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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Larvas de pez cebra como modelo para evaluar posibles radiosensibilizadores o protectores

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64233
Automatic Translation
*1,3, *1,3, 1,4, 2,3, 2, 1
1Tumor microenvironment and animal models lab, Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab, Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

El pez cebra ha sido explotado recientemente como modelo para validar posibles modificadores de radiación. El presente protocolo describe los pasos detallados para utilizar embriones de pez cebra para experimentos de detección basados en radiación y algunos enfoques observacionales para evaluar el efecto de diferentes tratamientos y radiación.

Abstract

El pez cebra se utiliza ampliamente en varios tipos de investigación porque es uno de los modelos de vertebrados de fácil mantenimiento y exhibe varias características de un sistema de modelos único y conveniente. Dado que las células altamente proliferativas son más susceptibles al daño del ADN inducido por la radiación, los embriones de pez cebra son un modelo in vivo de primera línea en la investigación de la radiación. Además, este modelo proyecta el efecto de la radiación y de diferentes fármacos en poco tiempo, junto con los principales eventos biológicos y las respuestas asociadas. En varios estudios oncológicos se ha utilizado el pez cebra, y este protocolo se basa en el uso de modificadores de radiación en el contexto de la radioterapia y el cáncer. Este método se puede utilizar fácilmente para validar los efectos de diferentes fármacos en embriones irradiados y de control (no irradiados), identificando así los fármacos como fármacos radiosensibilizantes o protectores. Aunque esta metodología se utiliza en la mayoría de los experimentos de detección de fármacos, los detalles del experimento y la evaluación de la toxicidad con el trasfondo de la exposición a la radiación de rayos X son limitados o sólo se abordan brevemente, lo que dificulta su realización. Este protocolo aborda este problema y analiza el procedimiento y la evaluación de la toxicidad con una ilustración detallada. El procedimiento describe un enfoque simple para el uso de embriones de pez cebra para estudios de radiación y detección de fármacos basados en radiación con mucha confiabilidad y reproducibilidad.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) es un modelo animal muy conocido que ha sido ampliamente utilizado en la investigación durante las últimas 3 décadas. Es un pequeño pez de agua dulce que es fácil de criar y criar en condiciones de laboratorio. El pez cebra ha sido ampliamente utilizado para diversos estudios toxicológicos y de desarrollo 1,2,3,4,5,6,7,8. El pez cebra tiene alta fecundidad y corta generación embrionaria; Los embriones son adecuados para el seguimiento de diferentes etapas de desarrollo, son visualmente transparentes y son susceptibles a variedades de manipulación genética y plataformas de cribado de alto rendimiento 9,10,11,12,13,14. Además, el pez cebra proporciona imágenes in toto y en vivo para las cuales su proceso de desarrollo y diferentes deformidades en presencia de diversas sustancias o factores tóxicos pueden ser fácilmente estudiados utilizando microscopía estereoscópica o fluorescente 7,15,16.

