Summary
Il pesce zebra è stato recentemente sfruttato come modello per convalidare potenziali modificatori di radiazioni. Il presente protocollo descrive i passaggi dettagliati per utilizzare embrioni di zebrafish per esperimenti di screening basati su radiazioni e alcuni approcci osservazionali per valutare l'effetto di diversi trattamenti e radiazioni.
Abstract
Il pesce zebra è ampiamente utilizzato in diversi tipi di ricerca perché è uno dei modelli di vertebrati di facile manutenzione e presenta diverse caratteristiche di un sistema modello unico e conveniente. Poiché le cellule altamente proliferative sono più suscettibili ai danni al DNA indotti dalle radiazioni, gli embrioni di zebrafish sono un modello in vivo di prima linea nella ricerca sulle radiazioni. Inoltre, questo modello proietta l'effetto delle radiazioni e di diversi farmaci in un breve lasso di tempo, insieme ai principali eventi biologici e alle risposte associate. Diversi studi sul cancro hanno utilizzato il pesce zebra e questo protocollo si basa sull'uso di modificatori di radiazioni nel contesto della radioterapia e del cancro. Questo metodo può essere facilmente utilizzato per convalidare gli effetti di diversi farmaci su embrioni irradiati e di controllo (non irradiati), identificando così i farmaci come farmaci radiosensibilizzanti o protettivi. Sebbene questa metodologia sia utilizzata nella maggior parte degli esperimenti di screening farmacologico, i dettagli dell'esperimento e la valutazione della tossicità con lo sfondo dell'esposizione alle radiazioni a raggi X sono limitati o solo brevemente affrontati, rendendone difficile l'esecuzione. Questo protocollo affronta questo problema e discute la procedura e la valutazione della tossicità con un'illustrazione dettagliata. La procedura descrive un approccio semplice per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per studi di radioterapia e screening farmacologico basato su radiazioni con molta affidabilità e riproducibilità.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è un noto modello animale che è stato ampiamente utilizzato nella ricerca negli ultimi 3 decenni. È un piccolo pesce d'acqua dolce facile da allevare e allevare in condizioni di laboratorio. Il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato per vari studi sullo sviluppo e tossicologici 1,2,3,4,5,6,7,8. Il pesce zebra ha un'elevata fecondità e una breve generazione embrionale; Gli embrioni sono adatti a seguire le diverse fasi di sviluppo, sono visivamente trasparenti e sono suscettibili di manipolazioni genetiche e piattaforme di screening ad alto rendimento 9,10,11,12,13,14. Inoltre, il pesce zebra fornisce immagini in toto e dal vivo per le quali il suo processo di sviluppo e le diverse deformità in presenza di varie sostanze o fattori tossici possono essere facilmente studiati utilizzando la microscopia stereoscopica o fluorescente 7,15,16.
La radioterapia è una delle principali modalità terapeutiche utilizzate nel trattamento del cancro 17,18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, la radioterapia del cancro richiede potenziali radioprotettori per proteggere le cellule sane normali dalla morte mentre uccidono le cellule maligne o salvaguardare la salute umana durante la terapia che coinvolge radiazioni ad alta energia 25,26,27,28,29. Al contrario, potenti radiosensibilizzanti sono anche in fase di studio per aumentare l'efficienza delle radiazioni nell'uccidere le cellule maligne, specialmente nelle terapie mirate e di precisione30,31,32,33. Pertanto, per convalidare potenti radioprotettori e sensibilizzanti, è molto richiesto un modello adatto per lo screening di farmaci a semi-alto rendimento e che mostri in modo misurabile gli effetti delle radiazioni. Diversi modelli disponibili sono utilizzati negli studi sulle radiazioni e coinvolti negli esperimenti di screening farmacologico. Tuttavia, i vertebrati superiori e anche il modello in vivo più comunemente usato, i topi, non sono adatti per lo screening farmacologico su larga scala perché è dispendioso in termini di tempo, costoso e impegnativo progettare tali esperimenti di screening con questi modelli. Allo stesso modo, i modelli di coltura cellulare sono ideali per varietà di esperimenti di screening farmacologico ad alto