Summary
Zebra balığı son zamanlarda potansiyel radyasyon değiştiricilerini doğrulamak için bir model olarak kullanılmıştır. Mevcut protokol, radyasyona dayalı tarama deneyleri için zebra balığı embriyolarını kullanmanın ayrıntılı adımlarını ve farklı tedavilerin ve radyasyonun etkisini değerlendirmek için bazı gözlemsel yaklaşımları açıklamaktadır.
Abstract
Zebra balıkları, bakımı kolay omurgalı modellerinden biri oldukları ve benzersiz ve kullanışlı bir model sisteminin çeşitli özelliklerini sergiledikleri için çeşitli araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek oranda proliferatif hücreler radyasyona bağlı DNA hasarına karşı daha duyarlı olduklarından, zebra balığı embriyoları radyasyon araştırmalarında in vivo modelde ön saflarda yer almaktadır. Ayrıca bu model, radyasyon ve farklı ilaçların etkisini, büyük biyolojik olaylar ve ilişkili tepkilerle birlikte kısa sürede yansıtmaktadır. Birkaç kanser çalışması zebra balığı kullanmıştır ve bu protokol, radyoterapi ve kanser bağlamında radyasyon değiştiricilerin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntem, farklı ilaçların ışınlanmış ve kontrol (ışınlanmamış) embriyolar üzerindeki etkilerini doğrulamak için kolayca kullanılabilir, böylece ilaçları radyo duyarlılaştırıcı veya koruyucu ilaçlar olarak tanımlar. Bu metodoloji çoğu ilaç tarama deneyinde kullanılmasına rağmen, deneyin ayrıntıları ve X-ışını radyasyonuna maruz kalmanın arka planı ile toksisite değerlendirmesi sınırlıdır veya sadece kısaca ele alınmaktadır, bu da gerçekleştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bu protokol bu sorunu ele alır ve prosedür ve toksisite değerlendirmesini ayrıntılı bir örnekle tartışır. Prosedür, zebra balığı embriyolarının radyasyon çalışmaları ve radyasyona dayalı ilaç taraması için çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kullanılması için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio), son 3 yılda araştırmalarda yaygın olarak kullanılan iyi bilinen bir hayvan modelidir. Laboratuvar koşullarında yetiştirilmesi ve üremesi kolay olan küçük bir tatlı su balığıdır. Zebra balığı, çeşitli gelişimsel ve toksikolojik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebra balığı yüksek doğurganlığa ve kısa embriyonik üretime sahiptir; Embriyolar farklı gelişim aşamalarını izlemek için uygundur, görsel olarak şeffaftır ve genetik manipülasyon çeşitlerine ve yüksek verimli tarama platformlarınauygundur 9,10,11,12,13,14. Ayrıca, zebra balığı, gelişim sürecinin ve çeşitli toksik maddelerin veya faktörlerin varlığında farklı deformitelerin stereo veya floresan mikroskopi 7,15,16 kullanılarak kolayca incelenebildiği toto ve canlı görüntüleme sağlar.
Radyoterapi, kanser tedavisinde kullanılan başlıca terapötik modlardan biridir 17,18,19,20,21,22,23,24. Bununla birlikte, kanser radyoterapisi, kötü huylu hücreleri öldürürken normal sağlıklı hücrelerin ölmesini önlemek veya yüksek enerjili radyasyonlar içeren tedavi sırasında insan sağlığını korumak için potansiyel radyoprotektörler gerektirir 25,26,27,28,29. Tersine, özellikle hedefli ve hassas tedavilerde kötü huylu hücreleri öldürmek için radyasyonun etkinliğini artırmak için güçlü radyosensitizörler de araştırılmaktadır30,31,32,33. Bu nedenle, güçlü radyoprotektörleri ve hassaslaştırıcıları doğrulamak için, yarı yüksek verimli ilaç taraması için uygun ve ölçülebilir radyasyon etkileri sergileyen bir model şiddetle talep edilmektedir. Radyasyon çalışmalarında mevcut birkaç model kullanılır ve ilaç tarama deneylerinde yer alır. Bununla birlikte, daha yüksek omurgalılar ve hatta en yaygın olarak kullanılan in vivo model olan fareler, büyük ölçekli ilaç taraması için uygun değildir, çünkü bu modellerle bu tür tarama deneylerini tasarlamak zaman alıcı, maliyetli ve zordur. Benzer şekilde, hücre kültürü modelleri, yüksek verimli ilaç tarama deneylerinin çeşitleri için idealdir34,35. Bununla birlikte, hücre kültürünü içeren deneyler her zaman pragmatik, yüksek oranda tekrarlanabilir veya güvenilir değildir, çünkü kültürdeki hücreler büyüme koşullarına ve kinetiğine göre davranışlarını önemli ölçüde değiştirebilir. Ayrıca, hücre tiplerinin çeşitleri diferansiyel radyasyon duyarlılığı gösterir. Özellikle, 2D ve 3D hücre kültürü sistemleri tüm organizma senaryosunu temsil etmez ve bu nedenle elde edilen sonuçlar gerçek radyotoksisiteseviyesini özetlemeyebilir 36,37. Bu bağlamda, zebra balığı yeni radyosensitizörler ve radyoprotektörler için taramada çeşitli avantajlar sağlar. Kullanım kolaylığı, büyük kavrama boyutu, kısa ömür, hızlı embriyonik gelişim, embriyo şeffaflığı ve küçük vücut boyutu, zebra balığını büyük ölçekli ilaç taraması için uygun bir model haline getirir. Yukarıdaki avantajlardan dolayı, deneyler kısa sürede kolayca tekrarlanabilir ve etki, çok kuyulu plakalarda diseksiyon mikroskobu altında kolayca gözlemlenebilir. Bu nedenle, zebra balığı, radyasyon çalışmalarını içeren ilaç tarama araştırmalarında popülerlik kazanmaktadır38,39.
