Summary
斑马鱼最近被用作验证潜在辐射改性剂的模型。本方案描述了使用斑马鱼胚胎进行基于辐射的筛选实验的详细步骤以及一些观察方法来评估不同治疗和辐射的效果。
Abstract
斑马鱼被广泛用于多种研究，因为它们是易于维护的脊椎动物模型之一，并表现出独特而方便的模型系统的几个特征。由于高度增殖的细胞更容易受到辐射诱导的DNA损伤，斑马鱼胚胎是辐射研究的一线 体内 模型。此外，该模型在短时间内预测了辐射和不同药物的影响，以及主要的生物学事件和相关反应。一些癌症研究使用了斑马鱼，该协议基于在放疗和癌症背景下使用辐射调节剂。该方法可以很容易地用于验证不同药物对辐照和对照（非辐照）胚胎的影响，从而将药物识别为放射增敏或保护性药物。尽管这种方法用于大多数药物筛选实验，但实验的细节和X射线辐射暴露背景的毒性评估是有限的或仅简要解决，因此难以执行。该协议解决了这个问题，并通过详细说明讨论了程序和毒性评估。该程序描述了一种使用斑马鱼胚胎进行辐射研究和基于辐射的药物筛选的简单方法，具有很高的可靠性和可重复性。
Introduction
斑马鱼（Danio rerio）是一种著名的动物模型，在过去30年中被广泛用于研究。它是一种小型淡水鱼，易于在实验室条件下饲养和繁殖。斑马鱼已被广泛用于各种发育和毒理学研究1,2,3,4,5,6,7,8。斑马鱼繁殖力高，胚胎世代短;这些胚胎适合跟踪不同的发育阶段，在视觉上是透明的，并且适用于各种遗传操作和高通量筛选平台9,10,11,12,13,14。此外，斑马鱼提供实时成像，其发育过程和存在各种有毒物质或因素的不同畸形可以很容易地使用立体或荧光显微镜进行研究7,15,16。
放射治疗是用于治疗癌症的主要治疗方式之一 17,18,19,20,21,22,23,24。然而，癌症放射治疗需要潜在的放射保护剂来保护正常健康细胞免于死亡，同时杀死恶性细胞或在涉及高能辐射的治疗期间保护人类健康 25,26,27,28,29。相反，有效的放射增敏剂也正在研究中，以提高辐射杀死恶性细胞的效率，特别是在靶向和精准治疗中30,31,32,33。因此，为了验证有效的放射防护剂和增敏剂，高度征求了一种适用于半高通量药物筛选并可测量地表现出辐射效应的模型。几种可用的模型用于辐射研究并参与药物筛选实验。然而，高等脊椎动物，甚至是最常用的体内模型小鼠，都不适合大规模的药物筛选，因为用这些模型设计这种筛选实验既费时又费钱，而且具有挑战性。同样，细胞培养模型是各种高通量药物筛选实验的理想选择34,35。然而，涉及细胞培养的实验并不总是实用的、高度可重复的或可靠的，因为培养中的细胞可能会根据生长条件和动力学显着改变其行为。此外，各种细胞类型显示出不同的辐射敏化。值得注意的是，2D 和 3D 细胞培养系统并不代表整个生物体的情况，因此，获得的结果可能无法概括实际的放射毒性水平36,37。在这方面，斑马鱼在筛选新型放射增敏剂和放射防护剂方面具有多种优势。斑马鱼易于操作、离合器尺寸大、寿命短、胚胎发育快、胚胎透明、体型小等特点，是大规模药物筛选的合适模型。由于上述优点，可以在短时间内轻松重复实验，并且可以在多孔板的解剖显微镜下轻松观察效果。因此，斑马鱼在涉及辐射研究的药物筛选研究中越来越受欢迎38,39。
斑马鱼作为筛选辐射调节剂的真正模型的潜力已在各种研究中得到证明 40,41,42,43,44,45。潜在的放射性修饰剂，如纳米颗粒DF1、氨磷汀（WR-2721）、DNA修复蛋白KU80和ATM，以及移植的造血干细胞，以及放射增敏剂，如黄酮吡醇和AG1478，在斑马鱼模型中的作用已被报道19,41,42,43,44,45,46.使用相同的系统，在全身和器官特异性水平上评估了DF-1（富勒烯纳米颗粒）的辐射防护作用，并进一步探索了使用斑马鱼胚胎进行放射防护剂筛选47。最近，据报道，Kelulut蜂蜜是斑马鱼胚胎中的放射保护剂，并被发现可以提高胚胎存活率并防止器官特异性损伤、细胞DNA损伤和细胞凋亡48。