rendimento34,35. Tuttavia, gli esperimenti che coinvolgono la coltura cellulare non sono sempre pragmatici, altamente riproducibili o affidabili poiché le cellule in coltura possono cambiare notevolmente il loro comportamento in base alle condizioni di crescita e alla cinetica. Inoltre, varietà di tipi cellulari mostrano una sensibilizzazione differenziale alle radiazioni. In particolare, i sistemi di coltura cellulare 2D e 3D non rappresentano lo scenario dell'intero organismo e, pertanto, i risultati ottenuti potrebbero non ricapitolare l'effettivo livello di radiotossicità36,37. A questo proposito, il pesce zebra offre diversi vantaggi nello screening di nuovi radiosensibilizzanti e radioprotettori. La facilità d'uso, le grandi dimensioni della covata, la breve durata della vita, il rapido sviluppo embrionale, la trasparenza dell'embrione e le piccole dimensioni del corpo rendono il pesce zebra un modello adatto per lo screening farmacologico su larga scala. Grazie ai vantaggi di cui sopra, gli esperimenti possono essere facilmente ripetuti in breve tempo e l'effetto può essere osservato facilmente al microscopio da dissezione in piastre a più pozzetti. Quindi, il pesce zebra sta guadagnando popolarità nella ricerca sullo screening dei farmaci che coinvolge studi sulle radiazioni38,39.
Il potenziale del pesce zebra come modello in buona fede per lo screening dei modificatori delle radiazioni è stato dimostrato in vari studi 40,41,42,43,44,45. L'effetto radioprotettivo di potenziali radiomodificatori, come la nanoparticella DF1, l'amifostina (WR-2721), le proteine di riparazione del DNA KU80 e ATM e le cellule staminali ematopoietiche trapiantate, e gli effetti dei radiosensibilizzanti, come flavopiridol e AG1478, nel modello di zebrafish sono stati riportati 19,41,42,43,44,45,46 . Utilizzando lo stesso sistema, è stato valutato l'effetto radioprotettivo di DF-1 (nanoparticella di fullerene) sia a livello sistemico che organo-specifico, ed è stato ulteriormente esplorato anche l'uso di embrioni di pesce zebra per lo screening radioprotettore47. Recentemente, il miele di Kelulut è stato segnalato come radioprotettore negli embrioni di zebrafish ed è stato scoperto che aumenta la sopravvivenza dell'embrione e previene il danno organo-specifico, il danno al DNA cellulare e l'apoptosi48.
Allo stesso modo, gli effetti radioprotettivi dei polimeri generati tramite la reazione di Hantzsch sono stati verificati su embrioni di zebrafish in uno screening ad alto rendimento e la protezione è stata conferita principalmente proteggendo le cellule dai danni al DNA49. In uno degli studi precedenti, la statina lipofila fluvastatina è stata trovata come potenziale radiosensibilizzante utilizzando il modello del pesce zebra con questo approccio50. Allo stesso modo, le nanoparticelle d'oro sono considerate un radiosensibilizzante ideale e sono state utilizzate in molti studi51,52.
Lo sviluppo embrionale nel pesce zebra comporta la scissione nelle prime 3 ore in cui uno zigote unicellulare si divide per formare 2 cellule, 4 cellule, 8 cellule, 16 cellule, 32 cellule e 64 cellule che sono facilmente identificabili con uno stereomicroscopio. Quindi, raggiunge lo stadio di blastula con 128 cellule (2,25 h post-fecondazione, hpf), dove le cellule raddoppiano ogni 15 minuti e procedono attraverso queste seguenti fasi: 256 cellule (2,5 hpf), 512 cellule (2,75 hpf) e raggiungendo 1.000+ cellule in sole 3 ore (Figura 1). A 4 ore, l'uovo raggiunge lo stadio di sfera, seguito dalla formazione di una forma a cupola nella massa embrionale 7,53,54. La gastrulazione nel pesce zebra parte da 5,25 hpf54, dove raggiunge lo stadio di scudo. Lo scudo indica chiaramente il rapido movimento di convergenza delle cellule su un lato dell'anello germinale (Figura 1) ed è una fase prominente e distinta degli embrioni gastrulanti che può essere facilmente identificata53,54. Sebbene l'esposizione alle radiazioni agli embrioni possa essere effettuata in qualsiasi fase del loro sviluppo, l'esposizione alle radiazioni durante la gastrulazione potrebbe avere cambiamenti morfologici più distinti che facilitano una migliore lettura delle tossicità indotte dalle radiazioni55; Allo stesso modo, la somministrazione di farmaci agli embrioni può essere iniziata già a partire da 2 HPF54.