La radioterapia es uno de los principales modos terapéuticos utilizados en el tratamiento del cáncer 17,18,19,20,21,22,23,24. Sin embargo, la radioterapia contra el cáncer requiere radioprotectores potenciales para proteger a las células sanas normales de la muerte mientras matan las células malignas o salvaguardar la salud humana durante la terapia que involucra radiaciones de alta energía 25,26,27,28,29. Por el contrario, también se están investigando radiosensibilizadores potentes para aumentar la eficiencia de la radiación para matar células malignas, especialmente en terapias dirigidas y de precisión30,31,32,33. Por lo tanto, para validar radioprotectores y sensibilizadores potentes, se solicita encarecidamente un modelo adecuado para el cribado de fármacos de semi-alto rendimiento y que exhiba efectos de radiación de forma mensurable. Varios modelos disponibles se utilizan en estudios de radiación y participan en experimentos de detección de fármacos. Sin embargo, los vertebrados superiores e incluso el modelo in vivo más utilizado, los ratones, no son adecuados para el cribado de fármacos a gran escala porque requiere mucho tiempo, es costoso y difícil diseñar dichos experimentos de cribado con estos modelos. Del mismo modo, los modelos de cultivo celular son ideales para variedades de experimentos de cribado de fármacos de alto rendimiento34,35. Sin embargo, los experimentos que involucran cultivos celulares no siempre son pragmáticos, altamente reproducibles o confiables, ya que las células en cultivo pueden cambiar notablemente su comportamiento de acuerdo con las condiciones de crecimiento y la cinética. Además, las variedades de tipos celulares muestran sensibilización diferencial a la radiación. Cabe destacar que los sistemas de cultivo celular 2D y 3D no representan el escenario de todo el organismo y, por lo tanto, los resultados obtenidos pueden no recapitular el nivel real de radiotoxicidad36,37. En este sentido, el pez cebra ofrece varias ventajas en la detección de nuevos radiosensibilizadores y radioprotectores. La facilidad de manejo, el gran tamaño de la nidada, la corta vida útil, el rápido desarrollo embrionario, la transparencia del embrión y el pequeño tamaño corporal hacen del pez cebra un modelo adecuado para la detección de drogas a gran escala. Debido a las ventajas anteriores, los experimentos se pueden repetir fácilmente en poco tiempo y el efecto se puede observar fácilmente bajo un microscopio de disección en placas de pocillos múltiples. Por lo tanto, el pez cebra está ganando popularidad en la investigación de detección de drogas que involucra estudios de radiación38,39.

El potencial del pez cebra como modelo de buena fe para detectar modificadores de radiación ha sido demostrado en diversos estudios 40,41,42,43,44,45. Se ha descrito el efecto radioprotector de potenciales modificadores de radio, como la nanopartícula DF1, la amifostina (WR-2721), las proteínas de reparación del ADN KU80 y ATM, y las células madre hematopoyéticas trasplantadas, y los efectos de los radiosensibilizadores, como el flavopiridol y AG1478, en el modelo de pez cebra 19,41,42,43,44,45,46 . Utilizando el mismo sistema, se evaluó el efecto radioprotector de DF-1 (nanopartícula de fullereno) tanto a nivel sistémico como a nivel específico de órganos, y también se exploró más a fondo el uso de embriones de pez cebra para el cribado radioprotector47. Recientemente, se informó que la miel de Kelulut es un radioprotector en embriones de pez cebra y se descubrió que aumenta la supervivencia del embrión y previene el daño específico de los órganos, el daño del ADN celular y la apoptosis48.

Del mismo modo, los efectos radioprotectores de los polímeros generados a través de la reacción de Hantzsch se comprobaron en embriones de pez cebra en un cribado de alto rendimiento, y la protección se confirió principalmente protegiendo a las células del daño en el ADN49. En uno de los estudios previos, se encontró la estatina lipofílica fluvastatina como potencial radiosensibilizante utilizando el modelo de pez cebra con este abordaje50. Del mismo modo, las nanopartículas de oro se consideran un radiosensibilizador ideal y se han utilizado en muchos estudios51,52.

El desarrollo embrionario en el pez cebra implica la escisión en las 3 h iniciales en las que un cigoto unicelular se divide para formar 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, 32 células y 64 células que se identifican fácilmente con un microscopio estereoscópico. Luego, alcanza la etapa de blástula con 128 células (2.25 h después de la fertilización, hpf), donde las células se duplican cada 15 min y pasan por las siguientes etapas: 256 células (2.5 hpf), 512 células (2.75 hpf) y alcanzando 1,000+ células en solo 3 h (Figura 1). A las 4 h, el huevo alcanza la etapa de esfera, seguida de la formación de una cúpula en la masa embrionaria 7,53,54. La gastrulación en el pez cebra comienza a partir de 5,25 hpf54, donde alcanza la etapa de escudo. El escudo indica claramente el rápido movimiento de convergencia de las células hacia un lado del anillo germinal (Figura 1) y es una fase prominente y distinta de los embriones gastrulados que se puede identificar fácilmente53,54. Aunque la exposición a la radiación de los embriones podría realizarse en cualquier etapa de su desarrollo, la exposición a la radiación durante la gastrulación podría tener cambios morfológicos más marcados, lo que facilitaría una mejor lectura de las toxicidades inducidas por la radiación55; Del mismo modo, la administración de fármacos a embriones puede iniciarse a partir de las 2 HPF54.