同样，在高通量筛选中检查了通过Hantzsch反应产生的聚合物对斑马鱼胚胎的辐射防护作用，并且主要通过保护细胞免受DNA损伤来提供保护49。在之前的一项研究中，使用这种方法的斑马鱼模型发现亲脂性他汀类药物氟伐他汀是一种潜在的放射增敏剂50。同样，金纳米颗粒被认为是一种理想的放射增敏剂，并已用于许多研究51,52。
斑马鱼的胚胎发育涉及最初 3 小时内的卵裂，其中单细胞受精卵分裂形成 2 个细胞、4 个细胞、8 个细胞、16 个细胞、32 个细胞和 64 个细胞，这些细胞很容易用立体显微镜识别。然后，它达到具有 128 个细胞（受精后 2.25 小时，hpf）的胚泡阶段，其中细胞每 15 分钟翻一番，并经历以下阶段：256 个细胞 （2.5 hpf）、512 个细胞 （2.75 hpf），并在短短 3 小时内达到 1,000+ 个细胞（图 1）。在4小时时，卵达到球形阶段，随后在胚胎质量7,53,54中形成圆顶形。斑马鱼的原肠形成从 5.25 hpf54 开始，在那里它达到盾牌阶段。盾牌清楚地表明细胞向胚环一侧的快速收敛运动（图1），并且是胃胚的一个突出而独特的阶段，可以很容易地识别53,54。尽管胚胎的辐射暴露可以在其发育的任何阶段进行，但原肠胚形成期间的辐射暴露可能具有更明显的形态变化，有助于更好地读出辐射诱导的毒性55;同样，最早可以在2 HPF54开始对胚胎施用药物。
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Protocol
本研究是在布巴内斯瓦尔生命科学研究所机构动物伦理委员会事先批准并遵循其指导方针的情况下进行的。所有斑马鱼的维护和繁殖均在28.5°C的常温养鱼设施中进行，胚胎在28.5°C的生物需氧量（BOD）培养箱中维持。 在这里，使用斑马鱼AB品系，并根据Kimmel等人54进行分期。在 6 hpf（屏蔽阶段）给予 X 射线辐射，并在 120 hpf 之前观察到不同的表型。
1. 育种设置和胚胎采集
- 设置养殖罐（由聚碳酸酯制成，容量为 1 L，参见 材料表）。将系统水（pH值，6.8-7.5;电导率，500μS;温度，28.5°C）倒入养殖池中，覆盖其体积的近40%。将分隔器放入水箱中以创建两个腔室，一个用于雌性，另一个用于雄性。
- 从亲本罐中，在网的帮助下小心地收集两只健康的雌性和一只健康的雄性，将它们放在各自的两半，并将它们在28.5°C的黑暗中过夜（至少10小时）。
- 第二天早上，取下隔板，让鱼在不打扰繁殖缸的情况下交配。
注意：雌性将开始产卵，在允许鱼类交配后 10-15 分钟内看到卵躺在水箱底部56,57,58。 - 产卵后将鱼放回鱼缸，使用过滤器从繁殖缸中收集胚胎，用系统水正确清洗，并将收集的卵保存在含有E-3培养基的培养皿中（4.94mM NaCl，0.17mM KCl，0.43mM CaCl 2,0.85mM MgCl2盐，1%w / v亚甲蓝， 见材料表）。
- 在解剖显微镜下观察卵子，使用巴斯德移液管除去未受精或死亡的胚胎，并将含有受精卵的培养皿保持在28.5°C的E-3培养基中，在培养箱中，以便其正常生长和维持。
注意：未受精的卵子可以识别为乳白色外观，带有凝固的绒毛膜或绒毛膜内的细胞破裂。与未受精的卵子一起，必须丢弃未进行卵裂的卵子和具有畸形的卵子，例如卵裂过程中的不规则性，例如不对称、囊泡形成或绒毛膜损伤或未积极发育，以保持收集的胚胎健康并保持培养基清洁7,56。
2. 监测胚胎和选择辐射实验
- 在解剖显微镜下监测生长中的胚胎，确定适当的阶段7,54，并去除任何死亡或不健康的胚胎。确保足够的胚胎分期，因为辐射和药物剂量将在特定的原肠胚形成阶段给予。
注意：每天检查培养皿中培养基的水平和质量。每24小时更换一次培养基，同时去除死胚胎。巴斯德移液器首选用于挑选胚胎或更换培养基。 - 在开始实验之前，在巴斯德移液管的帮助下小心地将健康胚胎分布在实验板中。对于每个实验组，取15-20个胚胎。
注意：仅将所需发育阶段的健康胚胎放入实验板中。假设药物治疗必须以6 hpf的胚胎进行，然后至少提前30-60分钟开始将它们接种在实验板中。
3.药物治疗