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Protocol
Il presente studio è stato condotto con la previa approvazione e seguendo le linee guida dell'Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Tutti gli interventi di mantenimento e riproduzione del pesce zebra sono stati condotti in un impianto di coltura a temperatura ambiente a 28,5 °C e gli embrioni sono stati mantenuti in un'incubatrice a domanda biologica di ossigeno (BOD) a una temperatura di 28,5 °C. In questo caso, è stato utilizzato il ceppo AB del pesce zebra e la stadiazione è stata eseguita secondo Kimmel et al.54. La radiazione a raggi X è stata somministrata a 6 hpf (stadio di schermatura) e sono stati osservati diversi fenotipi fino a 120 hpf.
1. Allevamento e raccolta embrionale
- Impostare le vasche di allevamento (costituite da policarbonato, capacità 1 L, vedi Tabella dei Materiali). Versare l'acqua del sistema (pH, 6,8-7,5; conducibilità, 500 μS; e temperatura, 28,5 °C) nelle vasche di allevamento coprendo quasi il 40% del suo volume. Posiziona il divisore nella vasca per creare due camere, una per le femmine e l'altra per i maschi.
- Dalle vasche madri, raccogliere con cura due femmine sane e un maschio sano con l'aiuto di una rete, metterli nelle rispettive metà e tenerli al buio per una notte (minimo 10 ore) a 28,5 °C.
- La mattina dopo, rimuovete il divisorio e lasciate che i pesci si accoppino senza disturbare le vasche di allevamento.
NOTA: Le femmine inizieranno a deporre le uova e le uova saranno viste sdraiate sul fondo della vasca entro 10-15 minuti dopo che i pesci sono stati autorizzati ad accoppiarsi56,57,58. - Riportare i pesci nelle loro vasche dopo la deposizione delle uova, raccogliere gli embrioni dalla vasca di riproduzione utilizzando un colino, lavarli accuratamente con l'acqua del sistema e conservare le uova raccolte in una piastra di Petri con terreno E-3 (4,94 mM di NaCl, 0,17 mM di KCl, 0,43 mM di CaCl 2 , 0,85 mM di sali di MgCl2, 1% p/v di blu di metilene, vedi Tabella dei Materiali).
- Osservare gli ovuli al microscopio da dissezione, rimuovere gli embrioni non fecondati o morti utilizzando una pipetta Pasteur e conservare le piastre di Petri contenenti uova fecondate nel terreno E-3 a 28,5 °C in un'incubatrice per la loro corretta crescita e mantenimento.
NOTA: Gli ovuli non fecondati possono essere identificati con un aspetto bianco latte con un corion coagulato o con cellule rotte all'interno del corion. Insieme agli ovuli non fecondati, gli ovuli non sottoposti a scissione e gli ovuli con deformità come irregolarità durante la scissione, ad esempio asimmetria, formazione di vescicole o lesioni del corion, o che non si sviluppano attivamente, devono essere scartati per mantenere sani gli embrioni raccolti e per mantenere puliti i terreni 7,56.
2. Monitoraggio degli embrioni e selezione per esperimenti di radioterapia
- Monitorare gli embrioni in crescita al microscopio da dissezione, identificare lo stadiocorretto 7,54 e rimuovere eventuali embrioni morti o malati. Garantire un'adeguata stadiazione dell'embrione poiché le dosi di radiazioni e farmaci saranno somministrate in una particolare fase di gastrulazione.