Zebra balığının iyi niyetli bir model olarak radyasyon değiştiricileri tarama potansiyeli çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir40,41,42,43,44,45. Zebra balığı modelinde nanopartikül DF1, amifostin (WR-2721), DNA onarım proteinleri KU80 ve ATM gibi potansiyel radyo değiştiricilerin ve nakledilen hematopoietik kök hücrelerin radyoprotektif etkisi ve flavopiridol ve AG1478 gibi radyoduyarlılaştırıcıların etkileri bildirilmiştir 19,41,42,43,44,45,46 . Aynı sistem kullanılarak, DF-1'in (fulleren nanopartikül) radyoprotektif etkisi hem sistemik hem de organa özgü seviyelerde değerlendirildi ve ayrıca zebra balığı embriyolarının radyoprotektör taraması için kullanımı daha da araştırıldı47. Son zamanlarda, Kelulut balının zebra balığı embriyolarında bir radyoprotektör olduğu bildirildi ve embriyo sağkalımını arttırdığı ve organa özgü hasarı, hücresel DNA hasarını ve apoptozu önlediği bulundu48.
Benzer şekilde, Hantzsch reaksiyonu yoluyla üretilen polimerlerin radyoprotektif etkileri, yüksek verimli bir taramada zebra balığı embriyoları üzerinde kontrol edildi ve koruma esas olarak hücrelerin DNA hasarındankorunmasıyla sağlandı 49. Önceki çalışmalardan birinde, lipofilik statin fluvastatin, bu yaklaşımla zebra balığı modeli kullanılarak potansiyel bir radyosensitizör olarak bulundu50. Benzer şekilde, altın nanopartiküller ideal bir radyosensitizör olarak kabul edilir ve birçok çalışmada kullanılmıştır51,52.
Zebra balıklarındaki embriyonik gelişim, tek hücreli bir zigotun stereomikroskopla kolayca tanımlanabilen 2 hücre, 4 hücre, 8 hücre, 16 hücre, 32 hücre ve 64 hücre oluşturmak üzere bölündüğü ilk 3 saatte bölünmeyi içerir. Daha sonra, hücrelerin her 15 dakikada bir ikiye katlandığı ve aşağıdaki aşamalardan geçtiği 128 hücre (döllenme sonrası 2.25 saat, hpf) ile blastula aşamasına ulaşır: 256 hücre (2.5 hpf), 512 hücre (2.75 hpf) ve sadece 3 saatte 1.000+ hücreye ulaşır (Şekil 1). 4 saatte, yumurta küre aşamasına ulaşır, ardındanembriyonik kütle 7,53,54'te bir kubbe şekli oluşur. Zebra balığında gastrulasyon, kalkan aşamasına ulaştığı 5.25 hpf54'ten başlar. Kalkan, hücrelerin germ halkasının bir tarafına hızlı yakınsama hareketini açıkça gösterir (Şekil 1) ve kolayca tanımlanabilen gastrülasyon embriyolarının belirgin ve belirgin bir aşamasıdır53,54. Embriyolara radyasyona maruz kalma, gelişimlerinin herhangi bir aşamasında yapılabilse de, gastrulasyon sırasında radyasyona maruz kalma, radyasyonun neden olduğu toksisitelerin daha iyi okunmasını kolaylaştıran daha belirgin morfolojik değişikliklere sahip olabilir55; Benzer şekilde, embriyolara ilaç uygulaması 2 HPF54 gibi erken bir tarihte başlatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Bhubaneswar'daki Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Kurumsal Hayvan Etik Komitesi'nin yönergelerinden önceden onay alınarak ve bu yönergeler izlenerek yürütülmüştür. Tüm zebra balığı bakımı ve üremesi 28.5 °C'de bir ortam balık kültürü tesisinde gerçekleştirildi ve embriyolar 28.5 °C'lik bir sıcaklıkta biyolojik oksijen ihtiyacı (BOİ) inkübatöründe tutuldu. Burada zebra balığı AB suşu kullanılmış ve evreleme Kimmel ve ark.54'e göre yapılmıştır. X-ışını radyasyonu 6 hpf'de (kalkan evresi) verildi ve 120 hpf'ye kadar farklı fenotipler gözlendi.
1. Üreme kurulumu ve embriyo toplama
- Üreme tanklarını ayarlayın (polikarbonattan yapılmış, kapasite 1 L, Malzeme Tablosuna bakınız). Sistem suyunu (pH, 6.8-7.5; iletkenlik, 500 μS; ve sıcaklık, 28.5 °C) hacminin yaklaşık% 40'ını kaplayan ıslah tanklarına dökün. Biri dişiler, diğeri erkekler için olmak üzere iki oda oluşturmak için bölücüyü tanka yerleştirin.
- Ana tanklardan iki sağlıklı dişi ve bir sağlıklı erkeği bir ağ yardımıyla dikkatlice toplayın, kendi yarılarına koyun ve gece boyunca (en az 10 saat) 28.5 ° C'de karanlıkta tutun.
- Ertesi sabah, bölücüyü çıkarın ve balıkların üreme tanklarını rahatsız etmeden çiftleşmesine izin verin.