- 向斑马鱼胚胎中加入所需浓度的药物。提前准备好含药物的 E-3 培养基。在制备用于治疗斑马鱼胚胎的工作培养基之前，确保药物的储备溶液中没有未溶解的药物。
- 在将任何药物添加到用于辐射筛选的介质中之前，请检查药物的细胞毒性作用与药物浓度的等级。按照经合组织指南评估被评估药物的LC 50 59,60,61。
注意： 在照射或观察期间移动盘子和盘子时要小心。在处理过程中，板很有可能受到干扰，导致培养基从孔中泄漏出来，或者胚胎从各自的孔中溢出，从而可能污染附近的孔并破坏实验。
4. X射线照射
- 在设置辐射实验时，包括对照组/非辐照组和仅辐射组。同样，在进行药物筛选时，包括另一组，其中药物的浓度将与筛选实验中施用的药物相同，并伴有辐射。
注意： 在孔板或培养皿的盖子和底座上贴上标签，以免盖子放错位置。 - 如果辐射防护罩可以覆盖并保护额外的孔免受辐射，而其他孔暴露于特定的辐射剂量，则将胚胎分布在孔板中;否则，使用单个板或圆盘在每辐射剂量下播种胚胎。
- 打开 X 射线辐照机（见 材料表），并启动机器初始化和预热。
注意： 源到被摄体的距离 （SSD） 值必须为 50 厘米;人们可以再次使用不同的 SSD，这需要标准化。 - 将实验板放在机器内部的辐照器下方的中心，确保板位于X射线源的正下方，然后设置剂量（例如，5 GY）并开始X射线。
注意： 用石蜡膜密封板，以避免在将板从培养箱运输到辐照器并返回过程中出现任何不必要的溢出或污染。 - 照射完成后，取出板，关闭机器程序，关闭机器，放疗后立即在显微镜下检查板。取出死胚胎，将板放回28.5°C的培养箱中。 在解剖显微镜下评估后记录死胚胎的数量。
注意：用指定的辐射剂量照射不同的胚胎组，在各组之间没有太多延迟，因为辐射的影响可能会受到发育阶段差异的显着影响。
注意： 操作 X 光机时，请采取适当的保护措施。
5. 数据收集、成像和分析
- 以预定的时间间隔收集数据，例如给予辐射后每 24 小时收集一次数据。记录所有可能的观察结果，如存活率、孵化效率、发育阶段、心跳计数、身体和尾巴弯曲、心包水肿、卵黄囊的延伸、小头畸形、鱼鳔发育、一般运动或活动等62,63,64。
- 要捕获图像，请在干净的载玻片上选择具有代表性的胚胎，在显微镜下检查胚胎，将它们定向到特定方向，然后单击 图像。根据组和时间重命名图像文件。
注意： 以不同的时间间隔拍摄照片时，必须使用相同的放大倍率和照明。
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Representative Results
该协议的整体布局如图2所示。通过以下分析评估了辐射的影响和剂量依赖性表征。
X射线诱导毒性的评估
使用体视显微镜，在药物治疗和/或放疗后评估和表征以下异常。根据经合组织指南61，对于鱼类的毒性评估，包括四个主要的顶端终点，包括胚胎凝固、体节形成畸形、尾巴不脱离卵黄囊以及心跳减少或消失，以分析总体毒性61。急性毒性是根据上述任何异常的积极结果确定的。除这四个主要终点外，还对脊柱或尾部弯曲、头部畸形和小头畸形、发育缺陷、心包水肿、卵黄囊畸形、鱼鳔畸形和眼睛结构改变进行了形态学观察（图3C和图4）。放射毒性的评分可以基于生存百分比和/或不同形态异常的评分。
存活率和存活曲线
存活百分比的计算方法是将活胚胎总数除以一组中最初采集的胚胎总数，然后将结果乘以 100 38,50,65。然后，绘制不同时间点、不同实验组对应的值，得到生存曲线;本研究提供了以6 hpf照射的胚胎的存活曲线（图3A）。
与辐射诱导的毒性相关的主要异常（图 3 和图 4）
身体弯曲和尾部弯曲
这是评估斑马鱼胚胎中任何毒性引起的畸形的最常见参数之一50,65,66。身体弯曲畸形可以以不同的模式出现，从低度到中度，再到重度，在肝后尾部区域或身体主轴弯曲，甚至在身体轴和尾部有一个完全半圆形的脊柱或不止一个弯曲。在较低的辐射剂量下，弯曲可能不会出现在所有胚胎中，但可以在大多数胚胎中发展。随着剂量的增加，弯曲的严重程度也会增加并影响所有个体。在这项研究中，在用 10 GY 剂量的辐射治疗的胚胎中观察到这些畸形。
心包和心脏水肿
