Summary
De zebravis is onlangs gebruikt als model om potentiële stralingsmodificatoren te valideren. Het huidige protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo's te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om het effect van verschillende behandelingen en bestraling te evalueren.
Abstract
Zebravissen worden op grote schaal gebruikt in verschillende soorten onderzoek omdat ze een van de gemakkelijk te onderhouden gewervelde modellen zijn en verschillende kenmerken vertonen van een uniek en handig modelsysteem. Omdat zeer proliferatieve cellen gevoeliger zijn voor door straling geïnduceerde DNA-schade, zijn zebravisembryo's een eerstelijns in vivo model in stralingsonderzoek. Bovendien projecteert dit model het effect van straling en verschillende medicijnen binnen een korte tijd, samen met belangrijke biologische gebeurtenissen en bijbehorende reacties. Verschillende kankerstudies hebben zebravissen gebruikt en dit protocol is gebaseerd op het gebruik van stralingsmodificatoren in de context van radiotherapie en kanker. Deze methode kan gemakkelijk worden gebruikt om de effecten van verschillende geneesmiddelen op bestraalde en controlerende (niet-bestraalde) embryo's te valideren, waardoor geneesmiddelen worden geïdentificeerd als radiosensibiliserende of beschermende geneesmiddelen. Hoewel deze methodologie wordt gebruikt in de meeste experimenten met het screenen van geneesmiddelen, zijn de details van het experiment en de toxiciteitsbeoordeling met de achtergrond van blootstelling aan röntgenstraling beperkt of slechts kort behandeld, waardoor het moeilijk uit te voeren is. Dit protocol behandelt dit probleem en bespreekt de procedure en toxiciteitsevaluatie met een gedetailleerde illustratie. De procedure beschrijft een eenvoudige aanpak voor het gebruik van zebravisembryo's voor bestralingsstudies en op straling gebaseerde screening van geneesmiddelen met veel betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een bekend diermodel dat de afgelopen 3 decennia veel is gebruikt in onderzoek. Het is een kleine zoetwatervis die gemakkelijk te kweken en te kweken is onder laboratoriumomstandigheden. De zebravis is veelvuldig gebruikt voor diverse ontwikkelings- en toxicologische studies 1,2,3,4,5,6,7,8. De zebravis heeft een hoge vruchtbaarheid en een korte embryonale generatie; De embryo's zijn geschikt voor het volgen van verschillende ontwikkelingsstadia, zijn visueel transparant en zijn vatbaar voor variëteiten van genetische manipulatie en high-throughput screeningplatforms 9,10,11,12,13,14. Bovendien biedt de zebravis in toto en live beeldvorming waarvoor zijn ontwikkelingsproces en verschillende misvormingen in aanwezigheid van verschillende toxische stoffen of factoren gemakkelijk kunnen worden bestudeerd met behulp van stereo- of fluorescentiemicroscopie 7,15,16.
Radiotherapie is een van de belangrijkste therapeutische modi die worden gebruikt bij de behandeling van kanker 17,18,19,20,21,22,23,24. Radiotherapie bij kanker vereist echter potentiële radioprotectors om normale gezonde cellen te beschermen tegen afsterven terwijl kwaadaardige cellen worden gedood of om de menselijke gezondheid te beschermen tijdens therapie met hoogenergetische stralingen 25,26,27,28,29. Omgekeerd worden ook krachtige radiosensibilisatoren onderzocht om de efficiëntie van straling te verhogen om kwaadaardige cellen te doden, vooral bij gerichte en precisietherapieën30,31,32,33. Daarom