Summary
Zebrafisken er for nylig blevet udnyttet som model til at validere potentielle strålingsmodifikatorer. Denne protokol beskriver de detaljerede trin til at bruge zebrafiskembryoner til strålingsbaserede screeningsforsøg og nogle observationsmetoder til evaluering af effekten af forskellige behandlinger og stråling.
Abstract
Zebrafisk bruges i vid udstrækning i flere former for forskning, fordi de er en af de let vedligeholdte hvirveldyrmodeller og udviser flere funktioner i et unikt og praktisk modelsystem. Da stærkt proliferative celler er mere modtagelige for strålingsinduceret DNA-skade, er zebrafiskembryoner en frontlinje in vivo-model inden for strålingsforskning. Derudover projicerer denne model effekten af stråling og forskellige lægemidler inden for kort tid sammen med større biologiske begivenheder og tilhørende reaktioner. Flere kræftstudier har brugt zebrafisk, og denne protokol er baseret på brugen af strålingsmodifikatorer i forbindelse med strålebehandling og kræft. Denne metode kan let anvendes til at validere virkningerne af forskellige lægemidler på bestrålede og kontrollerende (ikke-bestrålede) embryoner og således identificere lægemidler som radiosensibiliserende eller beskyttende lægemidler. Selv om denne metode anvendes i de fleste lægemiddelscreeningsforsøg, er detaljerne i forsøget og toksicitetsvurderingen med baggrund for røntgenstrålingseksponering begrænsede eller kun kort behandlet, hvilket gør det vanskeligt at udføre. Denne protokol behandler dette problem og diskuterer proceduren og toksicitetsevalueringen med en detaljeret illustration. Proceduren beskriver en enkel tilgang til anvendelse af zebrafiskembryoner til strålingsundersøgelser og strålingsbaseret lægemiddelscreening med stor pålidelighed og reproducerbarhed.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) er en velkendt dyremodel, der har været meget udbredt i forskningen gennem de sidste 3 årtier. Det er en lille ferskvandsfisk, der er let at opdrætte og opdrætte under laboratorieforhold. Zebrafisken er blevet flittigt anvendt til forskellige udviklingsmæssige og toksikologiske undersøgelser 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebrafisken har høj frugtbarhed og kort embryonal generation; Embryonerne er velegnede til sporing af forskellige udviklingsstadier, er visuelt gennemsigtige og kan anvendes til varianter af genetisk manipulation og screeningsplatformemed høj kapacitet 9,10,11,12,13,14. Desuden giver zebrafisken in toto og levende billeddannelse, for hvilken dens udviklingsproces og forskellige deformiteter i nærvær af forskellige giftige stoffer eller faktorer let kan studeres ved hjælp af stereo eller fluorescerende mikroskopi 7,15,16.