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Protocol

El presente estudio se llevó a cabo con la aprobación previa del Comité Institucional de Ética Animal del Instituto de Ciencias de la Vida de Bhubaneswar y siguiendo las directrices. Todo el mantenimiento y la cría del pez cebra se llevaron a cabo en una instalación de cultivo de peces a temperatura ambiente a 28,5 °C, y los embriones se mantuvieron en una incubadora de demanda biológica de oxígeno (DBO) a una temperatura de 28,5 °C. En este caso, se utilizó la cepa AB de pez cebra y la estadificación se llevó a cabo de acuerdo con Kimmel et al.54. Se administró radiación de rayos X a 6 hpf (estadio de escudo) y se observaron diferentes fenotipos hasta 120 hpf.

1. Instalación de la cría y recogida de embriones

  1. Colocar los tanques de cría (compuestos por policarbonato, capacidad 1 L, ver Tabla de Materiales). Verter el agua del sistema (pH, 6,8-7,5; conductividad, 500 μS; y temperatura, 28,5 °C) en los tanques de cría cubriendo casi el 40% de su volumen. Coloque el divisor en el tanque para crear dos cámaras, una para las mujeres y la otra para los hombres.
  2. De los tanques originales, recoja cuidadosamente dos hembras sanas y un macho sano con la ayuda de una red, colóquelos en sus respectivas mitades y manténgalos en la oscuridad durante la noche (mínimo 10 h) a 28,5 ° C.
  3. A la mañana siguiente, retire el divisor y permita que los peces se apareen sin perturbar los tanques de reproducción.
    NOTA: Las hembras comenzarán a desovar y los huevos se verán en el fondo del tanque dentro de los 10-15 minutos después de que se permita que los peces se apareen56,57,58.
  4. Devolver los peces a sus tanques después del desove, recoger los embriones del tanque de cría con un colador, lavarlos adecuadamente con el agua del sistema y mantener los huevos recolectados en una placa de Petri con medios E-3 (4,94 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,43 mM de CaCl 2, 0,85 mM de sales de MgCl2, 1% p/v de azul de metileno, ver Tabla de Materiales).
  5. Observar los huevos bajo un microscopio de disección, extraer los embriones no fertilizados o muertos con una pipeta Pasteur y mantener las placas de Petri que contienen los huevos fertilizados en el medio E-3 a 28,5 °C en una incubadora para su correcto crecimiento y mantenimiento.
    NOTA: Los huevos no fertilizados se pueden identificar con una apariencia blanca lechosa con un corion coagulado o con células rotas dentro del corion. Junto con los óvulos no fertilizados, los óvulos que no experimentan escisión y los huevos con deformidades como irregularidades durante la escisión, por ejemplo, asimetría, formación de vesículas o lesiones del corion, o que no se desarrollan activamente, deben desecharse para mantener los embriones recolectados sanos y mantener limpios los medios 7,56.

2. Seguimiento de embriones y selección para experimentos de radiación

  1. Monitoree los embriones en crecimiento bajo el microscopio de disección, identifique la etapa adecuada 7,54 y elimine los embriones muertos o enfermos. Asegurar una estadificación adecuada de los embriones, ya que la radiación y las dosis de fármacos se administrarán en una etapa particular de gastrulación.
    NOTA: Todos los días, verifique el nivel y la calidad de los medios en las placas de cultivo. Cambiar el medio cada 24 h, junto con la extracción de embriones muertos. Las pipetas Pasteur se prefieren para recoger embriones o cambiar de medio.
  2. Antes de comenzar el experimento, distribuya cuidadosamente los embriones sanos en las placas experimentales con la ayuda de una pipeta Pasteur. Para cada grupo experimental, tome de 15 a 20 embriones.
    NOTA: Coloque solo embriones sanos de las etapas de desarrollo deseadas en la placa experimental. Supongamos que el tratamiento farmacológico tiene que hacerse con embriones a 6 hpf, y luego comenzar a sembrarlos en placas experimentales al menos 30-60 min antes.