NOTA: Ogni giorno, controllare il livello e la qualità dei terreni nei piatti di coltura. Cambiare il terreno ogni 24 ore, oltre a rimuovere gli embrioni morti. Le pipette Pasteur sono preferite per essere utilizzate per il prelievo di embrioni o per il cambio di terreno. - Prima di iniziare l'esperimento, distribuire accuratamente gli embrioni sani nelle piastre sperimentali con l'aiuto di una pipetta Pasteur. Per ogni gruppo sperimentale, prelevare 15-20 embrioni.
NOTA: Collocare nella piastra sperimentale solo embrioni sani degli stadi di sviluppo desiderati. Supponiamo che il trattamento farmacologico debba essere fatto con embrioni a 6 hpf, quindi iniziare a seminarli in piastre sperimentali almeno 30-60 minuti prima.
3. Trattamento farmacologico
- Aggiungere farmaci della concentrazione desiderata agli embrioni di zebrafish. Preparare il terreno E-3 contenente il farmaco con largo anticipo. Assicurarsi che la soluzione madre del farmaco non contenga farmaco non disciolto prima di preparare il terreno di lavoro per il trattamento degli embrioni di zebrafish.
- Prima di aggiungere qualsiasi farmaco a un mezzo per lo screening radioattivo, controllare l'effetto citotossico del farmaco con i gradi di concentrazione del farmaco. Seguire le linee guida dell'OCSE per valutare la LC 50 dei farmaci in valutazione 59,60,61.
NOTA: Prestare attenzione durante lo spostamento delle piastre e delle stoviglie durante l'irradiazione o il tempo di osservazione. Ci sono molte possibilità che le piastre vengano disturbate durante questa manipolazione, causando la fuoriuscita del terreno dai pozzetti o la fuoriuscita degli embrioni dai rispettivi pozzetti, contaminando potenzialmente i pozzi vicini e rovinando l'esperimento.
4. Irradiazione a raggi X
- Durante l'impostazione di un esperimento sulle radiazioni, includere un gruppo di controllo/non irradiato e un gruppo di sole radiazioni. Allo stesso modo, durante l'esecuzione di uno screening farmacologico, includere un altro gruppo in cui i farmaci verranno somministrati con la stessa concentrazione di quelli somministrati nell'esperimento di screening insieme alle radiazioni.
NOTA: Etichettare sia il coperchio che la base delle piastre a pozzetti o delle piastre di coltura in modo che i coperchi non vengano smarriti. - Distribuire gli embrioni in una piastra a pozzetti se gli schermi antiradiazioni possono coprire e proteggere i pozzetti extra dalle radiazioni mentre gli altri pozzetti sono esposti a una particolare dose di radiazioni; In caso contrario, utilizzare piastre o dischi individuali per seminare gli embrioni per dose di radiazioni.
- Accendere l'irradiatore a raggi X (vedere la tabella dei materiali) e avviare l'inizializzazione e il riscaldamento della macchina.
NOTA: Il valore della distanza dalla sorgente al soggetto (SSD) deve essere di 50 cm; è possibile utilizzare SSD diversi ancora una volta, il che richiede la standardizzazione. - Posizionare la piastra sperimentale sotto l'irradiatore all'interno della macchina al centro, assicurandosi che la piastra sia direttamente sotto la sorgente di raggi X, quindi impostare la dose (ad es. 5 GY) e avviare la radiografia.
NOTA: Sigillare le piastre con pellicola di paraffina per evitare fuoriuscite o contaminazioni indesiderate durante il trasporto delle piastre dall'incubatore all'irradiatore e viceversa. - Al termine dell'irradiazione, estrarre le piastre, chiudere il programma della macchina, spegnere la macchina e controllare le piastre al microscopio subito dopo la radiazione. Rimuovere gli embrioni morti e rimettere le piastre nell'incubatrice a 28,5 °C. Registrare il numero di embrioni morti dopo averli valutati al microscopio da dissezione.
NOTA: Irradiare i diversi gruppi di embrioni con dosi di radiazioni designate senza troppi ritardi tra i singoli gruppi, poiché l'effetto delle radiazioni può essere significativamente influenzato dalla differenza nella fase di sviluppo.
ATTENZIONE: Durante il funzionamento della macchina a raggi X, adottare misure di protezione adeguate.