NOT: Dişiler yumurtlamaya başlayacak ve balıkların çiftleşmesine izin verildikten sonra 10-15 dakika içinde yumurtaların tankın dibinde yattığıgörülecektir 56,57,58. - Balıkları yumurtlamadan sonra tanklarına geri koyun, bir süzgeç kullanarak üreme tankından embriyoları toplayın, sistem suyuyla uygun şekilde yıkayın ve toplanan yumurtaları E-3 ortamı (4.94 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.43 mM CaCl 2, 0.85 mM MgCl2 tuzları, %1 w/v metilen mavisi, Malzeme Tablosuna bakınız).
- Yumurtaları diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin, döllenmemiş veya ölü embriyoları bir Pasteur pipeti kullanarak çıkarın ve döllenmiş yumurtaları içeren Petri plakalarını uygun şekilde büyümeleri ve korunmaları için bir inkübatörde 28.5 °C'de E-3 ortamında tutun.
NOT: Döllenmemiş yumurtalar, pıhtılaşmış bir koryon ile süt beyazı bir görünümle veya koryonun içinde yırtılmış hücrelerle tanımlanabilir. Döllenmemiş yumurtaların yanı sıra, bölünme geçirmeyen yumurtalar ve bölünme sırasında asimetri, vezikül oluşumu veya koryonun yaralanması gibi düzensizlikler gibi şekil bozuklukları olan veya aktif olarak gelişmeyen yumurtalar, toplanan embriyoların sağlıklı kalması ve ortamın temiz tutulması için atılmalıdır 7,56.
2. Embriyoların izlenmesi ve radyasyon deneyleri için seçim
- Büyüyen embriyoları diseksiyon mikroskobu altında izleyin, uygun evre 7,54'ü belirleyin ve ölü veya sağlıksız embriyoları çıkarın. Radyasyon ve ilaç dozları belirli bir gastrulasyon aşamasında verileceği için yeterli embriyo evrelemesi sağlayın.
NOT: Her gün, kültür kaplarındaki ortamın seviyesini ve kalitesini kontrol edin. Ölü embriyoları çıkarmakla birlikte medyayı her 24 saatte bir değiştirin. Pastör pipetleri, embriyoların toplanması veya ortamların değiştirilmesi için tercih edilir. - Deneye başlamadan önce deney plaklarındaki sağlıklı embriyoları Pasteur pipeti yardımıyla dikkatlice dağıtın. Her deney grubu için 15-20 embriyo alın.
NOT: Deney plakasına sadece istenen gelişim aşamalarının sağlıklı embriyolarını yerleştirin. İlaç tedavisinin 6 hpf'de embriyolarla yapılması gerektiğini varsayalım, ardından bunları en az 30-60 dakika önce deney plakalarına ekmeye başlayın.
3. İlaç tedavisi
- Zebra balığı embriyolarına istenen konsantrasyonda ilaçlar ekleyin. İlaç içeren E-3 ortamını önceden hazırlayın. Zebra balığı embriyolarını tedavi etmek için çalışma ortamını hazırlamadan önce ilacın stok çözeltisinde çözülmemiş ilaç bulunmadığından emin olun.
- Radyasyon taraması için bir ortama herhangi bir ilaç eklemeden önce, ilacın sitotoksik etkisini ilacın konsantrasyon dereceleri ile kontrol edin. Değerlendirme altındaki ilaçların LC 50'sini değerlendirmek için OECD yönergelerini izleyin 59,60,61.
NOT: Işınlama veya gözlem süresi boyunca tabakları ve tabakları hareket ettirirken dikkatli olun. Bu işlem sırasında plakaların bozulma ihtimali vardır, bu da ortamın kuyulardan dışarı sızmasına veya embriyoların kendi kuyularından dökülmesine, potansiyel olarak yakındaki kuyuları kirletmesine ve deneyi mahvetmesine neden olur.
4. X-ışını ışınlaması
- Bir radyasyon deneyi kurarken, bir kontrol/ışınlanmamış ve yalnızca radyasyon grubu ekleyin. Benzer şekilde, bir ilaç taraması yaparken, ilaçların radyasyonla birlikte tarama deneyinde uygulananlarla aynı konsantrasyonda verileceği başka bir grubu da dahil edin.
NOT: Kapakların yanlış yerleştirilmemesi için kuyu plakalarının veya kültür kaplarının hem kapağını hem de tabanını etiketleyin. - Radyasyon kalkanları, diğer kuyucuklar belirli bir radyasyon dozuna maruz kalırken ekstra kuyucukları radyasyondan koruyabiliyorsa ve koruyabiliyorsa, embriyoları bir kuyu plakasına dağıtın; Aksi takdirde, radyasyon dozu başına embriyoları tohumlamak için ayrı plakalar veya diskler kullanın.
- X-ışını ışınlayıcı makinesini açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve makinenin başlatılmasını ve ısınmasını başlatın.
NOT: Kaynak-konu mesafesi (SSD) değeri 50 cm olmalıdır; farklı SSD'ler tekrar kullanılabilir, bu da standardizasyon gerektirir. - Deney plakasını makinenin içindeki ışınlayıcının altına, plakanın doğrudan X-ışını kaynağının altında olduğundan emin olacak şekilde yerleştirin ve ardından dozu ayarlayın (örneğin, 5 GY) ve X-ışınını başlatın.
NOT: Plakaların inkübatörden radyatöre ve geriye taşınması sırasında istenmeyen dökülme veya kirlenmeyi önlemek için plakaları parafin filmle kapatın. - Işınlama tamamlandıktan sonra plakaları çıkarın, makine programını kapatın, makineyi kapatın ve radyasyondan hemen sonra plakaları mikroskop altında kontrol edin. Ölü embriyoları çıkarın ve plakaları 28.5 ° C'de inkübatöre geri koyun. Diseksiyon mikroskobu altında değerlendirdikten sonra ölü embriyoların sayısını kaydedin.