is er veel vraag naar een model dat geschikt is voor het screenen van geneesmiddelen met een semi-hoge doorvoer en het meetbaar vertonen van stralingseffecten, om krachtige radioprotectors en sensibilisatoren te valideren. Verschillende beschikbare modellen worden gebruikt in stralingsstudies en zijn betrokken bij experimenten met het screenen van geneesmiddelen. Hogere gewervelde dieren en zelfs het meest gebruikte in vivo model, muizen, zijn echter niet geschikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen, omdat het tijdrovend, kostbaar en uitdagend is om dergelijke screeningsexperimenten met deze modellen te ontwerpen. Evenzo zijn celkweekmodellen ideaal voor variëteiten van high-throughput drug screening experimenten34,35. Experimenten met celkweek zijn echter niet altijd pragmatisch, zeer reproduceerbaar of betrouwbaar, aangezien cellen in kweek hun gedrag aanzienlijk kunnen veranderen afhankelijk van de groeiomstandigheden en kinetiek. Ook vertonen variëteiten van celtypen differentiële stralingssensibilisatie. Met name 2D- en 3D-celkweeksystemen vertegenwoordigen niet het hele organismescenario, en daarom is het mogelijk dat de verkregen resultaten het werkelijke niveau van radiotoxiciteit niet samenvatten36,37. In dit opzicht biedt de zebravis verschillende voordelen bij het screenen op nieuwe radiosensibilisatoren en radioprotectors. Het gebruiksgemak, de grote koppelingsgrootte, de korte levensduur, de snelle embryonale ontwikkeling, de transparantie van het embryo en de kleine lichaamsgrootte maken de zebravis tot een geschikt model voor grootschalige screening van geneesmiddelen. Vanwege de bovenstaande voordelen kunnen experimenten gemakkelijk in korte tijd worden herhaald en kan het effect gemakkelijk worden waargenomen onder een ontleedmicroscoop in platen met meerdere putten. Vandaar dat de zebravis aan populariteit wint in onderzoek naar geneesmiddelenscreening met stralingsstudies38,39.
Het potentieel van zebravissen als bonafide model om stralingsmodificatoren te screenen is aangetoond in verschillende studies 40,41,42,43,44,45. Het radioprotectieve effect van potentiële radiomodificatoren, zoals nanodeeltje DF1, amifostine (WR-2721), DNA-reparatie-eiwitten KU80 en ATM, en getransplanteerde hematopoëtische stamcellen, en de effecten van radiosensibilisatoren, zoals flavopiridol en AG1478, in het zebravismodel zijn gerapporteerd 19,41,42,43,44,45,46 . Met behulp van hetzelfde systeem werd het radioprotectieve effect van DF-1 (fullereen nanodeeltje) zowel op systemisch als op orgaanspecifiek niveau beoordeeld, en ook het gebruik van zebravisembryo's voor screening van radioprotectoren werd verder onderzocht47. Onlangs werd de Kelulut-honing gerapporteerd als een radioprotector in zebravisembryo's en bleek de overleving van embryo's te verhogen en orgaanspecifieke schade, cellulaire DNA-schade en apoptose te voorkomen.
Evenzo werden de radioprotectieve effecten van polymeren die via de reactie van Hantzsch werden gegenereerd, gecontroleerd op zebravisembryo's in een high-throughput screening, en de bescherming werd voornamelijk verleend door cellen te beschermen tegen DNA-schade49. In een van de eerdere studies werd de lipofiele statine fluvastatine gevonden als een potentiële radiosensibilisator met behulp van het zebravismodel met deze benadering50. Evenzo worden gouden nanodeeltjes beschouwd als een ideale radiosensibilisator en zijn ze in veel onderzoeken gebruikt51,52.