5. Raccolta, imaging e analisi dei dati
- Raccogliere i dati a intervalli di tempo predeterminati, ad esempio ogni 24 ore dopo l'emissione della radiazione. Registrare tutte le possibili osservazioni come la sopravvivenza, l'efficienza della schiusa, lo stadio di sviluppo, il conteggio del battito cardiaco, la curvatura del corpo e della coda, l'edema pericardico, l'estensione del sacco vitellino, la microcefalia, lo sviluppo della vescica natatoria, la motilità o l'attività generale, ecc.62,63,64.
- Per acquisire le immagini, scegliere embrioni rappresentativi su un vetrino pulito, controllare gli embrioni al microscopio, orientarli in una direzione particolare e fare clic sulle immagini. Rinominare i file immagine in base al gruppo e all'ora.
NOTA: È necessario utilizzare lo stesso ingrandimento e la stessa illuminazione durante l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo diversi.
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Representative Results
Il layout generale del protocollo è illustrato nella Figura 2. L'effetto delle radiazioni e la caratterizzazione in modo dose-dipendente sono stati valutati con le seguenti analisi.
Valutazione delle tossicità indotte dai raggi X
Utilizzando uno stereomicroscopio, le seguenti anomalie sono state valutate e caratterizzate dopo il trattamento farmacologico e/o la radioterapia. Secondo le linee guida dell'OCSE 61, per la valutazione della tossicità nei pesci, sono stati inclusi quattro principali endpoint apicali, tra cui la coagulazione degli embrioni, le deformità nella formazione dei somiti, il mancato distacco della coda dal sacco vitellino e la riduzione o l'assenza del battito cardiacoper analizzare la tossicità complessiva61. La tossicità acuta è stata determinata sulla base di un esito positivo in una qualsiasi delle anomalie di cui sopra. Oltre a questi quattro endpoint principali, sono state effettuate anche osservazioni morfologiche per la flessione della colonna vertebrale o della coda, malformazione della testa e microcefalia, difetti nello sviluppo, edema pericardico, deformità del sacco vitellino, deformità della vescica natatoria e cambiamenti nella struttura dell'occhio (Figura 3C e Figura 4). Il punteggio per la radiotossicità potrebbe essere basato sulla percentuale di sopravvivenza e/o sul punteggio di diverse anomalie morfologiche.
Percentuale di sopravvivenza e curva di sopravvivenza
La percentuale di sopravvivenza è stata calcolata dividendo il totale degli embrioni vivi per il numero totale di embrioni prelevati inizialmente in un gruppo e moltiplicando il risultato per 100 38,50,65. Quindi, i valori corrispondenti a diversi punti temporali e diversi gruppi sperimentali sono stati tracciati per ottenere la curva di sopravvivenza. Questo studio fornisce la curva di sopravvivenza per gli embrioni irradiati a 6 hpf (Figura 3A).
Principali anomalie associate alla tossicità indotta dalle radiazioni (Figura 3 e Figura 4)
Curvatura del corpo e piegatura della coda
Questo è uno dei parametri più comuni per valutare eventuali deformità indotte da tossicità negli embrioni di zebrafish 50,65,66. Le deformità della curvatura del corpo possono essere osservate in diversi modelli che vanno da bassa, moderata, a grave, con flessione nella regione post-epatica della coda o nell'asse principale del corpo o anche con una colonna vertebrale completamente semicircolare o più di una flessione nell'asse del corpo e nella coda. A dosi di radiazioni più basse, la flessione può non apparire in tutti gli embrioni, ma può svilupparsi nella maggior parte degli embrioni. Con l'aumento della dose, aumenta anche la gravità della flessione e colpisce tutti gli individui. In questo studio, queste deformità sono state osservate negli embrioni trattati con una dose di radiazioni di 10 GY.
Edema pericardico e cardiaco
Anche gli embrioni trattati con esposizioni tossiche come radiazioni e farmaci oltre i limiti tollerabili o in dosi tossiche sviluppano edema pericardico65,66. Gli embrioni esposti alle radiazioni a raggi X mostrano edema pericardico e cardiaco, in cui il liquido si accumula nella cavità pericardica e nel cuore, con conseguente gonfiore del pericardio e del cuore.