Strålebehandling er en af de vigtigste terapeutiske metoder, der anvendes til behandling af kræft 17,18,19,20,21,22,23,24. Imidlertid kræver kræftstrålebehandling potentielle radiobeskyttere for at beskytte normale sunde celler mod at dø, mens de dræber ondartede celler eller beskytter menneskers sundhed under behandling, der involverer højenergistråling 25,26,27,28,29. Omvendt undersøges potente radiosensibilisatorer også for at øge effektiviteten af stråling til at dræbe maligne celler, især i målrettede og præcisionsterapier30,31,32,33. For at validere potente radioprotektorer og sensibilisatorer er en model, der er egnet til semi-high-throughput lægemiddelscreening og målbart udviser strålingseffekter, derfor meget efterspurgt. Flere tilgængelige modeller anvendes i strålingsundersøgelser og involveret i lægemiddelscreeningseksperimenter. Imidlertid er højere hvirveldyr og endda den mest almindeligt anvendte in vivo-model, mus, uegnede til storskala lægemiddelscreening, fordi det er tidskrævende, dyrt og udfordrende at designe sådanne screeningseksperimenter med disse modeller. Tilsvarende er cellekulturmodeller ideelle til sorter af lægemiddelscreeningsforsøg med høj kapacitet34,35. Eksperimenter, der involverer cellekultur, er imidlertid ikke altid pragmatiske, meget reproducerbare eller pålidelige, da celler i kultur markant kan ændre deres adfærd i henhold til vækstbetingelserne og kinetikken. Også sorter af celletyper viser differentiel strålingssensibilisering. Navnlig repræsenterer 2D- og 3D-cellekultursystemer ikke hele organismescenariet, og derfor kan de opnåede resultater muligvis ikke rekapitulere det faktiske niveau af radiotoksicitet36,37. I denne henseende giver zebrafisken flere fordele ved screening for nye radiosensibilisatorer og radioprotektorer. Den lette håndtering, store koblingsstørrelse, korte levetid, hurtige embryonale udvikling, embryogennemsigtighed og lille kropsstørrelse gør zebrafisken til en velegnet model til storstilet lægemiddelscreening. På grund af ovenstående fordele kan eksperimenter let gentages på kort tid, og effekten kan let observeres under et dissekerende mikroskop i multibrøndplader. Derfor vinder zebrafisken popularitet i lægemiddelscreeningsforskning, der involverer strålingsundersøgelser38,39.
Zebrafiskens potentiale som en bonafide model til screening af strålingsmodifikatorer er blevet demonstreret i forskellige undersøgelser 40,41,42,43,44,45. Den radiobeskyttende virkning af potentielle radiomodifikatorer, såsom nanopartikel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparationsproteiner KU80 og ATM og transplanterede hæmatopoietiske stamceller og virkningerne af radiosensibilisatorer, såsom flavopiridol og AG1478, i zebrafiskmodellen er blevet rapporteret 19,41,42,43,44,45,46 . Ved hjælp af det samme system blev den radiobeskyttende virkning af DF-1 (fulleren nanopartikel) vurderet både på systemiske og organspecifikke niveauer, og også brugen af zebrafiskembryoner til screening af radiobeskyttere blev yderligere undersøgt47. For nylig blev Kelulut-honningen rapporteret som en radiobeskytter i zebrafiskembryoner og viste sig at øge embryooverlevelsen og forhindre organspecifik skade, cellulær DNA-skade og apoptose48.
På samme måde blev de radiobeskyttende virkninger af polymerer, der blev genereret via Hantzschs reaktion, kontrolleret på zebrafiskembryoner i en screening med høj kapacitet, og beskyttelsen blev hovedsageligt opnået ved at beskytte celler mod DNA-skader49. I en af de tidligere undersøgelser blev det lipofile statin fluvastatin fundet som et potentielt radiosensibilisator ved hjælp af zebrafiskmodellen med denne tilgang50. Tilsvarende anses guldnanopartikler for at være et ideelt radiosensibilisator og er blevet brugt i mange undersøgelser51,52.