用毒性暴露（如辐射和超出耐受范围或毒性剂量的药物）治疗的胚胎也会出现心包水肿65,66。暴露于X射线辐射的胚胎会出现心包和心脏水肿，其中液体积聚在心包腔和心脏中，导致心包和心脏肿胀。
卵黄囊水肿、蛋黄增厚、卵黄囊收缩
X射线照射后，一些鱼类的卵黄囊变厚或滞留，暗示X射线辐射的毒性。在某些情况下，还可以看到卵黄延伸较短的整体卵黄囊收缩或卵黄区域的水肿发展。
头部缩小（小头畸形）
重辐射的一个预期结果是头部大小减小或小头畸形，当将治疗过的胚胎与对照组的胚胎进行比较时，可以识别出这一点。
鱼鳔畸形
照射后，少数胚胎的鱼鳔减少或受损，在受到较高辐射剂量的胚胎的情况下，鱼鳔畸形更大，这可能导致暴露于高 X 射线剂量的胚胎的运动能力低或游泳能力降低。
眼睛结构的变化
辐射可导致巨大的 DNA 损伤和蛋白质改变，最终导致细胞死亡和细胞数量减少或特定细胞类型的死亡65。眼睛会受到强烈辐射剂量的影响，并且已经观察到眼睛尺寸小和细胞层减少55。
每分钟心跳次数 （bpm）
通过在立体显微镜下观察胚胎来计算每分钟的心跳。随着辐射剂量的增加，bpm趋于降低（图3B）。考虑五只幼虫计算每组每个时间点的bpm。心跳计数减少可能提示心功能不全66。
使用该方案，10GY的X射线辐射剂量在6hpf照射的斑马鱼胚胎中具有明显毒性。在暴露于2 GY和5 GY的对照组和胚胎中，胚胎没有显着死亡（图3A）。同样，每分钟心跳次数计数表明，随着X射线辐射剂量的增加，心率大大降低。在对照组中，每隔24小时，心率就会增加（图3B）。然而，在每个时间点，心率都随着辐射剂量的增加而降低。然而，暴露于5 GY和10 GY的胚胎直到受精后第5天才显示出显着差异。当心跳大幅下降时，暴露于15 GY和20 GY辐射的胚胎怀疑有严重的心血管变形（图3B）。如前所述，对于在不同时间点暴露于不同剂量辐射的胚胎，描述和评估了不同的表型和发育缺陷（图3C 和 图4）。
图1：斑马鱼胚胎发育阶段。 早期斑马鱼发育不同阶段的代表性图像。覆盖高达 75% epiboly （8 hpf） 的阶段。处于盾牌阶段的胚胎;6 HPF（绿色）用于辐射标准化。比例尺 = 276.4 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：协议的概括概述 。 （A） 育种、胚胎收集和分期。（B）实验设置：在孔板中接种胚胎和药物治疗。（C）暴露于辐射的所需阶段的胚胎和辐射后观察到的表型变化。（D） X光机及其设置的概述。（E） 观测、数据采集和成像。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：不同剂量的 X 射线照射对 6 hpf 斑马鱼胚胎的影响。 （A） 存活曲线显示暴露于从 2 GY 到 20 GY 的单个辐射剂量的斑马鱼胚胎的总存活分数。（B） 在随后的受精日内以 6 hpf 暴露于不同剂量的 X 射线辐射的斑马鱼胚胎每分钟的心跳计数。（C） 暴露于不同剂量辐射（从 2 GY 到 20 GY）的斑马鱼胚胎的代表性图像，以 6 hpf 照射。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：由于辐射诱导的毒性引起的不同形态异常的表示。 （A）72 hpf的对照斑马鱼胚胎和（B）72 hpf的辐射胚胎;上胚呈中度畸形，而下胚有严重畸形。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
斑马鱼在许多研究中被用作有价值的模型，包括几种类型的癌症研究。该模型为大规模药物筛选提供了有用的平台67,68。与任何其他毒性评估方法一样，辐射和/或药物治疗后主要生物学变化的定量评估是该协议最关键的部分。在这类研究中，生存率不能是观察毒性的唯一标准;它需要通过适当的评分系统来评估身体或发育缺陷。在这种情况下，在高达72 hpf的情况下，胚胎暴露于5 GY，10 GY和20 GY的X射线辐射剂量的组之间胚胎的存活率没有太大差异;然而，当在这些特定剂量下检查胚胎的整体形态和表型时，很明显，X射线毒性比通过存活图显示的更严重。在这些剂量下，胚胎形态畸形的严重程度非常高，反映了其整体体型的变化、发育缺陷、重要器官的畸形以及整体活动的变化。即使在 15 GY 和 20 GY 的组中，胚胎甚至不能从绒毛膜中孵化出来，并以剂量依赖性方式表现出充分的畸形。因此，为了评估有毒物质（包括高度致命的 X 射线辐射）的影响，必须以所有可能的方式包括形态学、发育和生理缺陷的评分，并且应该用于评估斑马鱼胚胎或实验过程中施用的不同药物的总体反应。