Edema del sacco vitellino, ispessimento del tuorlo e costrizione del sacco vitellino
Dopo l'esposizione ai raggi X, il sacco vitellino in alcuni pesci si vede ispessito o trattenuto, il che implica la tossicità delle radiazioni a raggi X. In alcuni casi, si può osservare anche la costrizione complessiva del sacco vitellino, in cui l'estensione del tuorlo è breve, o lo sviluppo di edema nella regione del tuorlo.
Riduzione delle dimensioni della testa (microcefalia)
Un risultato atteso delle radiazioni pesanti è la riduzione delle dimensioni della testa, o microcefalia, che può essere identificata quando gli embrioni trattati vengono confrontati con gli embrioni del gruppo di controllo.
Deformità della vescica natatoria
Dopo l'irradiazione, la vescica natatoria è ridotta o compromessa in pochi embrioni e la deformità della vescica natatoria è maggiore nel caso di embrioni sottoposti a dosi di radiazioni più elevate, il che può contribuire alla bassa locomozione o alla ridotta capacità di nuoto negli embrioni esposti ad alte dosi di raggi X.
Cambiamento nella struttura dell'occhio
Le radiazioni possono causare enormi danni al DNA e alterazioni proteiche, che alla fine causano la morte cellulare e una riduzione del numero di cellule o la morte di specifici tipi di cellule65. L'occhio può essere influenzato da intense dosi di radiazioni e sono state osservate piccole dimensioni dell'occhio e una diminuzione dei suoi strati cellulari55.
Battiti cardiaci al minuto (bpm)
I battiti cardiaci al minuto sono stati contati osservando gli embrioni allo stereomicroscopio. All'aumentare della dose di radiazioni, il bpm tende a diminuire (Figura 3B). Cinque larve sono state prese in considerazione per calcolare i bpm in ogni punto temporale per gruppo. Una diminuzione del numero di battiti cardiaci potrebbe indicare una disfunzione cardiaca66.
Utilizzando questo protocollo, la dose di radiazioni a raggi X di 10 GY era visibilmente tossica negli embrioni di zebrafish irradiati a 6 hpf. Nel gruppo di controllo e negli embrioni esposti a 2 GY e 5 GY, non c'è stata alcuna morte significativa negli embrioni (Figura 3A). Allo stesso modo, il conteggio dei battiti cardiaci al minuto ha suggerito che la frequenza cardiaca è diminuita enormemente con l'aumento delle dosi di radiazioni a raggi X. Nel gruppo di controllo, ogni intervallo di 24 ore, la frequenza cardiaca è aumentata (Figura 3B). Tuttavia, in ogni momento, la frequenza cardiaca è diminuita con l'aumento della dose di radiazioni. Tuttavia, gli embrioni esposti a 5 GY e 10 GY non hanno mostrato differenze significative fino al giorno 5 dopo la fecondazione. Si sospetta una grave deformazione cardiovascolare negli embrioni esposti a radiazioni di 15 GY e 20 GY quando il battito cardiaco è diminuito enormemente (Figura 3B). Come discusso in precedenza, diversi difetti fenotipici e di sviluppo sono rappresentati e valutati per gli embrioni esposti a dosi variabili di radiazioni in diversi punti temporali (Figura 3C e Figura 4).