3. Tratamiento farmacológico

  1. Agregue medicamentos de la concentración deseada a los embriones de pez cebra. Prepare el medio E-3 que contiene el fármaco con mucha antelación. Asegúrese de que la solución madre del fármaco no tenga ningún fármaco sin disolver antes de preparar los medios de trabajo para el tratamiento de embriones de pez cebra.
  2. Antes de agregar cualquier fármaco a un medio para la detección de radiación, verifique el efecto citotóxico del fármaco con los grados de concentración del fármaco. Seguir las guías de la OCDE para evaluar la CL 50 de los fármacos evaluados 59,60,61.
    NOTA: Tenga cuidado al mover las placas y platos durante el tiempo de irradiación u observación. Hay muchas posibilidades de que las placas se alteren durante esta manipulación, lo que hará que los medios se filtren fuera de los pocillos o que los embriones se derramen fuera de sus respectivos pocillos, contaminando potencialmente los pozos cercanos y arruinando el experimento.

4. Irradiación de rayos X

  1. Al organizar un experimento de radiación, incluya un grupo de control/no irradiado y un grupo de solo radiación. Del mismo modo, al realizar un cribado de drogas, incluya otro grupo en el que los fármacos se administrarán con la misma concentración que los administrados en el experimento de cribado junto con la radiación.
    NOTA: Etiquete tanto la tapa como la base de los platos de pocillos o platos de cultivo para que las tapas no se extravíen.
  2. Distribuir los embriones en una placa de pocillos si los escudos de radiación pueden cubrir y proteger los pocillos adicionales de la radiación mientras los otros pocillos están expuestos a una dosis de radiación particular; De lo contrario, use placas o discos individuales para sembrar los embriones por dosis de radiación.
  3. Encienda la máquina del irradiador de rayos X (consulte la Tabla de materiales) e inicie la inicialización y el calentamiento de la máquina.
    NOTA: El valor de la distancia entre la fuente y el sujeto (SSD) debe ser de 50 cm; se pueden usar diferentes SSD una vez más, lo que requiere estandarización.
  4. Coloque la placa experimental debajo del irradiador dentro de la máquina en el centro, asegurándose de que la placa esté directamente debajo de la fuente de rayos X, y luego ajuste la dosis (por ejemplo, 5 GY) e inicie la radiografía.
    NOTA: Selle las placas con una película de parafina para evitar derrames o contaminación no deseados durante el transporte de las placas desde la incubadora hasta el irradiador y viceversa.
  5. Después de completar la irradiación, saque las placas, apague el programa de la máquina, apague la máquina y revise las placas bajo el microscopio inmediatamente después de la radiación. Retire los embriones muertos y devuelva las placas a la incubadora a 28,5 °C. Registre el número de embriones muertos después de evaluarlos bajo el microscopio de disección.
    NOTA: Irradie los diferentes grupos de embriones con las dosis de radiación designadas sin mucha demora entre los grupos individuales, ya que el efecto de la radiación puede verse afectado significativamente por la diferencia en la etapa de desarrollo.
    PRECAUCIÓN: Mientras opera la máquina de rayos X, tome las medidas de protección adecuadas.

5. Recopilación, obtención de imágenes y análisis de datos

  1. Recopile datos a intervalos de tiempo predeterminados, como cada 24 horas después de la administración de la radiación. Registre todas las observaciones posibles, como la supervivencia, la eficiencia de eclosión, la etapa de desarrollo, el recuento de latidos cardíacos, la curvatura del cuerpo y la cola, el edema pericárdico, la extensión del saco vitelino, la microcefalia, el desarrollo de la vejiga natatoria, la motilidad o actividad general, etc.62,63,64.
  2. Para capturar imágenes, elija embriones representativos en un portaobjetos limpio, revise los embriones bajo el microscopio, oriéntelos en una dirección particular y haga clic en las imágenes. Cambie el nombre de los archivos de imagen según el grupo y la hora.
    NOTA: Se debe utilizar el mismo aumento e iluminación al capturar imágenes en diferentes intervalos de tiempo.