De embryonale ontwikkeling bij zebravissen omvat splitsing in de eerste 3 uur waarin een eencellige zygote zich deelt om 2 cellen, 4 cellen, 8 cellen, 16 cellen, 32 cellen en 64 cellen te vormen die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd met een stereomicroscoop. Vervolgens bereikt het het blastula-stadium met 128 cellen (2,25 uur na de bevruchting, hpf), waarbij de cellen elke 15 minuten verdubbelen en de volgende fasen doorlopen: 256 cellen (2,5 hpf), 512 cellen (2,75 hpf) en het bereiken van 1.000+ cellen in slechts 3 uur (Figuur 1). Na 4 uur bereikt het ei het bolstadium, gevolgd door de vorming van een koepelvorm in de embryonale massa 7,53,54. De gastrulatie bij zebravissen begint vanaf 5,25 hpf54, waar het het schildstadium bereikt. Het schild geeft duidelijk de snelle convergentiebeweging van de cellen naar één kant van de kiemring aan (Figuur 1) en is een prominente en duidelijke fase van gastrulerende embryo's die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd53,54. Hoewel blootstelling aan straling van embryo's in elk stadium van hun ontwikkeling kan plaatsvinden, kan blootstelling aan straling tijdens gastrulatie meer duidelijke morfologische veranderingen ondergaan die een betere uitlezing van door straling geïnduceerde toxiciteiten mogelijk maken55; Evenzo kan de toediening van geneesmiddelen aan embryo's al vanaf 2 HPF54 worden gestart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie werd uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van en volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Al het onderhoud en de kweek van zebravissen werden uitgevoerd in een omringende viskweekfaciliteit bij 28,5 °C, en de embryo's werden bewaard in een incubator voor biologisch zuurstofverbruik (BZV) bij een temperatuur van 28,5 °C. Hier werd de zebravis AB-stam gebruikt en werd de enscenering uitgevoerd volgens Kimmel et al.54. Röntgenstraling werd gegeven bij 6 hpf (schildstadium) en verschillende fenotypes werden waargenomen tot 120 hpf.
1. Fokopstelling en embryocollectie
- Stel de kweekbakken in (gemaakt van polycarbonaat, inhoud 1 L, zie Materiaaltabel). Giet systeemwater (pH, 6,8-7,5; geleidbaarheid, 500 μS; en temperatuur, 28,5 °C) in de kweekbakken en bedek bijna 40% van het volume. Plaats de verdeler in de tank om twee kamers te creëren, een voor vrouwtjes en de andere voor mannetjes.
- Verzamel voorzichtig twee gezonde vrouwtjes en een gezond mannetje uit de ouderaquaria met behulp van een net, zet ze in hun respectievelijke helften en houd ze een nacht in het donker (minimaal 10 uur) bij 28,5 °C.
- Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand en laat de vissen paren zonder de kweektanks te verstoren.
OPMERKING: De vrouwtjes beginnen te paaien en de eieren zullen op de bodem van het aquarium liggen binnen 10-15 minuten nadat de vissen hebben mogen paren56,57,58. - Zet de vissen na het paaien terug in hun aquarium, verzamel de embryo's uit het kweekaquarium met behulp van een zeef, was ze goed met het systeemwater en bewaar de verzamelde eieren in een petriplaat met E-3-media (4,94 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,43 mM CaCl 2, 0,85 mM MgCl2-zouten, 1% m/v methyleenblauw, zie Tabel met materialen).
- Observeer de eieren onder een ontleedmicroscoop, verwijder de onbevruchte of dode embryo's met een pasteurpipet en bewaar de petriplaten met bevruchte eieren in het E-3-medium bij 28,5 °C in een broedmachine voor een goede groei en onderhoud.
OPMERKING: Onbevruchte eieren kunnen worden geïdentificeerd met een melkwit uiterlijk met een gestold chorion of met gescheurde cellen in het chorion. Samen met onbevruchte eieren moeten eieren die geen splitsing ondergaan en eieren met misvormingen zoals onregelmatigheden tijdens de splitsing, bijv. asymmetrie, blaasjesvorming of verwondingen van het chorion, of die zich niet actief ontwikkelen, worden weggegooid om de verzamelde embryo's gezond te houden en om de media schoon te houden 7,56.
2. Toezicht op embryo's en selectie voor stralingsexperimenten
- Bewaak de groeiende embryo's onder de ontleedmicroscoop, identificeer het juiste stadium 7,54 en verwijder eventuele dode of ongezonde embryo's. Zorg voor een adequate stadiëring van het embryo, aangezien de bestralings- en medicijndoses in een bepaald gastrulatiestadium worden gegeven.
OPMERKING: Controleer elke dag het niveau en de kwaliteit van de media in de kweekschalen. Vervang de media elke 24 uur, samen met het verwijderen van dode embryo's. Pasteurpipetten worden bij voorkeur gebruikt voor het plukken van embryo's of het wisselen van media. - Voordat u met het experiment begint, verdeelt u de gezonde embryo's voorzichtig in de proefplaten met behulp van een pasteurpipet. Neem voor elke experimentele groep 15-20 embryo's.