NOT: Radyasyonun etkisi gelişim aşamasındaki farktan önemli ölçüde etkilenebileceğinden, bireysel gruplar arasında çok fazla gecikme olmaksızın farklı embriyo gruplarını belirlenmiş radyasyon dozlarıyla ışınlayın.
DİKKAT: X-ray cihazını çalıştırırken uygun koruyucu önlemleri alın.
5. Veri toplama, görüntüleme ve analiz
- Radyasyon verildikten sonra her 24 saatte bir gibi önceden belirlenmiş zaman aralıklarında veri toplayın. Sağkalım, kuluçka verimliliği, gelişim evresi, kalp atışı sayısı, gövde ve kuyruk eğriliği, perikardiyal ödem, yolk kesesinin uzaması, mikrosefali, yüzme kesesi gelişimi, genel hareketlilik veya aktivite vb. gibi olası tüm gözlemleri kaydedin.62,63,64.
- Görüntüleri yakalamak için temiz bir slaytta temsili embriyoları seçin, embriyoları mikroskop altında kontrol edin, belirli bir yöne yönlendirin ve görüntülere tıklayın. Görüntü dosyalarını gruba ve zamana göre yeniden adlandırın.
NOT: Farklı zaman aralıklarında fotoğraf çekerken aynı büyütme ve aydınlatma kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün genel düzeni Şekil 2'de gösterilmiştir. Radyasyonun etkisi ve doza bağlı karakterizasyonu aşağıdaki analizlerle değerlendirildi.
X-ışını kaynaklı toksisitelerin değerlendirilmesi
Bir stereomikroskop kullanılarak, ilaç tedavisi ve / veya radyasyondan sonra aşağıdaki anormallikler değerlendirildi ve karakterize edildi. OECD yönergelerine61 göre, balıklarda toksisite değerlendirmesi için, embriyoların pıhtılaşması, somit oluşumundaki deformiteler, kuyruğun yumurta sarısı kesesinden ayrılmaması ve kalp atışının azalması veya yokluğu dahil olmak üzere dört ana apikal uç nokta, genel toksisiteyi analiz etmek için dahil edildi61. Akut toksisite, yukarıdaki anormalliklerin herhangi birinde pozitif bir sonuca dayanarak belirlendi. Bu dört ana uç noktaya ek olarak, omurga veya kuyruk bükülmesi, baş malformasyonu ve mikrosefali, gelişim kusurları, perikardiyal ödem, yolk kesesi deformiteleri, yüzme kesesi deformiteleri ve göz yapısındaki değişiklikler için morfolojik gözlem de yapılmıştır (Şekil 3C ve Şekil 4). Radyotoksisite skorlaması, farklı morfolojik anormalliklerin sağkalım yüzdesine ve/veya skorlamasına bağlı olabilir.
Hayatta kalma yüzdesi ve hayatta kalma eğrisi
Hayatta kalma yüzdesi, toplam canlı embriyoların bir grupta başlangıçta alınan toplam embriyo sayısına bölünmesi ve sonucun 100 38,50,65 ile çarpılmasıyla hesaplandı. Daha sonra, hayatta kalma eğrisini elde etmek için farklı zaman noktalarına ve farklı deney gruplarına karşılık gelen değerler çizildi. Bu çalışma, 6 hpf'de ışınlanan embriyolar için sağkalım eğrisini sağlar (Şekil 3A).
Radyasyona bağlı toksisite ile ilişkili majör anormallikler (Şekil 3 ve Şekil 4)
Gövde eğriliği ve kuyruk bükülmesi
Bu, zebra balığı embriyolarındatoksisiteye bağlı herhangi bir deformiteyi değerlendirmek için en yaygın parametrelerden biridir 50,65,66. Vücut eğriliği deformiteleri, post-hepatik kuyruk bölgesinde veya ana gövde ekseninde eğilme veya hatta tamamen yarım daire şeklinde bir omurga veya vücut ekseninde ve kuyrukta birden fazla eğilme ile düşük, orta, şiddetli arasında değişen farklı şekillerde görülebilir. Daha düşük radyasyon dozlarında, bükülme tüm embriyolarda görünmeyebilir, ancak embriyoların çoğunda gelişebilir. Dozun artmasıyla birlikte eğilmenin şiddeti de artar ve tüm bireyleri etkiler. Bu çalışmada 10 GY radyasyon dozu ile tedavi edilen embriyolarda bu deformiteler gözlenmiştir.
Perikardiyal ve kardiyak ödem
Radyasyon ve ilaçlar gibi toksik maruziyetlerle tolere edilebilir aralıkların ötesinde veya toksik dozlarda tedavi edilen embriyolarda da perikardiyal ödemgelişir 65,66. X-ışını radyasyonuna maruz kalan embriyolar, perikardiyal boşlukta ve kalpte sıvının biriktiği ve şişmiş bir perikard ve kalbe neden olan perikardiyal ve kardiyak ödem gösterir.
Yumurta sarısı kesesi ödemi, yumurta sarısının kalınlaşması ve yumurta sarısı kesesi daralması
X-ışınına maruz kaldıktan sonra, bazı balıklarda yumurta sarısı kesesinin kalınlaştığı veya tutulduğu görülür, bu da X-ışını radyasyonunun toksisitesini ima eder. Bazı durumlarda yumurta sarısı uzantısının kısa olduğu genel yolk kesesi daralması veya yumurta sarısı bölgesinde ödem gelişimi de görülebilir.