Den embryonale udvikling i zebrafisk involverer spaltning i de første 3 timer, hvor en enkeltcellet zygote deler sig for at danne 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler og 64 celler, der let identificeres med et stereomikroskop. Derefter opnår den blastula-stadiet med 128 celler (2.25 timer efter befrugtning, hpf), hvor cellerne fordobles hvert 15. minut og fortsætter gennem disse følgende faser: 256 celler (2.5 hpf), 512 celler (2.75 hpf) og når 1,000+ celler på kun 3 timer (figur 1). Ved 4 timer når ægget kuglestadiet, efterfulgt af dannelsen af en kuppelform i fostermassen 7,53,54. Gastrulationen i zebrafisk starter fra 5,25 hpf54, hvor den når skjoldstadiet. Skjoldet angiver tydeligt cellernes hurtige konvergensbevægelse til den ene side af kimringen (figur 1) og er en fremtrædende og tydelig fase af gastrulaterende embryoner, der let kan identificeres53,54. Selv om strålingseksponering for embryoner kan ske på et hvilket som helst stadium af deres udvikling, kan strålingseksponering under gastrulation have mere tydelige morfologiske ændringer, der letter bedre aflæsning af strålingsinduceret toksicitet55; På samme måde kan administration af lægemidler til embryoner påbegyndes så tidligt som 2 HPF54.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført med forudgående godkendelse fra og efter retningslinjerne fra Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Al vedligeholdelse og opdræt af zebrafisk blev udført på et omgivende fiskekulturanlæg ved 28,5 °C, og embryonerne blev opbevaret i en biologisk iltbehovsinkubator (BOD) ved en temperatur på 28,5 °C. Her blev zebrafisken AB-stammen brugt, og iscenesættelsen blev udført ifølge Kimmel et al.54. Røntgenstråling blev givet ved 6 hpf (skjoldstadiet), og forskellige fænotyper blev observeret indtil 120 hpf.
1. Avlsopsætning og embryoindsamling
- Indstil avlstankene (består af polycarbonat, kapacitet 1 L, se materialetabel). Hæld systemvand (pH, 6,8-7,5; ledningsevne, 500 μS; og temperatur, 28,5 °C) i avlstankene, der dækker næsten 40% af dets volumen. Placer skillevæggen i tanken for at skabe to kamre, det ene til kvinder og det andet til mænd.
- Fra modertankene samles forsigtigt to sunde hunner og en sund han ved hjælp af et net, sættes i deres respektive halvdele og opbevares i mørke natten over (mindst 10 timer) ved 28,5 °C.
- Næste morgen skal du fjerne skillelinjen og lade fiskene parre sig uden at forstyrre avlstankene.
OBS: Hunnerne begynder at gyde, og æggene ses liggende på bunden af akvariet inden for 10-15 min efter fiskene har fået lov til at parre56,57,58. - Sæt fiskene tilbage i deres tanke efter gytning, saml embryonerne fra avlstanken ved hjælp af en sil, vask dem ordentligt med systemvandet, og opbevar de indsamlede æg i en petriplade med E-3-medier (4,94 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,43 mM CaCl2, 0,85 mMMgCl2-salte, 1% w/v methylenblåt, se Tabel over materialer).
- Overhold æggene under et dissekerende mikroskop, fjern de ubefrugtede eller døde embryoner ved hjælp af en Pasteur-pipette, og opbevar petripladerne indeholdende befrugtede æg i E-3-mediet ved 28,5 °C i en inkubator for deres korrekte vækst og vedligeholdelse.
BEMÆRK: Ubefrugtede æg kan identificeres med et mælkehvidt udseende med en koaguleret korion eller med bristede celler inde i korionen. Sammen med ubefrugtede æg skal æg, der ikke spaltes, og æg med deformiteter som uregelmæssigheder under spaltning, f.eks. asymmetri, vesikeldannelse eller skader på korionen eller ikke udvikler sig aktivt, kasseres for at holde de indsamlede embryoner sunde og for at holde medierne rene 7,56.
2. Overvågning af embryoner og udvælgelse til stråleforsøg
- Overvåg de voksende embryoner under dissekeringsmikroskopet, identificer det korrekte stadium 7,54, og fjern eventuelle døde eller usunde embryoner. Sørg for tilstrækkelig embryostadie, da strålings- og lægemiddeldoserne vil blive givet på et bestemt gastrulationsstadium.
BEMÆRK: Kontroller hver dag niveauet og kvaliteten af medierne i kulturretterne. Skift medie hver 24. time sammen med fjernelse af døde embryoner. Pasteurpipetter foretrækkes anvendt til plukning af embryoner eller skift af medie. - Før du starter eksperimentet, fordeles de sunde embryoner forsigtigt i forsøgspladerne ved hjælp af en Pasteur-pipette. For hver forsøgsgruppe skal du tage 15-20 embryoner.