OPMERKING: Plaats alleen gezonde embryo's van de gewenste ontwikkelingsstadia in de experimentele plaat. Stel dat de medicamenteuze behandeling moet worden gedaan met embryo's van 6 hpf, en begin ze dan minstens 30-60 minuten eerder in experimentele platen te zaaien.
3. Medicamenteuze behandeling
- Voeg medicijnen met de gewenste concentratie toe aan de zebravisembryo's. Bereid de medicijnbevattende E-3-media ruim van tevoren voor. Zorg ervoor dat de standaardoplossing van het medicijn geen onopgelost medicijn bevat voordat u de werkmedia voorbereidt voor de behandeling van zebravisembryo's.
- Voordat u een geneesmiddel toevoegt aan een medium voor stralingsscreening, moet u het cytotoxische effect van het geneesmiddel controleren met de concentratiegraden van het geneesmiddel. Volg de OESO-richtlijnen om de LC 50 van de geneesmiddelen te evalueren die worden geëvalueerd 59,60,61.
NOTITIE: Wees voorzichtig bij het verplaatsen van de borden en schalen tijdens de bestralings- of observatietijd. Er is veel kans dat de platen tijdens deze behandeling worden verstoord, waardoor de media uit de putten lekken of de embryo's uit hun respectievelijke putten morsen, waardoor nabijgelegen putten mogelijk worden verontreinigd en het experiment wordt verpest.
4. Röntgenstraling
- Neem bij het opzetten van een stralingsexperiment een controlegroep/niet-bestraalde groep en een groep met alleen straling op. Neem op dezelfde manier bij het uitvoeren van een drugsscreening een andere groep op waar de medicijnen zullen worden toegediend met dezelfde concentratie als die welke in het screeningsexperiment samen met straling worden toegediend.
NOTITIE: Label zowel het deksel als de bodem van putborden of kweekschalen, zodat de deksels niet misplaatst raken. - Verdeel de embryo's in een putplaat als de stralingsschilden de extra putjes kunnen bedekken en beschermen tegen straling terwijl de andere putjes worden blootgesteld aan een bepaalde stralingsdosis; Gebruik anders individuele platen of schijven om de embryo's per stralingsdosis te zaaien.
- Schakel de röntgenbestralingsmachine in (zie Materiaaltabel) en start de initialisatie en het opwarmen van de machine.
NOTITIE: De waarde van de afstand tussen bron en onderwerp (SSD) moet 50 cm zijn; men kan weer verschillende SSD's gebruiken, wat standaardisatie vereist. - Plaats de experimentele plaat onder de bestraling in de machine in het midden, zorg ervoor dat de plaat zich direct onder de röntgenbron bevindt, stel vervolgens de dosis in (bijv. 5 GY) en start de röntgenfoto.
NOTITIE: Sluit de platen af met paraffinefolie om ongewenst morsen of verontreiniging te voorkomen tijdens het transport van de platen van de couveuse naar de bestraling en terug. - Verwijder na voltooiing van de bestraling de platen, sluit het machineprogramma af, schakel de machine uit en controleer de platen onmiddellijk na bestraling onder de microscoop. Verwijder de dode embryo's en plaats de platen terug in de incubator bij 28,5 °C. Noteer het aantal dode embryo's nadat u ze onder de ontleedmicroscoop hebt geëvalueerd.
OPMERKING: Bestraal de verschillende groepen embryo's met aangewezen stralingsdoses zonder veel vertraging tussen de afzonderlijke groepen, aangezien het effect van de bestraling aanzienlijk kan worden beïnvloed door het verschil in het ontwikkelingsstadium.
LET OP: Neem tijdens het gebruik van het röntgenapparaat de juiste beschermende maatregelen.
5. Gegevensverzameling, beeldvorming en analyse
- Verzamel gegevens met vooraf bepaalde tijdsintervallen, zoals elke 24 uur nadat de bestraling is gegeven. Noteer alle mogelijke waarnemingen zoals overleving, uitkomstefficiëntie, ontwikkelingsstadium, aantal hartslagen, kromming van lichaam en staart, pericardiaal oedeem, de verlenging van de dooierzak, microcefalie, ontwikkeling van de zwemblaas, algemene beweeglijkheid of activiteit, enz.62,63,64.