Kafa boyutunda küçülme (mikrosefali)
Ağır radyasyonun beklenen bir sonucu, tedavi edilen embriyolar kontrol grubundaki embriyolarla karşılaştırıldığında tanımlanabilen başın boyutundaki azalma veya mikrosefalidir.
Yüzme kesesi deformiteleri
Işınlama sonrası, yüzme kesesinin birkaç embriyoda azaldığı veya tehlikeye girdiği görülür ve yüzme kesesi deformitesi, daha yüksek radyasyon dozlarına maruz kalan embriyolarda daha fazladır, bu da düşük hareket kabiliyetine katkıda bulunabilir veya yüksek X-ışını dozlarına maruz kalan embriyolarda yüzme yetenekleri.
Göz yapısında değişiklik
Radyasyon, sonunda hücre ölümüne ve hücre sayılarında azalmaya veya belirli hücre tiplerinin ölümüne neden olan muazzam DNA hasarına ve protein değişikliklerine neden olabilir65. Göz, yoğun radyasyon dozlarından etkilenebilir ve küçük göz boyutu ve hücre katmanlarında azalma gözlenmiştir55.
Dakikadaki kalp atışı (bpm)
Dakikadaki kalp atışları, embriyolar stereomikroskop altında izlenerek sayıldı. Radyasyon dozu arttıkça, bpm azalma eğilimindedir (Şekil 3B). Beş larva, grup başına her zaman noktasında bpm'yi hesaplamak için kabul edildi. Kalp atışı sayısındaki bir azalma kardiyak disfonksiyonugösterebilir 66.
Bu protokolü kullanarak, 10 GY'lik X-ışını radyasyon dozu, 6 hpf'de ışınlanan zebra balığı embriyolarında gözle görülür şekilde toksikti. Kontrol grubunda ve 2 GY ve 5 GY'ye maruz kalan embriyolarda embriyolarda anlamlı ölüm gözlenmedi (Şekil 3A). Benzer şekilde, dakikadaki kalp atışı sayısı, artan X-ışını radyasyonu dozları ile kalp atış hızının büyük ölçüde azaldığını göstermiştir. Kontrol grubunda, her 24 saatlik aralıkta kalp atım hızının arttığı görüldü (Şekil 3B). Bununla birlikte, her zaman noktasında, artan radyasyon dozu ile kalp atış hızı azaldı. Bununla birlikte, 5 GY ve 10 GY'ye maruz kalan embriyolar, döllenmeden sonraki 5. güne kadar önemli bir farklılık göstermedi. 15 GY ve 20 GY radyasyona maruz kalan embriyolarda kalp atışı aşırı derecede düştüğü için ciddi kardiyovasküler deformasyondan şüphelenilmektedir (Şekil 3B). Daha önce tartışıldığı gibi, farklı zaman noktalarında farklı dozlarda radyasyona maruz kalan embriyolar için farklı fenotipik ve gelişimsel kusurlar tasvir edilmiş ve değerlendirilmiştir (Şekil 3C ve Şekil 4).
Şekil 1: Zebra balığı embriyo gelişim aşamaları. Erken zebra balığı gelişiminin farklı aşamalarının temsili görüntüleri. % 75 epiboliye (8 hpf) kadar olan aşamalar kapsanmaktadır. Kalkan aşamasındaki embriyolar; Radyasyon standardizasyonu için 6 HPF (yeşil renk) kullanılır. Ölçek çubuğu = 276.4 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Protokolün genelleştirilmiş taslağı . (A) Üreme, embriyoların toplanması ve evreleme. (B) Deney düzeneği: embriyoların kuyu plakalarına tohumlanması ve ilaç tedavisi. (C) Radyasyona maruz kalan gerekli aşamalardaki embriyolar ve radyasyondan sonra gözlenen fenotipik değişiklikler. (D) X-ray cihazının ve kurulumunun bir taslağı. (E) Gözlemler, veri toplama ve görüntüleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı dozlarda X-ışını ışınlamasının 6 hpf zebra balığı embriyosu üzerindeki etkisi . (A) 2 GY'den 20 GY'ye kadar bireysel radyasyon dozlarına maruz kalan zebra balığı embriyolarının toplam hayatta kalan fraksiyonunu gösteren hayatta kalma eğrisi. (B) Sonraki döllenme günlerinde 6 hpf'de farklı dozlarda X-ışını radyasyonuna maruz kalan zebra balığı embriyolarının dakikadaki kalp atışı sayısı. (C) Değişen dozlarda radyasyona (2 GY'den 20 GY'ye) maruz kalan, 6 hpf'de ışınlanan zebra balığı embriyolarının temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Radyasyona bağlı toksisiteye bağlı farklı morfolojik anormalliklerin temsili. (A) A, 72 hpf'de zebra balığı embriyolarını kontrol eder ve (B) 72 hpf'de yayılan embriyolar; Üst embriyoda orta derecede şekil bozuklukları görülürken, alt embriyoda ileri derecede şekil bozuklukları vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı, çeşitli kanser araştırmaları da dahil olmak üzere birçok çalışmada değerli modeller olarak kullanılmaktadır. Bu model, büyük ölçekli uyuşturucu taraması için yararlı bir platform sağlar67,68. Diğer tüm toksisite değerlendirme yöntemleri gibi, radyasyon ve/veya ilaç tedavisi ile ilgili önemli biyolojik değişikliklerin nicel olarak değerlendirilmesi bu protokolün en önemli parçasıdır. Bu tür çalışmalarda, toksisiteyi gözlemlemek için tek kriter hayatta kalma olmamalıdır; Fiziksel ya da gelişimsel kusurların uygun skorlama sistemleri ile değerlendirilmesi ile desteklenmesi gerekmektedir. Bu durumda da, 72 hpf'ye kadar, embriyolarda sağkalım, embriyoların 5 GY, 10 GY ve 20 GY'lik X-ışını radyasyon dozlarına maruz kaldığı gruplar arasında çok farklı değildir; bununla birlikte, embriyoların genel morfolojisi ve fenotipleri bu belirli dozlarda kontrol edildiğinde, X-ışını toksisitesinin hayatta kalma grafiğinde göründüğünden daha şiddetli olduğu açıktır. Bu dozlarda embriyolarda morfolojik deformitenin şiddeti çok yüksektir, bu da genel vücut boyutlarındaki değişiklikleri, gelişimdeki kusurları, hayati organların malformasyonunu ve genel aktivitelerindeki değişiklikleri yansıtır. 15 GY ve 20 GY grubunda bile embriyolar koryonlarından çıkamazlar ve doza bağlı olarak bol miktarda deformite gösterirler. Bu nedenle, son derece ölümcül X-ışını radyasyonu da dahil olmak üzere toksik maddelerin etkisini değerlendirmek için, morfolojik, gelişimsel ve fizyolojik kusurların puanlanması mümkün olan tüm yollarla dahil edilmeli ve zebra balığı embriyolarının genel tepkisini değerlendirmek için kullanılmalıdır.