BEMÆRK: Anbring kun sunde embryoner af de ønskede udviklingsstadier i forsøgspladen. Antag, at lægemiddelbehandlingen skal udføres med embryoner ved 6 hpf, og start derefter såning i forsøgsplader mindst 30-60 minutter tidligere.
3. Narkotikabehandling
- Tilsæt lægemidler med ønsket koncentration til zebrafiskembryonerne. Forbered det lægemiddelholdige E-3-medie i god tid. Sørg for, at stamopløsningen af lægemidlet ikke har noget uopløst lægemiddel, før du forbereder arbejdsmediet til behandling af zebrafiskembryoner.
- Før du tilføjer et lægemiddel til et medium til strålingsscreening, skal du kontrollere lægemidlets cytotoksiske virkning med koncentrationerne af lægemidlet. Følg OECD's retningslinjer for at evaluere LC 50 af de lægemidler, der evalueres 59,60,61.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du flytter tallerkener og tallerkener under bestrålingen eller observationstiden. Der er mange chancer for, at pladerne vil blive forstyrret under denne håndtering, hvilket får medierne til at lække ud af brøndene eller embryonerne til at spilde ud af deres respektive brønde, potentielt forurene nærliggende brønde og ødelægge eksperimentet.
4. Bestråling af røntgenstråler
- Når du opretter et strålingseksperiment, skal du inkludere en kontrol/ikke-bestrålet gruppe og en gruppe, der kun er stråling. Tilsvarende, mens du udfører en lægemiddelscreening, skal du inkludere en anden gruppe, hvor lægemidlerne vil blive givet med samme koncentration som dem, der administreres i screeningseksperimentet sammen med stråling.
BEMÆRK: Mærk både låg og bund på brøndplader eller kulturskåle, så lågene ikke bliver forlagt. - Fordel embryonerne i en brøndplade, hvis strålingsskærmene kan dække og beskytte de ekstra brønde mod stråling, mens de andre brønde udsættes for en bestemt strålingsdosis; Ellers skal du bruge individuelle plader eller skiver til at frø embryonerne pr. Strålingsdosis.
- Tænd for røntgenbestrålermaskinen (se materialetabellen), og start maskinens initialisering og opvarmning.
BEMÆRK: Værdien for afstand mellem kilde og motiv (SSD) skal være 50 cm; man kan bruge forskellige SSD'er endnu en gang, hvilket kræver standardisering. - Placer forsøgspladen under bestrålingsapparatet inde i maskinen i midten, og sørg for, at pladen er direkte under røntgenkilden, og indstil derefter dosis (f.eks. 5 GY) og start røntgenstrålen.
BEMÆRK: Pladerne forsegles med paraffinfilm for at undgå uønsket spild eller forurening under transporten af pladerne fra inkubatoren til bestråleren og tilbage. - Efter afslutningen af bestrålingen skal du tage pladerne ud, lukke maskinprogrammet, slukke for maskinen og kontrollere pladerne under mikroskopet umiddelbart efter stråling. De døde embryoner fjernes og pladerne sættes tilbage i inkubatoren ved 28,5 °C. Optag antallet af døde embryoner efter evaluering af dem under dissekeringsmikroskopet.
BEMÆRK: Bestråle de forskellige grupper af embryoner med udpegede strålingsdoser uden større forsinkelse mellem individuelle grupper, da virkningen af stråling kan påvirkes betydeligt af forskellen i udviklingsstadiet.
FORSIGTIG: Mens du betjener røntgenmaskinen, skal du træffe passende beskyttelsesforanstaltninger.
5. Dataindsamling, billeddannelse og analyse
- Indsaml data med forudbestemte tidsintervaller, såsom hver 24. time efter strålingen er givet. Registrer alle mulige observationer såsom overlevelse, rugeeffektivitet, udviklingsstadium, hjerteslagtal, krops- og halekrumning, perikardieødem, forlængelse af æggeblommesækken, mikrocefali, svømmeblæreudvikling, generel bevægelighed eller aktivitet osv.62,63,64.