- Om afbeeldingen vast te leggen, kiest u representatieve embryo's op een schoon objectglaasje, controleert u de embryo's onder de microscoop, oriënteert u ze in een bepaalde richting en klikt u op afbeeldingen. Hernoem de afbeeldingsbestanden op basis van de groep en tijd.
NOTITIE: Dezelfde vergroting en verlichting moeten worden gebruikt bij het maken van foto's met verschillende tijdsintervallen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene lay-out van het protocol is weergegeven in figuur 2. Het effect van straling en de dosisafhankelijke karakterisering werd geëvalueerd met de volgende analyses.
Beoordeling van door röntgenstraling geïnduceerde toxiciteiten
Met behulp van een stereomicroscoop werden de volgende afwijkingen beoordeeld en gekarakteriseerd na de medicamenteuze behandeling en/of bestraling. Volgens de OESO-richtlijnen 61 werden voor toxiciteitsevaluatie bij vissen vier belangrijke apicale eindpunten, waaronder de coagulatie van embryo's, misvormingen in de vorming van somiet, het niet loskomen van de staart van de dooierzak en vermindering of afwezigheid van de hartslag, opgenomen om de algehele toxiciteit te analyseren61. De acute toxiciteit werd bepaald op basis van een positief resultaat bij een van de bovenstaande afwijkingen. Naast deze vier belangrijke eindpunten werden ook morfologische observaties uitgevoerd voor het buigen van de wervelkolom of de staart, misvorming van het hoofd en microcefalie, ontwikkelingsdefecten, pericardiaal oedeem, misvormingen van de dooierzak, misvormingen van de zwemblaas en veranderingen in de oogstructuur (Figuur 3C en Figuur 4). De score voor de radiotoxiciteit kan gebaseerd zijn op het overlevingspercentage en/of de score van verschillende morfologische afwijkingen.
Overlevingspercentage en overlevingscurve
Het overlevingspercentage werd berekend door het totale aantal levende embryo's te delen door het totale aantal embryo's dat aanvankelijk in een groep was genomen en het resultaat te vermenigvuldigen met 100 38,50,65. Vervolgens werden de waarden die overeenkwamen met verschillende tijdstippen en verschillende experimentele groepen uitgezet om de overlevingscurve te verkrijgen. Deze studie geeft de overlevingscurve voor embryo's die zijn doorstraald met 6 hpf (figuur 3A).
Ernstige afwijkingen geassocieerd met stralingsgeïnduceerde toxiciteit (Figuur 3 en Figuur 4)
Kromming van het lichaam en buiging van de staart
Dit is een van de meest voorkomende parameters om eventuele door toxiciteit veroorzaakte misvormingen in zebravisembryo'ste beoordelen 50,65,66. Vervormingen van de lichaamskromming zijn te zien in verschillende patronen, variërend van laag tot matig tot ernstig, met buiging in het post-hepatische staartgebied of in de hoofdas van het lichaam of zelfs met een volledig halfcirkelvormige wervelkolom of meer dan één buiging in de lichaamsas en in de staart. Bij lagere stralingsdoses is het mogelijk dat de buiging niet in alle embryo's optreedt, maar zich in de meeste embryo's kan ontwikkelen. Met een verhoging van de dosis neemt ook de ernst van het buigen toe en treft het alle individuen. In deze studie werden deze misvormingen waargenomen in de embryo's die werden behandeld met een stralingsdosis van 10 GY.
Pericardiaal en hartoedeem
Embryo's die worden behandeld met toxische blootstellingen zoals straling en medicijnen buiten het aanvaardbare bereik of in toxische doses, ontwikkelen ook pericardiaal oedeem65,66. Embryo's die worden blootgesteld aan röntgenstraling vertonen pericardiaal en hartoedeem, waarbij vocht zich ophoopt in de pericardiale holte en het hart, wat resulteert in een gezwollen hartzakje en hart.