Figura 1: Fasi dello sviluppo embrionale del pesce zebra . Immagini rappresentative di diversi stadi di sviluppo precoce del pesce zebra. Sono coperti stadi fino al 75% di epibolia (8 hpf). Embrioni allo stadio di scudo; 6 HPF (colore verde) viene utilizzato per la standardizzazione delle radiazioni. Barra della scala = 276,4 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema generalizzato del protocollo . (A) Allevamento, raccolta degli embrioni e stadiazione. (B) Impostazione sperimentale: semina di embrioni in piastre a pozzetti e trattamento farmacologico. (C) Embrioni degli stadi richiesti esposti alle radiazioni e alle alterazioni fenotipiche osservate in seguito alla radiazione. (D) Uno schema della macchina a raggi X e della sua configurazione. (E) Osservazioni, acquisizione di dati e imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetto di diverse dosi di irradiazione a raggi X su 6 embrioni di pesce zebra hpf . (A) Curva di sopravvivenza che mostra la frazione totale sopravvissuta di embrioni di zebrafish esposti a dosi individuali di radiazioni a partire da 2 GY a 20 GY. (B) Conteggio del battito cardiaco al minuto di embrioni di zebrafish esposti a diverse dosi di radiazioni a raggi X a 6 hpf nei giorni successivi alla fecondazione. (C) Immagini rappresentative di embrioni di zebrafish esposti a dosi variabili di radiazioni (da 2 GY a 20 GY), irradiati a 6 hpf. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione di diverse anomalie morfologiche dovute alla tossicità indotta dalle radiazioni. (A) embrioni di zebrafish di controllo a 72 hpf e (B) embrioni irradiati a 72 hpf; L'embrione superiore presenta deformità moderate, mentre l'embrione inferiore presenta deformità gravi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I pesci zebra sono usati come modelli preziosi in molti studi, tra cui diversi tipi di ricerca sul cancro. Questo modello fornisce un'utile piattaforma per lo screening dei farmaci su larga scala67,68. Come qualsiasi altro metodo di valutazione della tossicità, la valutazione quantitativa dei principali cambiamenti biologici in seguito a radiazioni e/o trattamento farmacologico è la parte più cruciale di questo protocollo. In questo tipo di studi, la sopravvivenza non deve essere l'unico criterio per osservare la tossicità; Deve essere supportato nella valutazione dei difetti fisici o di sviluppo da adeguati sistemi di punteggio. Anche in questo caso, fino a 72 hpf, la sopravvivenza negli embrioni non è molto diversa tra i gruppi in cui gli embrioni sono esposti a dosi di radiazioni radiografiche di 5 GY, 10 GY e 20 GY; tuttavia, quando la morfologia complessiva e i fenotipi degli embrioni vengono controllati a queste particolari dosi, è chiaro che la tossicità dei raggi X è più grave di quanto appaia attraverso il grafico di sopravvivenza. La gravità della deformità morfologica negli embrioni a queste dosi è molto elevata, riflettendo i cambiamenti nelle loro dimensioni corporee complessive, i difetti nello sviluppo, la malformazione degli organi vitali e i cambiamenti nella loro attività complessiva. Anche nel gruppo di 15 GY e 20 GY, gli embrioni non possono nemmeno schiudersi dal loro corion e mostrano ampie deformità in modo dose-dipendente. Pertanto, per valutare l'effetto delle sostanze tossiche, comprese le radiazioni a raggi X altamente fatali, il punteggio dei difetti morfologici, di sviluppo e fisiologici deve essere incluso in tutti i modi possibili e dovrebbe essere utilizzato per valutare la risposta complessiva degli embrioni di zebrafish o dei diversi farmaci somministrati nel corso dell'esperimento.
Sebbene non esistano sistemi di punteggio definitivi per valutare la radiotossicità nel modello embrionale di zebrafish in modo specifico, la sopravvivenza globale e/o i cambiamenti morfologici come la flessione del corpo, l'edema pericardico, i cambiamenti nel sacco vitellino, la microcefalia, i cambiamenti nella vescica natatoria e nell'occhio, i cambiamenti del battito cardiaco e i difetti nella locomozione sono stati presi in considerazione in vari studi62. 63,64. La sopravvivenza degli embrioni potrebbe essere valutata in base al battito cardiaco o alla valutazione degli endpoint apicali come descritto nelle linee guida dell'OCSE. Allo stesso tempo, le anomalie morfologiche osservate in tali esperimenti potrebbero essere valutate individualmente; Ad esempio, il punteggio del piegamento della coda è stato adottato da più ricercatori61.