- For at tage billeder skal du vælge repræsentative embryoner på et rent dias, kontrollere embryonerne under mikroskopet, orientere dem i en bestemt retning og klikke på billeder. Omdøb billedfilerne i henhold til gruppen og klokkeslættet.
BEMÆRK: Den samme forstørrelse og belysning skal bruges, når du tager billeder med forskellige tidsintervaller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollens overordnede layout er vist i figur 2. Effekten af stråling og karakteriseringen på en dosisafhængig måde blev evalueret med følgende analyser.
Vurdering af røntgeninduceret toksicitet
Ved hjælp af et stereomikroskop blev følgende abnormiteter vurderet og karakteriseret efter lægemiddelbehandling og / eller stråling. I henhold til OECD-retningslinjerne 61 blev fire store apikale endepunkter, herunder koagulation af embryoner, deformiteter i somitdannelse, ikke-løsrivelse af halen fra æggeblommesækken og reduktion eller fravær af hjerteslag inkluderet for at analysere den samlede toksicitet61. Den akutte toksicitet blev bestemt på grundlag af et positivt resultat i nogen af ovennævnte abnormiteter. Ud over disse fire hovedendepunkter blev der også udført morfologisk observation for rygsøjle- eller halebøjning, hovedmisdannelse og mikrocefali, defekter i udvikling, perikardieødem, æggeblommesækdeformiteter, svømmeblæredeformiteter og ændringer i øjenstruktur (figur 3C og figur 4). Pointgivningen for radiotoksicitet kan baseres på overlevelsesprocenten og/eller scoren for forskellige morfologiske abnormiteter.
Overlevelsesprocent og overlevelseskurve
Overlevelsesprocenten blev beregnet ved at dividere det samlede antal levende embryoner med det samlede antal embryoner, der oprindeligt blev taget i en gruppe, og gange resultatet med 100 38,50,65. Derefter blev værdierne svarende til forskellige tidspunkter og forskellige eksperimentelle grupper plottet for at opnå overlevelseskurven. Denne undersøgelse viser overlevelseskurven for embryoner, der er bestrålet med 6 hkf (figur 3A).
Større abnormiteter forbundet med strålingsinduceret toksicitet (figur 3 og figur 4)
Kropskrumning og halebøjning
Dette er en af de mest almindelige parametre til vurdering af eventuelle toksicitetsinducerede deformiteter i zebrafiskembryoner 50,65,66. Kropskrumningsdeformiteter kan ses i forskellige mønstre, der spænder fra lave til moderate til svære, med bøjning i det posthepatiske haleområde eller i hovedkropsaksen eller endda med en helt halvcirkelformet rygsøjle eller mere end en bøjning i kropsaksen og i halen. Ved lavere strålingsdoser forekommer bøjningen muligvis ikke i alle embryoner, men kan udvikle sig i de fleste embryoner. Med en stigning i dosis øges sværhedsgraden af bøjning også og påvirker alle individer. I denne undersøgelse blev disse deformiteter observeret i embryoner behandlet med en 10 GY dosis stråling.
Perikardial og hjerteødem
Embryoner behandlet med toksiske eksponeringer som stråling og lægemidler ud over tolerable områder eller i toksiske doser udvikler også perikardieødem65,66. Embryoner udsat for røntgenstråling viser perikardie- og hjerteødem, hvor væske akkumuleres i perikardiehulen og hjertet, hvilket resulterer i et hævet perikardium og hjerte.
Æggeblomme ødem, fortykkelse af æggeblommen og æggeblomme sæk indsnævring
Efter røntgeneksponeringen ses æggeblommesækken i nogle fisk at være fortykket eller tilbageholdt, hvilket indebærer toksiciteten af røntgenstråling. I nogle tilfælde kan der også ses samlet æggeblommesækindsnævring, hvor æggeblommeforlængelsen er kort, eller ødemudvikling i æggeblommeområdet.