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Representative Results

El diseño general del protocolo se muestra en la Figura 2. El efecto de la radiación y la caracterización de manera dosis-dependiente se evaluó con los siguientes análisis.

Evaluación de las toxicidades inducidas por rayos X
Utilizando un microscopio estereoscópico, se evaluaron y caracterizaron las siguientes anomalías después del tratamiento farmacológico y/o la radiación. De acuerdo con las directrices 61 de la OCDE, para la evaluación de la toxicidad en peces, se incluyeron cuatro criterios principales de valoración apical, que incluyen la coagulación de los embriones, las deformidades en la formación de somitas, la no separación de la cola del saco vitelino y la reducción o ausencia de latidos cardíacos, para analizar la toxicidad general61. La toxicidad aguda se determinó en función de un resultado positivo en cualquiera de las anomalías anteriores. Además de estos cuatro criterios de valoración principales, también se llevó a cabo la observación morfológica de la flexión de la columna vertebral o de la cola, la malformación de la cabeza y la microcefalia, los defectos en el desarrollo, el edema pericárdico, las deformidades del saco vitelino, las deformidades de la vejiga natatoria y los cambios en la estructura ocular (Figura 3C y Figura 4). La puntuación de la radiotoxicidad podría basarse en el porcentaje de supervivencia y/o en la puntuación de diferentes anomalías morfológicas.

Porcentaje de supervivencia y curva de supervivencia
El porcentaje de supervivencia se calculó dividiendo el total de embriones vivos por el número total de embriones tomados inicialmente en un grupo y multiplicando el resultado por 100 38,50,65. A continuación, se graficaron los valores correspondientes a diferentes puntos temporales y diferentes grupos experimentales para obtener la curva de supervivencia. Este estudio proporciona la curva de supervivencia de los embriones irradiados a 6 hpf (Figura 3A).

Anomalías importantes asociadas con la toxicidad inducida por la radiación (Figura 3 y Figura 4)
Curvatura del cuerpo y flexión de la cola
Este es uno de los parámetros más comunes para evaluar cualquier deformidad inducida por toxicidad en embriones de pez cebra 50,65,66. Las deformidades de la curvatura del cuerpo se pueden ver en diferentes patrones que van desde bajas, a moderadas, a severas, con flexión en la región de la cola posthepática o en el eje principal del cuerpo o incluso con una columna vertebral completamente semicircular o más de una flexión en el eje del cuerpo y en la cola. A dosis de radiación más bajas, la flexión puede no aparecer en todos los embriones, pero puede desarrollarse en la mayoría de los embriones. Con un aumento en la dosis, la gravedad de la flexión también aumenta y afecta a todos los individuos. En este estudio, estas deformidades se observaron en los embriones tratados con una dosis de radiación de 10 GY.

Edema pericárdico y cardíaco
Los embriones tratados con exposiciones tóxicas como radiación y fármacos más allá de los rangos tolerables o en dosis tóxicas también desarrollan edema pericárdico65,66. Los embriones expuestos a la radiación de rayos X muestran edema pericárdico y cardíaco, en el que se acumula líquido en la cavidad pericárdica y el corazón, lo que resulta en un pericardio y un corazón inflamados.

Edema del saco vitelino, engrosamiento de la yema y constricción del saco vitelino
Después de la exposición a los rayos X, se observa que el saco vitelino de algunos peces está engrosado o retenido, lo que implica la toxicidad de la radiación de rayos X. En algunos casos, también se puede observar una constricción general del saco vitelino, donde la extensión de la yema es corta, o el desarrollo de edema en la región viteliana.

Reducción del tamaño de la cabeza (microcefalia)
Un resultado esperado de la radiación intensa es la reducción del tamaño de la cabeza, o microcefalia, que se puede identificar cuando se comparan los embriones tratados con los embriones del grupo de control.