Dooierzakoedeem, verdikking van de dooier en vernauwing van de dooierzak
Na de blootstelling aan röntgenstraling wordt gezien dat de dooierzak bij sommige vissen verdikt of vastgehouden is, wat de toxiciteit van röntgenstraling impliceert. In sommige gevallen kan ook algehele vernauwing van de dooierzak, waarbij de dooierverlenging kort is, of oedeemontwikkeling in het dooiergebied worden gezien.
Vermindering van de hoofdomvang (microcefalie)
Een verwacht resultaat van zware straling is de vermindering van de grootte van het hoofd, of microcefalie, die kan worden geïdentificeerd wanneer behandelde embryo's worden vergeleken met de embryo's in de controlegroep.
Misvormingen van de zwemblaas
Na bestraling wordt bij enkele embryo's gezien dat de zwemblaas is verminderd of aangetast, en de misvorming van de zwemblaas is groter in het geval van embryo's die worden blootgesteld aan hogere stralingsdoses, wat kan bijdragen aan de lage voortbeweging of verminderde zwemvaardigheid bij embryo's die zijn blootgesteld aan hoge röntgendoses.
Verandering in oogstructuur
Straling kan enorme DNA-schade en eiwitveranderingen veroorzaken, die uiteindelijk leiden tot celdood en een vermindering van het aantal cellen of de dood van specifieke celtypen65. Het oog kan worden aangetast door intense stralingsdoses, en kleine ooggrootte en een afname van de cellagen zijn waargenomen55.
Hartslagen per minuut (bpm)
De hartslagen per minuut werden geteld door de embryo's onder de stereomicroscoop te observeren. Naarmate de stralingsdosis toeneemt, neemt de bpm af (figuur 3B). Vijf larven werden beschouwd om bpm te berekenen op elk tijdstip per groep. Een afname van het aantal hartslagen kan duiden op hartdisfunctie66.
Met behulp van dit protocol was de röntgenstralingsdosis van 10 GY zichtbaar toxisch in zebravisembryo's die met 6 hpf waren bestraald. In de controlegroep en embryo's die werden blootgesteld aan 2 GY en 5 GY, was er geen significante sterfte in embryo's (figuur 3A). Evenzo suggereerde het aantal hartslagen per minuut dat de hartslag enorm daalde met verhoogde doses röntgenstraling. In de controlegroep werd gezien dat de hartslag om de 24 uur toenam (figuur 3B). Op elk tijdstip nam de hartslag echter af met een verhoogde stralingsdosis. De embryo's die werden blootgesteld aan 5 GY en 10 GY vertoonden echter geen significante verschillen tot dag 5 na de bevruchting. Ernstige cardiovasculaire vervorming wordt vermoed bij embryo's die zijn blootgesteld aan 15 GY en 20 GY straling, aangezien de hartslag enorm daalde (Figuur 3B). Zoals eerder besproken, worden verschillende fenotypische en ontwikkelingsstoornissen afgebeeld en geëvalueerd voor embryo's die op verschillende tijdstippen zijn blootgesteld aan verschillende stralingsdoses (Figuur 3C en Figuur 4).