Zebra balığı embriyo modelinde spesifik olarak radyotoksisiteyi değerlendirmek için kesin bir skorlama sistemi olmamasına rağmen, çeşitli çalışmalarda vücutta eğilme, perikardiyal ödem, yumurta sarısı kesesindeki değişiklikler, mikrosefali, yüzme kesesi ve gözdeki değişiklikler, kalp atışı değişiklikleri ve hareket kusurları gibi genel sağkalım ve/veya morfolojik değişiklikler dikkate alınmıştır62, 63,64. Embriyoların sağkalımı, kalp atışına veya OECD kılavuzlarında açıklandığı gibi apikal uç noktaların değerlendirilmesine dayalı olarak değerlendirilebilir. Aynı zamanda, bu tür deneylerde gözlemlenen morfolojik anormallikler ayrı ayrı puanlanabilir; Örneğin, kuyruk bükmenin puanlaması birden fazla araştırmacı tarafından benimsenmiştir61.
Zebra balığı ile çalışırken ve bu protokolü uygularken bazı hususlara dikkat etmek gerekir. Bunlar, her zaman aynı balık türüne ait olması gereken üreme grubunu içerir. Tüm deneyler, önceden tanımlanmış bir zebra balığı embriyosu türünü içermelidir. Bir diğer önemli faktör ise embriyo aşamasıdır; Embriyoların ışınlandığı gelişim aşamasında titiz olunması gerekir çünkü zamanlama veya aşamadaki küçük bir değişiklik farklı sonuçlara yol açacaktır. Bazı ilaçlar, 2 hpf gibi gelişimin erken bir aşamasında uygulandığında embriyoların gelişimini etkileyebilir veya embriyolarda ciddi hasara neden olabilir. Bu durumda, ilacın uygun alt öldürücü dozu belirlenmeli ve ardından tarama yapılabilir.
X-ışını ışınlama parametreleri, gerçekleştirilen tüm deneyler için tek tip olmalıdır. Standart bir X-ışını ışınlayıcısının üç önemli yönü, filtre tipi, radyasyon dozu ve ışınlama modeli ve X-ışını kaynağı ile nesne arasındaki mesafedir. X-ışını ışınları oluşturmak için kullanılan başlıca iki tür filtre vardır: alüminyum filtreler ve bakır filtreler; bununla birlikte, diğer durumlarda X-ışınları üretmek için çeşitli bakır ve alüminyum veya diğer metal kombinasyonlarına sahip filtreler de kullanılır69. Zebra balığı embriyoları için, bakır filtresi burada X-ışınları üretmek için kullanılır. X-ışını kaynağından deney konusuna olan mesafe, kaynaktan deneğe mesafe (SSD) olarak adlandırılır. Bu çalışmada SSD 50 cm olarak ayarlanmıştır. X-ışını radyasyonu 0.3 mm Cu filtre kullanılarak verildi. İstenilen dozun tek bir maruziyeti, 0.01-10 nm dalga boyu aralığında 140.32 cGY / dak'lık bir doz hızında verildi. Herhangi bir radyolojik deney yapılmadan önce, deneye ve hedefe uygun radyasyon dozu standardize edilmelidir. Çalışmanın amacı, ışınlamanın zamanlaması ve radyasyon dozu, radyasyon dozu standardizasyonu için üç ana kriterdir. Radyasyonun zamanlaması, hem radyasyonun embriyo gelişiminin hangi aşamasında verilmesi gerektiğini hem de embriyonun belirli bir dozda radyasyona maruz kalacağı süreyi içerecektir. Erken gelişim aşamalarında radyasyonun etkisinin en üst düzeye çıktığı iyi bilinmektedir. Bu protokolde embriyolar 6 hpf'lik gelişim evresinde farklı dozlarda radyasyonla (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY ve 20 GY) ışınlandı ve döllenmeden sonraki 5 gün boyunca gözlemlendi. Olağan protokolden herhangi bir sapma açıkça tanımlanmalı ve standartlaştırılmalıdır.