Reduktion i hovedstørrelse (mikrocefali)
Et forventet resultat af kraftig stråling er reduktionen i hovedets størrelse eller mikrocefali, som kan identificeres, når behandlede embryoner sammenlignes med embryonerne i kontrolgruppen.
Svømmeblære deformiteter
Efter bestråling ses svømmeblæren at være reduceret eller kompromitteret i nogle få embryoner, og svømmeblærens deformitet er større i tilfælde af embryoner, der udsættes for højere strålingsdoser, hvilket kan bidrage til lav bevægelse eller nedsat svømmeevne hos embryoner, der udsættes for høje røntgendoser.
Ændring i øjenstruktur
Stråling kan forårsage enorme DNA-skader og proteinændringer, som i sidste ende forårsager celledød og en reduktion i celleantal eller død af specifikke celletyper65. Øjet kan påvirkes af intense strålingsdoser, og lille øjenstørrelse og et fald i dets cellelag er blevet observeret55.
Hjerteslag pr. minut (bpm)
Hjerteslag pr. Minut blev talt ved at observere embryonerne under stereomikroskopet. Når strålingsdosis stiger, har bpm tendens til at falde (figur 3B). Fem larver blev anset for at beregne bpm på hvert tidspunkt pr. Gruppe. Et fald i antallet af hjerteslag kan indikere hjertedysfunktion66.
Ved hjælp af denne protokol var røntgenstrålingsdosis på 10 GY synligt toksisk i zebrafiskembryoner bestrålet med 6 hpf. I kontrolgruppen og embryoner eksponeret for 2 GY og 5 GY var der ingen signifikant død hos embryoner (figur 3A). På samme måde antydede antallet af hjerteslag pr. minut, at hjertefrekvensen faldt enormt med øgede doser røntgenstråling. I kontrolgruppen blev hjertefrekvensen set stige ved hvert 24 timers interval (figur 3B). På hvert tidspunkt faldt hjertefrekvensen imidlertid med en øget strålingsdosis. De embryoner, der blev udsat for 5 GY og 10 GY, viste imidlertid ingen signifikante forskelle før dag 5 efter befrugtning. Der er mistanke om alvorlig kardiovaskulær deformation hos embryoner, der udsættes for 15 GY- og 20 GY-stråling, da hjerteslaget faldt enormt (figur 3B). Som tidligere nævnt er forskellige fænotypiske og udviklingsmæssige defekter afbildet og evalueret for embryoner, der udsættes for forskellige strålingsdoser på forskellige tidspunkter (figur 3C og figur 4).
Figur 1: Stadier af zebrafiskens embryoudvikling. Repræsentative billeder af forskellige stadier af tidlig zebrafiskudvikling. Stadier op til 75% epiboly (8 hkf) er dækket. embryoner på skjoldstadiet 6 HPF (grøn farve) bruges til strålingsstandardisering. Skalabjælke = 276,4 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generel oversigt over protokollen . (A) Avl, indsamling af embryoner og iscenesættelse. (B) Eksperimentel opsætning: såning af embryoner i brøndplader og lægemiddelbehandling. C) embryoner af krævede stadier, der udsættes for stråling og fænotypiske ændringer observeret efter stråling. D) En oversigt over røntgenmaskinen og dens opsætning. (E) Observationer, dataindsamling og billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Virkning af forskellige doser røntgenbestråling på 6 hpf zebrafiskembryoner. (A) Overlevelseskurve, der viser den samlede overlevende fraktion af zebrafiskembryoner, der udsættes for individuelle strålingsdoser fra 2 GY til 20 GY. (B) Hjerteslag pr. minut af zebrafiskembryoner, der udsættes for forskellige doser røntgenstråling ved 6 hpf på efterfølgende befrugtningsdage. C) Repræsentative billeder af zebrafiskembryoner, der udsættes for forskellige strålingsdoser (fra 2 GY til 20 GY), bestrålet med 6 hpf. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentation af forskellige morfologiske abnormiteter på grund af strålingsinduceret toksicitet. A) A kontrollerer zebrafiskembryoner ved 72 hpf og B) udstrålede embryoner ved 72 hpf Det øverste embryo viser moderate deformiteter, mens det nedre embryo har alvorlige deformiteter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk bruges som værdifulde modeller i mange undersøgelser, herunder flere typer kræftforskning. Denne model giver en nyttig platform til storstilet lægemiddelscreening67,68. Som enhver anden toksicitetsevalueringsmetode er den kvantitative evaluering af de vigtigste biologiske ændringer ved stråling og/eller lægemiddelbehandling den mest afgørende del af denne protokol. I denne type undersøgelser må overlevelse ikke være det eneste kriterium for at observere toksicitet. Det skal understøttes med evaluering af fysiske eller udviklingsmæssige defekter ved hjælp af ordentlige scoringssystemer. Også i dette tilfælde er overlevelsen i embryoner op til 72 hpf ikke meget forskellig blandt de grupper, hvor embryoner udsættes for røntgenstrålingsdoser på 5 GY, 10 GY og 20 GY; Men når embryonernes overordnede morfologi og fænotyper kontrolleres ved disse særlige doser, er det klart, at røntgentoksiciteten er mere alvorlig, end den ser ud til gennem overlevelsesgrafen. Sværhedsgraden af morfologisk deformitet hos embryoner ved disse doser er meget høj, hvilket afspejler ændringer i deres samlede kropsstørrelse, defekter i udvikling, misdannelse af vitale organer og ændringer i deres samlede aktivitet. Selv i gruppen på 15 GY og 20 GY kan embryonerne ikke engang klækkes ud af deres chorion og udviser rigelige deformiteter på en dosisafhængig måde. For at vurdere virkningen af giftige stoffer, herunder meget dødelig røntgenstråling, skal scoringen af morfologiske, udviklingsmæssige og fysiologiske defekter derfor inkluderes på alle mulige måder, og det bør bruges til at evaluere den samlede respons af zebrafiskembryoner eller forskellige lægemidler, der administreres i løbet af eksperimentet.
Selv om der ikke findes nogen endelige scoringssystemer til specifik vurdering af radiotoksicitet i zebrafiskembryomodellen, er de samlede overlevelses- og/eller morfologiske ændringer som bøjning i kroppen, perikardieødem, ændringer i blommesækken, mikrocefali, ændringer i svømmeblæren og øjet, ændringer i hjerteslag og defekter i bevægelse blevet taget i betragtning i forskellige undersøgelser62. 63,64. Embryoners overlevelse kan evalueres ud fra hjerterytmen eller evalueringen af apikale endepunkter som beskrevet i OECD's retningslinjer. Samtidig kunne de morfologiske abnormiteter, der blev observeret i sådanne eksperimenter, scores individuelt; F.eks. er scoringen af halebøjning blevet vedtaget af flere efterforskere61.
Mens man arbejder med zebrafisk og udfører denne protokol, skal man være forsigtig med visse overvejelser. Disse omfatter avlsgruppen, som altid skal tilhøre samme stamme af fisk. Alle forsøg skal omfatte en foruddefineret stamme af zebrafiskembryon. En anden vigtig faktor er embryostadiet; Man skal være omhyggelig med det udviklingsstadium, hvor embryonerne bestråles, fordi en lille ændring i timingen eller stadiet vil føre til forskellige resultater. Nogle lægemidler kan påvirke udviklingen eller forårsage alvorlig skade på embryonerne, når de administreres på et tidligt udviklingsstadium, som 2 hpf. I så fald skal den korrekte subletale dosis af lægemidlet bestemmes, og derefter kan screeningen udføres.