Figuur 1: Stadia van de ontwikkeling van zebravisembryo's. Representatieve beelden van verschillende stadia van de vroege ontwikkeling van zebravissen. Stadia tot 75% epiboly (8 hpf) worden gedekt. Embryo's in het schildstadium; 6 HPF (groene kleur) wordt gebruikt voor stralingsstandaardisatie. Schaalbalk = 276,4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Algemene schets van het protocol . (A) Fokken, verzamelen van embryo's en enscenering. (B) Experimentele opzet: het zaaien van embryo's in putplaten en medicamenteuze behandeling. (C) Embryo's van vereiste stadia die zijn blootgesteld aan straling en fenotypische veranderingen die zijn waargenomen na bestraling. (D) Een schets van het röntgenapparaat en de opstelling ervan. (E) Observaties, gegevensverzameling en beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van verschillende doses röntgenstraling op 6 hpf-zebravisembryo's . (A) Overlevingscurve met de totale overlevende fractie van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan individuele stralingsdoses van 2 GY tot 20 GY. (B) Hartslag per minuut van zebravisembryo's die op de daaropvolgende dagen van de bevruchting zijn blootgesteld aan verschillende doses röntgenstraling bij 6 hpf. (C) Representatieve beelden van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan verschillende stralingsdoses (van 2 GY tot 20 GY), bestraald met 6 hpf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Weergave van verschillende morfologische afwijkingen als gevolg van stralingsgeïnduceerde toxiciteit. (A) A controle zebravisembryo's op 72 hpf en (B) bestraalde embryo's op 72 hpf; Het bovenste embryo vertoont matige misvormingen, terwijl het onderste embryo ernstige misvormingen heeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravissen worden gebruikt als waardevolle modellen in veel onderzoeken, waaronder verschillende soorten kankeronderzoek. Dit model biedt een bruikbaar platform voor grootschalige drugsscreening67,68. Net als elke andere methode voor de evaluatie van de toxiciteit, is de kwantitatieve evaluatie van de belangrijkste biologische veranderingen bij bestraling en/of medicamenteuze behandeling het meest cruciale onderdeel van dit protocol. In dit soort studies mag overleving niet het enige criterium zijn om toxiciteit waar te nemen; Het moet worden ondersteund bij de evaluatie van fysieke of ontwikkelingsstoornissen door middel van de juiste scoresystemen. Ook in dit geval, tot 72 hpf, verschilt de overleving in embryo's niet veel tussen de groepen waarin embryo's worden blootgesteld aan röntgenstralingsdoses van 5 GY, 10 GY en 20 GY; Wanneer echter de algehele morfologie en fenotypes van de embryo's bij deze specifieke doses worden gecontroleerd, is het duidelijk dat de röntgentoxiciteit ernstiger is dan het lijkt op basis van de overlevingsgrafiek. De ernst van morfologische misvorming bij embryo's bij deze doses is zeer hoog, als gevolg van veranderingen in hun totale lichaamsgrootte, defecten in ontwikkeling, de misvorming van vitale organen en veranderingen in hun algehele activiteit. Zelfs in de groep van 15 GY en 20 GY kunnen de embryo's niet eens uit hun chorion komen en vertonen ze op een dosisafhankelijke manier ruime misvormingen. Voor het evalueren van het effect van toxische stoffen, waaronder zeer fatale röntgenstraling, moet dus op alle mogelijke manieren rekening worden gehouden met het scoren van morfologische, ontwikkelings- en fysiologische defecten, en dat moet worden gebruikt om de algehele respons van zebravisembryo's of verschillende geneesmiddelen die in de loop van het experiment worden toegediend, te evalueren.
Hoewel er geen definitieve scoresystemen zijn om radiotoxiciteit specifiek in het zebravisembryomodel te evalueren, is in verschillende onderzoeken rekening gehouden met de algehele overleving en/of morfologische veranderingen zoals buiging in het lichaam, pericardiaal oedeem, veranderingen in de dooierzak, microcefalie, veranderingen in de zwemblaas en het oog, veranderingen in de hartslag en defecten in de voortbeweging62, 63,64. De overleving van embryo's kan worden geëvalueerd op basis van de hartslag of de evaluatie van apicale eindpunten zoals beschreven in OESO-richtlijnen. Tegelijkertijd konden de morfologische afwijkingen die in dergelijke experimenten werden waargenomen, individueel worden gescoord; Het scoren van staartbuiging is bijvoorbeeld door meerdere onderzoekers overgenomen61.
Bij het werken met zebravissen en het uitvoeren van dit protocol moet men voorzichtig zijn met bepaalde overwegingen. Deze omvatten de kweekgroep, die altijd tot dezelfde vissoort moet behoren. Alle experimenten moeten betrekking hebben op één vooraf bepaalde stam van zebravisembryo's. Een andere belangrijke factor is het embryonale stadium; Men moet nauwgezet zijn met het ontwikkelingsstadium waarin de embryo's worden bestraald, omdat een kleine verandering in de timing of het stadium tot andere resultaten zal leiden. Sommige geneesmiddelen kunnen de ontwikkeling beïnvloeden of ernstige schade aan de embryo's veroorzaken wanneer ze in een vroeg stadium van ontwikkeling worden toegediend, zoals 2 hpf. In dat geval moet de juiste subletale dosis van het medicijn worden bepaald en kan de screening worden uitgevoerd.