Deformidades de la vejiga natatoria
Después de la irradiación, se observa que la vejiga natatoria está reducida o comprometida en unos pocos embriones, y la deformidad de la vejiga natatoria es mayor en el caso de embriones sometidos a dosis de radiación más altas, lo que puede contribuir a la baja locomoción o a la reducción de la capacidad de natación en los embriones expuestos a altas dosis de rayos X.

Cambio en la estructura de los ojos
La radiación puede causar enormes daños en el ADN y alteraciones de proteínas, que eventualmente causan la muerte celular y una reducción en el número de células o la muerte de tipos celulares específicos65. El ojo puede verse afectado por dosis intensas de radiación, y se ha observado un tamaño pequeño del ojo y una disminución de sus capas celulares55.

Latidos por minuto (lpm)
Los latidos del corazón por minuto se contaron observando los embriones bajo el microscopio estereoscópico. A medida que aumenta la dosis de radiación, las pulsaciones por minuto tienden a disminuir (Figura 3B). Se consideraron cinco larvas para calcular las lpm en cada punto de tiempo por grupo. Una disminución en el recuento de latidos cardíacos podría indicar disfunción cardíaca66.

Usando este protocolo, la dosis de radiación de rayos X de 10 GY fue visiblemente tóxica en embriones de pez cebra irradiados a 6 hpf. En el grupo control y en los embriones expuestos a 2 GY y 5 GY, no hubo muerte significativa en los embriones (Figura 3A). Del mismo modo, el recuento de latidos cardíacos por minuto sugirió que la frecuencia cardíaca disminuyó enormemente con el aumento de las dosis de radiación de rayos X. En el grupo control, cada intervalo de 24 horas, se observó un aumento de la frecuencia cardíaca (Figura 3B). Sin embargo, en cada momento, la frecuencia cardíaca disminuyó con un aumento de la dosis de radiación. Sin embargo, los embriones expuestos a 5 GY y 10 GY no mostraron diferencias significativas hasta el día 5 post-fecundación. Se sospecha una deformación cardiovascular severa en embriones expuestos a radiación de 15 GY y 20 GY a medida que los latidos cardíacos disminuyeron enormemente (Figura 3B). Como se discutió anteriormente, se describen y evalúan diferentes defectos fenotípicos y de desarrollo para embriones expuestos a diferentes dosis de radiación en diferentes momentos (Figura 3C y Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Etapas del desarrollo embrionario del pez cebra. Imágenes representativas de diferentes etapas del desarrollo temprano del pez cebra. Se cubren etapas de hasta un 75% de epibolía (8 hpf). Embriones en estado de escudo; 6 HPF (color verde) se utiliza para la estandarización de la radiación. Barra de escala = 276,4 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema general del protocolo . (A) Reproducción, recolección de embriones y estadificación. (B) Montaje experimental: siembra de embriones en placas de pocillos y tratamiento farmacológico. (C) Embriones de los estadios requeridos expuestos a la radiación y cambios fenotípicos observados después de la radiación. (D) Un esquema de la máquina de rayos X y su configuración. (E) Observaciones, adquisición de datos e imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto de diferentes dosis de irradiación de rayos X en embriones de pez cebra de 6 hpf. (A) Curva de supervivencia que muestra la fracción total superviviente de embriones de pez cebra expuestos a dosis individuales de radiación a partir de 2 GY a 20 GY. (B) Recuento de latidos cardíacos por minuto de embriones de pez cebra expuestos a diferentes dosis de radiación de rayos X a 6 hpf en los días posteriores a la fertilización. (C) Imágenes representativas de embriones de pez cebra expuestos a dosis variables de radiación (de 2 GY a 20 GY), irradiados a 6 hpf. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Representación de diferentes anomalías morfológicas debidas a la toxicidad inducida por la radiación. (A) embriones de pez cebra de control a 72 hpf y (B) embriones radiados a 72 hpf; El embrión superior muestra deformidades moderadas, mientras que el embrión inferior presenta deformidades severas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El pez cebra se utiliza como modelos valiosos en muchos estudios, incluidos varios tipos de investigación sobre el cáncer. Este modelo proporciona una plataforma útil para el cribado de drogas a gran escala67,68. Al igual que cualquier otro método de evaluación de la toxicidad, la evaluación cuantitativa de los principales cambios biológicos tras el tratamiento con radiación y/o fármacos es la parte más crucial de este protocolo. En este tipo de estudios, la supervivencia no debe ser el único criterio para observar la toxicidad; Necesita ser respaldado con la evaluación de defectos físicos o de desarrollo mediante sistemas de puntuación adecuados. En este caso, también, hasta 72 hpf, la supervivencia en embriones no es muy diferente entre los grupos en los que los embriones están expuestos a dosis de radiación de rayos X de 5 GY, 10 GY y 20 GY; sin embargo, cuando se comprueba la morfología general y los fenotipos de los embriones a estas dosis particulares, está claro que la toxicidad de los rayos X es más grave de lo que parece en el gráfico de supervivencia. La gravedad de la deformidad morfológica en los embriones a estas dosis es muy alta, lo que refleja cambios en su tamaño corporal general, defectos en el desarrollo, malformación de órganos vitales y cambios en su actividad general. Incluso en el grupo de 15 GY y 20 GY, los embriones ni siquiera pueden salir del corion y exhiben amplias deformidades de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, para evaluar el efecto de las sustancias tóxicas, incluida la radiación de rayos X altamente mortal, la puntuación de los defectos morfológicos, de desarrollo y fisiológicos debe incluirse de todas las formas posibles, y debe utilizarse para evaluar la respuesta general de los embriones de pez cebra o de los diferentes fármacos administrados en el curso del experimento.