Parametrene for røntgenbestråling skal være ensartede for alle udførte forsøg. De tre vigtige aspekter af en standard røntgenbestråling er filtertypen, strålingsdosis og bestrålingsmønster samt afstanden mellem røntgenkilden og objektet. Der er primært to typer filtre, der bruges til at generere røntgenstråler: aluminiumsfiltre og kobberfiltre; Imidlertid anvendes filtre med varierende kombinationer af kobber og aluminium eller andre metaller også til at generere røntgenstråler i andre tilfælde69. For zebrafiskembryoner bruges cupperfilteret her til at producere røntgenstråler. Afstanden fra røntgenkilden til forsøgsemnet betegnes som kilde til subjektafstand (SSD). I denne undersøgelse blev SSD'en indstillet til at være 50 cm. Røntgenstrålingen blev givet ved hjælp af et 0,3 mm Cu-filter. En enkelt eksponering af den ønskede dosis blev givet med en dosishastighed på 140,32 cGY/min inden for bølgelængdeområdet 0,01-10 nm. Før der udføres noget radiologisk forsøg, bør den strålingsdosis, der er egnet til forsøget og målet, standardiseres. Formålet med undersøgelsen, tidspunktet for bestråling og strålingsdosis er de tre vigtigste kriterier for standardisering af strålingsdosis. Tidspunktet for stråling vil omfatte både på hvilket stadium af embryoets udvikling strålingen skal gives, og den periode, hvor embryoet vil blive udsat for stråling af en bestemt dosis. Det er velkendt, at strålingens virkning maksimeres i tidlige udviklingsstadier. I denne protokol blev embryonerne bestrålet på et udviklingsstadium på 6 hpf med forskellige strålingsdoser (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY og 20 GY) og observeret i 5 dage efter befrugtning. Enhver afvigelse fra den sædvanlige protokol skal være klart defineret og standardiseret.
Denne model har flere fordele ved at studere effekten af radiosensibilisatorer eller beskyttere i en næsten langsgående undersøgelse, såsom evnen til at få flere embryoner fra individuel avl, at opdrætte hver uge fra en enkelt forældretank, at placere et betydeligt antal embryoner i eksperimentelle grupper, at observere fænotypiske virkninger i et par dage efter behandlingen, og for at se et spektrum af fænotypiske variabler efter behandlinger. Denne model kan afspejle virkningen af stråling næsten på alle systemer i embryoet, og flere lægemidler kan testes ad gangen i brøndpladeformater. Denne tilgang står dog også over for visse begrænsninger. For eksempel kan denne model ikke rekapitulere alle de deformiteter, der vises ved stråling hos højere dyr og mennesker. Derudover er mange proteinbaserede eller mekanistiske undersøgelser i disse fisk begrænsede på grund af problemer med reagenstilgængelighed, såsom med antistoffer. På trods af disse begrænsninger viser zebrafisken sig imidlertid at være en fremragende model for radiologiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke erklæret nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
SS's laboratorium og RKS's laboratorium finansieres af tilskud fra DBT og SERB, Indien. APM er modtager af ICMR-stipendiet, Indiens regering. DP er modtager af CSIR-stipendiet, Indiens regering. FN er modtager af DST-Inspire-stipendiet, Indiens regering. Figur 2 blev genereret ved hjælp af Biorender (https://biorender.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
References
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
- Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
- Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
- Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
- Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
- Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
- Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
- Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
- Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E.
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
- Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
- Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
- Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
- Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Garibaldi, C., et al.
- Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
- Citrin, D. E.
- Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
- Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
- Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
- Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
- Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
- Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S.
- Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
- Citrin, D. E.
- Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
- Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
- Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
- Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
- Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
- Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
- Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
- Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
- Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
- McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
- Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
- Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
- Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
- Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
- Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
- Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
- Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
- Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
- Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
- Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
- Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
- Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
- Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
- Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
- Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
- Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
- Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
- Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
- Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
- Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
- Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).