De röntgenstralingsparameters moeten voor alle uitgevoerde experimenten uniform zijn. De drie belangrijke aspecten van een standaard röntgenstraler zijn het filtertype, de stralingsdosis en het bestralingspatroon en de afstand tussen de röntgenbron en het object. Er zijn voornamelijk twee soorten filters die worden gebruikt om röntgenstralen te genereren: aluminium filters en koperen filters; filters met verschillende combinaties van koper en aluminium of andere metalen worden echter ook gebruikt om röntgenstralen te genereren, in andere gevallen69. Voor zebravisembryo's wordt hier het koperfilter gebruikt om röntgenstralen te produceren. De afstand van de röntgenbron tot de proefpersoon wordt de afstand tussen bron en onderwerp (SSD) genoemd. In dit onderzoek werd de SSD ingesteld op 50 cm. De röntgenstraling werd toegediend met behulp van een 0,3 mm Cu-filter. Een eenmalige blootstelling van de gewenste dosis werd gegeven met een dosistempo van 140,32 cGY/min binnen het golflengtebereik van 0,01-10 nm. Alvorens een radiologisch experiment uit te voeren, moet de stralingsdosis die geschikt is voor het experiment en het doel worden gestandaardiseerd. Het doel van het onderzoek, het tijdstip van de bestraling en de stralingsdosis zijn de drie belangrijkste criteria voor de standaardisatie van de stralingsdosis. Het tijdstip van de bestraling omvat zowel in welk stadium van de ontwikkeling van het embryo de bestraling moet worden toegediend als de periode waarin het embryo zal worden blootgesteld aan straling van een bepaalde dosis. Het is algemeen bekend dat in de vroege ontwikkelingsstadia het effect van straling maximaal is. In dit protocol werden de embryo's bestraald in een ontwikkelingsstadium van 6 hpf met verschillende stralingsdoses (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY en 20 GY) en gedurende 5 dagen na de bevruchting geobserveerd. Elke afwijking van het gebruikelijke protocol moet duidelijk worden gedefinieerd en gestandaardiseerd.
Dit model heeft verschillende voordelen voor het bestuderen van het effect van radiosensibilisatoren of beschermers in een bijna longitudinale studie, zoals de mogelijkheid om meerdere embryo's uit individuele kweek te verkrijgen, om elke week te fokken uit een enkele oudertank, om een aanzienlijk aantal embryo's in experimentele groepen te plaatsen, om fenotypische effecten te observeren in een paar dagen na de behandeling, en om een spectrum van fenotypische variabelen te zien na behandelingen. Dit model kan de impact van straling op bijna alle systemen van het embryo weerspiegelen, en meerdere medicijnen kunnen tegelijkertijd worden getest in well-plate-formaten. Deze aanpak kent echter ook bepaalde beperkingen. Dit model kan bijvoorbeeld niet alle misvormingen samenvatten die door stralingen bij hogere dieren en mensen worden vertoond. Bovendien zijn veel op eiwitten gebaseerde of mechanistische studies bij deze vissen beperkt vanwege problemen met de beschikbaarheid van reagens, zoals met antilichamen. Ondanks deze beperkingen blijkt de zebravis echter een uitstekend model te zijn voor radiologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Het lab van SS en het lab van RKS worden gefinancierd door subsidies van DBT en SERB, India. APM is een ontvanger van de ICMR-fellowship, Government of India. DP is een ontvanger van de CSIR-fellowship, Government of India. De VN is een ontvanger van de DST-Inspire-fellowship, regering van India. Figuur 2 is gegenereerd met behulp van Biorender (https://biorender.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
References
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
- Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
- Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
- Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
- Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
- Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
- Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
- Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
- Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E.
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
- Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
- Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
- Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
- Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Garibaldi, C., et al.
- Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
- Citrin, D. E.
- Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
- Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
- Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
- Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
- Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
- Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S.
- Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
- Citrin, D. E.
- Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
- Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
- Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
- Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
- Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
- Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
- Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
- Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
- Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
- McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
- Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
- Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
- Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
- Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
- Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
- Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
- Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
- Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
- Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
- Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
- Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
- Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
- Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
- Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
- Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
- Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
- Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
- Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
- Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
- Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
- Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).