Aunque no existen sistemas de puntuación definitivos para evaluar la radiotoxicidad en el modelo embrionario de pez cebra específicamente, la supervivencia global y/o los cambios morfológicos como la flexión en el cuerpo, el edema pericárdico, los cambios en el saco vitelino, la microcefalia, los cambios en la vejiga natatoria y el ojo, los cambios en los latidos del corazón y los defectos en la locomoción se han tenido en cuenta en varios estudios62. 63,64. La supervivencia de los embriones podría evaluarse en función de los latidos del corazón o de la evaluación de los criterios de valoración apicales, tal y como se describe en las directrices de la OCDE. Al mismo tiempo, las anomalías morfológicas observadas en tales experimentos podrían puntuarse individualmente; Por ejemplo, la puntuación de la flexión de la cola ha sido adoptada por múltiples investigadores61.

Al trabajar con el pez cebra y llevar a cabo este protocolo, hay que tener cuidado con ciertas consideraciones. Entre ellos se encuentra el grupo de cría, que siempre debe pertenecer a la misma cepa de peces. Todos los experimentos deben involucrar una cepa predefinida de embrión de pez cebra. Otro factor importante es la etapa embrionaria; Es necesario ser meticuloso con la etapa de desarrollo en la que se irradian los embriones, ya que un ligero cambio en el momento o la etapa conducirá a resultados diferentes. Algunos medicamentos pueden afectar el desarrollo o causar daños graves a los embriones cuando se administran en una etapa temprana del desarrollo, como 2 hpf. En ese caso, se debe determinar la dosis subletal adecuada de la droga y luego se puede llevar a cabo la detección.