虽然没有明确的评分系统来具体评估斑马鱼胚胎模型中的放射毒性，但总生存期和/或形态变化，如身体弯曲、心包水肿、卵黄囊变化、小头畸形、鱼鳔和眼睛的变化、心跳变化和运动缺陷已被各种研究考虑在内62，63,64.胚胎的存活率可以根据经合组织指南中描述的心跳或顶端终点的评估进行评估。同时，对此类实验中观察到的形态异常可以单独评分;例如，多个研究者61 采用了弯尾评分。
在与斑马鱼合作并执行此协议时，必须注意某些注意事项。这些包括育种组，它们必须始终属于同一品系的鱼。所有实验必须涉及一种预定义的斑马鱼胚胎菌株。另一个重要因素是胚胎阶段;人们需要对胚胎被照射的发育阶段一丝不苟，因为时间或阶段的轻微变化会导致不同的结果。一些药物在发育的早期阶段给药可能会影响发育或对胚胎造成严重损害，例如 2 hpf。在这种情况下，必须确定药物的适当亚致死剂量，然后才能进行筛选。
对于所有进行的实验，X射线照射参数必须是均匀的。标准 X 射线辐照器的三个重要方面是滤光片类型、辐射剂量和辐照模式以及 X 射线源与物体之间的距离。主要有两种类型的滤光片用于产生 X 射线束：铝滤光片和铜滤光片;然而，在其他情况下，具有不同铜和铝或其他金属组合的滤光片也用于产生 X 射线69。对于斑马鱼胚胎，这里使用cupper滤光片来产生X射线。从 X 射线源到实验对象的距离称为源到被测对象的距离 （SSD）。在这项研究中，SSD 设置为 50 厘米。使用 0.3 mm 铜滤光片进行 X 射线辐射。在0.01-10nm波长范围内以140.32cGY/min的剂量率给予所需剂量的单次曝光。在进行任何放射性实验之前，应标准化适合实验和目标的辐射剂量。研究目的、照射时间和辐射剂量是辐射剂量标准化的三大标准。放疗的时间将包括在胚胎发育的哪个阶段应该给予放疗，以及胚胎将暴露于设定剂量的辐射的时间段。众所周知，在早期发育阶段，辐射的影响是最大的。在该方案中，胚胎在6hpf的发育阶段用不同剂量的辐射（2GY，5GY，10GY，15GY和20GY）照射，并在受精后观察5天。任何偏离通常协议的情况都应明确定义和标准化。
该模型在近纵向研究中研究放射增敏剂或保护剂的作用具有几个优点，例如能够从单个育种中获得多个胚胎，每周从单个亲本水箱中繁殖，将大量胚胎放置在实验组中，在治疗后几天内观察表型效应， 并查看治疗后的一系列表型变量。该模型可以反映辐射对胚胎几乎所有系统的影响，并且可以一次以孔板形式测试多种药物。然而，这种方法也面临着一定的局限性。例如，该模型无法概括高等动物和人类的辐射所显示的所有畸形。此外，由于试剂可用性问题，例如抗体，对这些鱼类进行许多基于蛋白质或机理的研究受到限制。然而，尽管存在这些局限性，斑马鱼被证明是放射学研究的绝佳模型。
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Disclosures
提交人没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
SS 的实验室和 RKS 的实验室由印度 DBT 和 SERB 资助。APM是印度政府ICMR奖学金的获得者。DP是印度政府CSIR奖学金的获得者。联合国是印度政府DST-Inspire奖学金的获得者。 图 2 是使用 Biorender （https://biorender.com） 生成的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
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