Bu modelin, neredeyse uzunlamasına bir çalışmada radyosensitizörlerin veya koruyucuların etkisini incelemek için, bireysel üremeden birkaç embriyo elde etme, her hafta tek bir ebeveyn tankından üreme, deney gruplarına önemli sayıda embriyo yerleştirme, tedaviden birkaç gün sonra fenotipik etkileri gözlemleme yeteneği gibi çeşitli avantajları vardır. ve tedavilerden sonra fenotipik değişkenlerin bir spektrumunu görmek. Bu model, radyasyonun embriyonun hemen hemen tüm sistemleri üzerindeki etkisini yansıtabilir ve aynı anda birden fazla ilaç kuyu plakası formatlarında test edilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda bazı sınırlamalarla da karşı karşıyadır. Örneğin, bu model, daha yüksek hayvanlarda ve insanlarda radyasyonların gösterdiği tüm deformiteleri özetleyemez. Ek olarak, bu balıklarda yapılan birçok protein bazlı veya mekanik çalışma, antikorlar gibi reaktif mevcudiyeti sorunları nedeniyle sınırlıdır. Bununla birlikte, bu sınırlamalara rağmen, zebra balığı radyolojik çalışmalar için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.
Acknowledgments
SS'nin laboratuvarı ve RKS'nin laboratuvarı, Hindistan'daki DBT ve SERB'den gelen hibelerle finanse edilmektedir. APM, Hindistan Hükümeti ICMR bursunun bir alıcısıdır. DP, Hindistan Hükümeti CSIR bursunun bir alıcısıdır. BM, Hindistan Hükümeti DST-Inspire bursunun bir alıcısıdır. Şekil 2 , Biorender (https://biorender.com) kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
References
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2373-2380 (2020).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Zhang, C., Willett, C., Fremgen, T. Zebrafish: An animal model for toxicological studies. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 1, Unit 1.7 (2003).
- Dai, Y. J., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 11-17 (2014).
- Gamse, J. T., Gorelick, D. A. Mixtures, metabolites, and mechanisms: Understanding toxicology using zebrafish. Zebrafish. 13 (5), 377-378 (2016).
- Yesudhason, B. V., et al. Developmental stages of zebrafish (Danio rerio) embryos and toxicological studies using foldscope microscope. Cell Biology International. 44 (10), 1968-1980 (2020).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- McGrath, P., Li, C. Q. Zebrafish: A predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discovery Today. 13 (9-10), 394-401 (2008).
- Haque, E., Ward, A. C. Zebrafish as a model to evaluate nanoparticle toxicity. Nanomaterials. 8 (7), 561 (2018).
- Xia, Q., et al. Psoralen induces developmental toxicity in zebrafish embryos/larvae through oxidative stress, apoptosis, and energy metabolism disorder. Frontiers in Pharmacology. 9, 1457 (2018).
- Al-Samadi, A., et al. PCR-based zebrafish model for personalised medicine in head and neck cancer. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 235 (2019).
- Van Sebille, Y. Z., Gibson, R. J., Wardill, H. R., Carney, T. J., Bowen, J. M. Use of zebrafish to model chemotherapy and targeted therapy gastrointestinal toxicity. Experimental Biology and Medicine. 244 (14), 1178-1185 (2019).
- Heideman, W., Antkiewicz, D. S., Carney, S. A., Peterson, R. E.
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. 151-152, 152-168 (2019).
- Farrelly, J., McEntee, M. C. Principles and applications of radiation therapy. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 18 (2), 82-87 (2003).
- Seegenschmiedt, M., Micke, O., Muecke, R. German Cooperative Group on Radiotherapy for Non-malignant Diseases (GCG-BD). Radiotherapy for non-malignant disorders: State of the art and update of the evidence-based practice guidelines. The British Journal of Radiology. 88 (1051), (2015).
- Mohan, G., et al. Recent advances in radiotherapy and its associated side effects in cancer-A review. The Journal of Basic and Applied Zoology. 80 (1), 14 (2019).
- Jarosz-Biej, M., Smolarczyk, R., Cichoń, T., Kułach, N. Tumor microenvironment as a "game changer" in cancer radiotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3212 (2019).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Garibaldi, C., et al.
- Koka, K., Verma, A., Dwarakanath, B. S., Papineni, R. V. L. Technological advancements in external beam radiation therapy (EBRT): An indispensable tool for cancer treatment. Cancer Management and Research. 14, 1421-1429 (2022).
- Citrin, D. E.
- Ghani, S., et al. Recent developments in antibody derivatives against colorectal cancer; A review. Life Sciences. 265, 118791 (2021).
- Lu, L., Shan, F., Li, W., Lu, H. Short-term side effects after radioiodine treatment in patients with differentiated thyroid cancer. BioMed Research International. 2016, 4376720 (2016).
- Szejk, M., Kołodziejczyk-Czepas, J., Żbikowska, H. M. Radioprotectors in radiotherapy - Advances in the potential application of phytochemicals. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 70 (0), 722-734 (2016).
- Citrin, D., et al. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury. The Oncologist. 15 (4), 360-371 (2010).
- Jairam, V., et al. Treatment-related complications of systemic therapy and radiotherapy. JAMA Oncology. 5 (7), 1028-1035 (2019).
- Gong, L., Zhang, Y., Liu, C., Zhang, M., Han, S.
- Wardman, P. Chemical radiosensitizers for use in radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 397-417 (2007).
- Citrin, D. E.