Los parámetros de irradiación de rayos X deben ser uniformes para todos los experimentos realizados. Los tres aspectos importantes de un irradiador de rayos X estándar son el tipo de filtro, la dosis de radiación y el patrón de irradiación, y la distancia entre la fuente de rayos X y el objeto. Hay principalmente dos tipos de filtros que se utilizan para generar haces de rayos X: filtros de aluminio y filtros de cobre; sin embargo, también se utilizan filtros con diferentes combinaciones de cobre y aluminio u otros metales para generar rayos X en otros casos69. En el caso de los embriones de pez cebra, el filtro del catéter se utiliza aquí para producir rayos X. La distancia desde la fuente de rayos X hasta el sujeto experimental se denomina distancia entre la fuente y el sujeto (SSD). En este estudio, el SSD se estableció en 50 cm. La radiación de rayos X se administró utilizando un filtro de Cu de 0,3 mm. Se administró una sola exposición de la dosis deseada a una tasa de dosis de 140,32 cGY/min dentro del rango de longitud de onda de 0,01-10 nm. Antes de llevar a cabo cualquier experimento radiológico, se debe estandarizar la dosis de radiación adecuada para el experimento y el objetivo. El propósito del estudio, el momento de la irradiación y la dosis de radiación son los tres criterios principales para la estandarización de la dosis de radiación. El momento de la radiación incluirá tanto en qué etapa del desarrollo embrionario se debe administrar la radiación como el período de tiempo durante el cual el embrión estará expuesto a la radiación de una dosis establecida. Es bien sabido que, en las primeras etapas del desarrollo, el efecto de la radiación se maximiza. En este protocolo, los embriones fueron irradiados en una etapa de desarrollo de 6 hpf con diferentes dosis de radiación (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY y 20 GY) y observados durante 5 días después de la fertilización. Cualquier desviación del protocolo habitual debe estar claramente definida y estandarizada.

Este modelo tiene varias ventajas para estudiar el efecto de los radiosensibilizadores o protectores en un estudio casi longitudinal, como la capacidad de obtener varios embriones de cría individual, de criar cada semana a partir de un único tanque parental, de colocar un número significativo de embriones en grupos experimentales, de observar efectos fenotípicos en pocos días después del tratamiento, y ver un espectro de variables fenotípicas después de los tratamientos. Este modelo puede reflejar el impacto de la radiación en casi todos los sistemas del embrión, y se pueden probar múltiples fármacos a la vez en formatos de placas de pocillos. Sin embargo, este enfoque también se enfrenta a ciertas limitaciones. Por ejemplo, este modelo no puede recapitular todas las deformidades mostradas por las radiaciones en animales superiores y humanos. Además, muchos estudios basados en proteínas o mecanicistas en estos peces son limitados debido a problemas de disponibilidad de reactivos, como en el caso de los anticuerpos. Sin embargo, a pesar de estas limitaciones, el pez cebra demuestra ser un excelente modelo para estudios radiológicos.

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Disclosures

Los autores han declarado que no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgments

El laboratorio de SS y el laboratorio de RKS están financiados por subvenciones de DBT y SERB, India. APM es beneficiaria de la beca ICMR del Gobierno de la India. El PD ha recibido la beca CSIR del Gobierno de la India. La ONU ha recibido la beca DST-Inspire del Gobierno de la India. La Figura 2 se generó utilizando Biorender (https://biorender.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Well plates Corning CLS3335 Polystyrene
B.O.D Incubator Oswald JRIC-10
Calcium Chloride Fisher Scientific 10101-41-4
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTE Polycarbonate
Glass petriplates Borosil 3165A75 Glass
GraphpadPrism GraphPad Software, Inc. Version 5.01
Kline concavity slides Himedia GW092-1PK Glass
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Methylene blue hydrate Sigma-Aldrich 66720-100G
Parafilm Tarsons 380020 Paraffin film
Pasteur pipettes Himedia PW1212-1X500NO Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTI Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTD Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTL Polycarbonate
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet SRL 1949181
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Larvas de Pez Cebra Modelo Radiosensibilizadores Protectores Investigación de la Radiación Modelo In Vivo Daño al ADN Inducido por la Radiación Estudios de Cáncer Modificadores de la Radiación Radioterapia Detección de Drogas Evaluación de la Toxicidad Exposición a la Radiación de Rayos X Procedimiento Confiabilidad Reproducibilidad
Larvas de pez cebra como modelo para evaluar posibles radiosensibilizadores o protectores
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Mohapatra, A. P., Parida, D.,… More

Mohapatra, A. P., Parida, D., Mohapatra, D., Nayak, U., Swain, R. K., Senapati, S. Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors. J. Vis. Exp. (186), e64233, doi:10.3791/64233 (2022).

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