Quando si lavora con il pesce zebra e si conduce questo protocollo, bisogna stare attenti ad alcune considerazioni. Tra questi c'è il gruppo riproduttivo, che deve appartenere sempre allo stesso ceppo di pesci. Tutti gli esperimenti devono coinvolgere un ceppo predefinito di embrione di zebrafish. Un altro fattore importante è lo stadio embrionale; Bisogna essere meticolosi con la fase di sviluppo in cui gli embrioni vengono irradiati perché un leggero cambiamento nei tempi o nella fase porterà a risultati diversi. Alcuni farmaci possono influenzare lo sviluppo o causare gravi danni agli embrioni se somministrati in una fase precoce dello sviluppo, come 2 hpf. In tal caso, è necessario determinare la corretta dose sub-letale del farmaco, quindi si può effettuare lo screening.
I parametri di irradiazione dei raggi X devono essere uniformi per tutti gli esperimenti eseguiti. I tre aspetti importanti di un irradiatore a raggi X standard sono il tipo di filtro, la dose di radiazione e il modello di irradiazione e la distanza tra la sorgente di raggi X e l'oggetto. Esistono principalmente due tipi di filtri utilizzati per generare fasci di raggi X: filtri in alluminio e filtri in rame; tuttavia, filtri con diverse combinazioni di rame e alluminio o altri metalli vengono utilizzati anche per generare raggi X in altri casi69. Per gli embrioni di zebrafish, il filtro a tazza viene utilizzato per produrre raggi X. La distanza tra la sorgente di raggi X e il soggetto sperimentale è definita distanza tra sorgente e soggetto (SSD). In questo studio, l'SSD è stato impostato su 50 cm. La radiazione a raggi X è stata emessa utilizzando un filtro Cu da 0,3 mm. Una singola esposizione della dose desiderata è stata somministrata a un rateo di dose di 140,32 cGY/min nell'intervallo di lunghezze d'onda 0,01-10 nm. Prima di effettuare qualsiasi esperimento radiologico, è necessario standardizzare la dose di radiazioni adatta all'esperimento e all'obiettivo. Lo scopo dello studio, la tempistica dell'irradiazione e la dose di radiazioni sono i tre criteri principali per la standardizzazione della dose di radiazioni. La tempistica della radioterapia includerà sia in quale fase dello sviluppo embrionale la radiazione deve essere somministrata sia il periodo di tempo durante il quale l'embrione sarà esposto a radiazioni di una dose prestabilita. È noto che, nelle prime fasi di sviluppo, l'effetto delle radiazioni è massimizzato. In questo protocollo, gli embrioni sono stati irradiati ad uno stadio di sviluppo di 6 hpf con diverse dosi di radiazioni (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY e 20 GY) e osservati per 5 giorni dopo la fecondazione. Qualsiasi deviazione dal protocollo abituale deve essere chiaramente definita e standardizzata.
Questo modello presenta diversi vantaggi per lo studio dell'effetto dei radiosensibilizzatori o protettori in uno studio quasi longitudinale, come la capacità di ottenere diversi embrioni da un singolo allevamento, di riprodursi ogni settimana da un unico serbatoio parentale, di collocare un numero significativo di embrioni in gruppi sperimentali, di osservare gli effetti fenotipici in pochi giorni dopo il trattamento. e per vedere uno spettro di variabili fenotipiche dopo i trattamenti. Questo modello può riflettere l'impatto delle radiazioni su quasi tutti i sistemi dell'embrione e più farmaci possono essere testati contemporaneamente in formati a lastra. Tuttavia, questo approccio si scontra anche con alcune limitazioni. Per esempio, questo modello non è in grado di ricapitolare tutte le deformità mostrate dalle radiazioni negli animali superiori e negli esseri umani. Inoltre, molti studi basati su proteine o meccanicistici in questi pesci sono limitati a causa di problemi di disponibilità dei reagenti, come con gli anticorpi. Tuttavia, nonostante queste limitazioni, il pesce zebra si rivela un ottimo modello per gli studi radiologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.
Acknowledgments
Il laboratorio di SS e il laboratorio di RKS sono finanziati da sovvenzioni di DBT e SERB, India. APM ha ricevuto la borsa di studio ICMR, Governo dell'India. DP ha ricevuto la borsa di studio CSIR, Governo dell'India. L'ONU ha ricevuto la borsa di studio DST-Inspire, Governo dell'India. La Figura 2 è stata generata utilizzando Biorender (https://biorender.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
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