- Citrin, D. E., Mitchell, J. B. Altering the response to radiation: sensitizers and protectors. Seminars in Oncology. 41 (6), 848-859 (2014).
- Caragher, S., Chalmers, A. J., Gomez-Roman, N. Glioblastoma's next top model: Novel culture systems for brain cancer radiotherapy research. Cancers. 11 (1), 44 (2019).
- Wang, J. S., Wang, H. J., Qian, H. L. Biological effects of radiation on cancer cells. Military Medical Research. 5 (1), 20 (2018).
- Serrano Martinez, P., et al. Mouse parotid salivary gland organoids for the in vitro study of stem cell radiation response. Oral Diseases. 27 (1), 52-63 (2021).
- Martin, M. L., et al. Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity. Cancer Research. 80 (5), 1219-1227 (2020).
- Szabó, E. R., et al. Radiobiological effects and proton RBE determined by wildtype zebrafish embryos. PLoS One. 13 (11), 0206879 (2018).
- Hurem, S., et al. Dose-dependent effects of gamma radiation on the early zebrafish development and gene expression. PLoS One. 12 (6), 0179259 (2017).
- Lu, B., Hwang, M., Yong, C., Moretti, L. Zebrafish as a model system to screen radiation modifiers. Current Genomics. 8 (6), 360-369 (2007).
- Curran, W. Seminars in radiation oncology. 12 (1), 2-4 (2002).
- McAleer, M. F., et al. Novel use of zebrafish as a vertebrate model to screen radiation protectors and sensitizers. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 61 (1), 10-13 (2005).
- Bladen, C. L., Lam, W. K., Dynan, W. S., Kozlowski, D. J. DNA damage response and Ku80 function in the vertebrate embryo. Nucleic Acids Research. 33 (9), 3002-3010 (2005).
- Geiger, G. A., et al. Zebrafish as a "biosensor"? Effects of ionizing radiation and amifostine on embryonic viability and development. Cancer Research. 66 (16), 8172-8181 (2006).
- Kelland, L. R. Flavopiridol, the first cyclin-dependent kinase inhibitor to enter the clinic: Current status. Expert Opinion on Investigational Drugs. 9 (12), 2903-2911 (2000).
- Prasanna, P. G., et al. Radioprotectors and radiomitigators for improving radiation therapy: The Small Business Innovation Research (SBIR) gateway for accelerating clinical translation. Radiation Research. 184 (3), 235-248 (2015).
- Daroczi, B., et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF-1as assessed in a zebrafish model. Clinical Cancer Research. 12 (23), 7086-7091 (2006).
- Adenan, M. N. H., et al. Radioprotective effects of Kelulut honey in zebrafish model. Molecules. 26 (6), 1557 (2021).
- Liu, G., et al. High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch's reaction for in vivo X-ray damage determination. Nature Communications. 11 (1), 1-11 (2020).
- Mohapatra, D., et al. Fluvastatin sensitizes pancreatic cancer cells toward radiation therapy and suppresses radiation- and/or TGF-β-induced tumor-associated fibrosis. Laboratory Investigation. 102 (3), 298-311 (2022).
- Chen, Y., Yang, J., Fu, S., Wu, J. Gold nanoparticles as radiosensitizers in cancer radiotherapy. International Journal of Nanomedicine. 15, 9407-9430 (2020).
- Ma, N., et al. Enhanced radiosensitization of gold nanospikes via hyperthermia in combined cancer radiation and photothermal therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (42), 28480-28494 (2016).
- Hosen, M. J., et al. Zebrafish models for ectopic mineralization disorders: Practical issues from morpholino design to post-injection observations. Frontiers in Genetics. 4, 74 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Zhou, R., et al. The effects of x-ray radiation on the eye development of zebrafish. Human & Experimental Toxicology. 33 (10), 1040-1050 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species -- An update. ALTEX. 22 (2), 87-102 (2005).
- Nagel, R. DarT: The embryo test with the zebrafish Danio rerio--A general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX. 19, Suppl 1 38-48 (2002).
- Aspatwar, A., Hammaren, M. M., Parikka, M., Parkkila, S. Rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (150), e59315 (2019).
- Gence, L., et al. Hypericum lanceolatum Lam. Medicinal plant: Potential toxicity and therapeutic effects based on a zebrafish model. Frontiers in Pharmacology. 13, 832928 (2022).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals., Section 2. , OECD Publishing. Paris, France. (2019).
- Li, X., et al. Toxic effects and foundation of proton radiation on the early-life stage of zebrafish development. Chemosphere. 200, 302-312 (2018).
- Si, J., et al. Effects of ionizing radiation and HLY78 on the zebrafish embryonic developmental toxicity. Toxicology. 411, 143-153 (2019).
- Si, J., et al. Toxic effects of (56)Fe ion radiation on the zebrafish (Danio rerio) embryonic development. Aquatic Toxicology. 186, 87-95 (2017).
- Pucci, G., Forte, G. I., Cavalieri, V. Evaluation of epigenetic and radiomodifying effects during radiotherapy treatments in zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9053 (2021).
- Song, Z., et al. Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway. Chemosphere. 246, 125727 (2020).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (8), 611-628 (2021).
- Rosa, J. G. S., Lima, C., Lopes-Ferreira, M. Zebrafish larvae behavior models as a tool for drug screenings and pre-clinical trials: A review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6647 (2022).
- Kong, E. Y., Cheng, S. H., Yu, K. N. Biphasic and triphasic dose responses in zebrafish embryos to low-dose 150 kV X-rays with different levels of hardness. Journal of Radiation Research. 57 (4), 363-369 (2016).
