, Governo da Índia. DP é um beneficiário da bolsa CSIR, Governo da Índia. A ONU recebeu a bolsa DST-Inspire, do Governo da Índia. A Figura 2 foi gerada usando Biorender (https://biorender.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
References
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
- Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
- Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
- Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
- Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
- Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
- Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
- Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
- Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E.
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
- Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
- Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
- Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
- Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Garibaldi, C., et al.
- Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
- Citrin, D. E.
- Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
- Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
- Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
- Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
- Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
- Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S.
- Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
- Citrin, D. E.
- Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
- Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
- Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
- Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
- Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
- Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
- Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
- Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
- Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
- McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
- Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
- Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
- Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
- Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
- Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
- Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
- Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
- Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
- Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
- Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
- Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
- Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
- Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
- Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
- Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
- Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
- Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
- Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
- Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
- Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
- Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).
