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Cancer Research

Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64233
Automatic Translation
*1,3, *1,3, 1,4, 2,3, 2, 1
1Tumor microenvironment and animal models lab, Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab, Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

Le poisson-zèbre a récemment été exploité comme modèle pour valider les modificateurs potentiels de rayonnement. Le présent protocole décrit les étapes détaillées de l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour des expériences de dépistage basées sur les rayonnements et certaines approches observationnelles pour évaluer l’effet de différents traitements et rayonnements.

Abstract

Le poisson-zèbre est largement utilisé dans plusieurs types de recherche car il est l’un des modèles de vertébrés faciles à entretenir et présente plusieurs caractéristiques d’un système de modèle unique et pratique. Comme les cellules hautement prolifératives sont plus sensibles aux dommages à l’ADN induits par les radiations, les embryons de poisson-zèbre sont un modèle in vivo de première ligne dans la recherche sur les rayonnements. De plus, ce modèle projette l’effet des rayonnements et de différents médicaments dans un court laps de temps, ainsi que les événements biologiques majeurs et les réponses associées. Plusieurs études sur le cancer ont utilisé le poisson-zèbre, et ce protocole est basé sur l’utilisation de modificateurs de rayonnement dans le contexte de la radiothérapie et du cancer. Cette méthode peut être facilement utilisée pour valider les effets de différents médicaments sur les embryons irradiés et témoins (non irradiés), identifiant ainsi les médicaments comme des médicaments radiosensibilisants ou protecteurs. Bien que cette méthodologie soit utilisée dans la plupart des expériences de dépistage de drogues, les détails de l’expérience et l’évaluation de la toxicité avec le contexte de l’exposition aux rayons X sont limités ou seulement brièvement abordés, ce qui la rend difficile à réaliser. Ce protocole aborde cette question et traite de la procédure et de l’évaluation de la toxicité avec une illustration détaillée. La procédure décrit une approche simple pour l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour les études de radiation et le dépistage de médicaments à base de rayonnement avec beaucoup de fiabilité et de reproductibilité.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle animal bien connu qui a été largement utilisé dans la recherche au cours des 3 dernières décennies. C’est un petit poisson d’eau douce facile à élever et à élever dans des conditions de laboratoire. Le poisson-zèbre a été largement utilisé pour diverses études développementales et toxicologiques 1,2,3,4,5,6,7,8. Le poisson-zèbre a une fécondité élevée et une génération embryonnaire courte ; Les embryons sont adaptés au suivi de différents stades de développement, sont visuellement transparents et se prêtent à diverses manipulations génétiques et à des plates-formes de criblage à haut débit 9,10,11,12,13,14. En outre, le poisson-zèbre fournit une imagerie in toto et en direct pour laquelle son processus de développement et les différentes déformations en présence de diverses substances ou facteurs toxiques peuvent être facilement étudiés à l’aide de la microscopie stéréoscopique ou fluorescente 7,15,16.

La radiothérapie est l’un des principaux modes thérapeutiques utilisés dans le traitement du cancer 17,18,19,20,21,22,23,24. Cependant, la radiothérapie du cancer nécessite des radioprotecteurs potentiels pour empêcher les cellules saines normales de mourir tout en tuant les cellules malignes ou pour protéger la santé humaine pendant le traitement impliquant des radiations à haute énergie 25,26,27,28,29. À l’inverse, de puissants radiosensibilisants sont également à l’étude pour augmenter l’efficacité des radiations à tuer les cellules malignes, en particulier dans les thérapies ciblées et de précision30,31,32,33. Par conséquent, pour valider des radioprotecteurs et des sensibilisateurs puissants, un modèle adapté au criblage de médicaments à semi-haut débit et présentant des effets mesurables des rayonnements est fortement sollicité. Plusieurs modèles disponibles sont utilisés dans les études sur les rayonnements et impliqués dans les expériences de dépistage de drogues. Cependant, les vertébrés supérieurs et même le modèle in vivo le plus couramment utilisé, les souris, ne conviennent pas au criblage de médicaments à grande échelle, car il est long, coûteux et difficile de concevoir de telles expériences de dépistage avec ces modèles. De même, les modèles de culture cellulaire sont idéaux pour les variétés d’expériences de criblage de médicaments à haut débit34,35. Cependant, les expériences impliquant la culture cellulaire ne sont pas toujours pragmatiques, hautement reproductibles ou fiables, car les cellules en culture peuvent modifier considérablement leur comportement en fonction des conditions de croissance et de la cinétique. De plus, les variétés de types de cellules présentent une sensibilisation différentielle aux rayonnements. Notamment, les systèmes de culture cellulaire 2D et 3D ne représentent pas le scénario de l’organisme entier et, par conséquent, les résultats obtenus peuvent ne pas récapituler le niveau réel de radiotoxicité36,37. À cet égard, le poisson-zèbre offre plusieurs avantages dans le dépistage de nouveaux radiosensibilisateurs et radioprotecteurs. La facilité de manipulation, la grande taille de la couvée, la courte durée de vie, le développement embryonnaire rapide, la transparence de l’embryon et la petite taille du corps font du poisson-zèbre un modèle approprié pour le dépistage de drogues à grande échelle. En raison des avantages ci-dessus, les expériences peuvent être facilement répétées en peu de temps et l’effet peut être facilement observé sous un microscope à dissection dans des plaques multi-puits. Par conséquent, le poisson-zèbre gagne en popularité dans la recherche sur le dépistage des drogues impliquant des études sur les radiations38,39.

Le potentiel du poisson-zèbre en tant que modèle authentique pour le criblage des modificateurs de rayonnement a été démontré dans diverses études 40,41,42,43,44,45. L’effet radioprotecteur des modificateurs radio potentiels, tels que la nanoparticule DF1, l’amifostine (WR-2721), les protéines de réparation de l’ADN KU80 et ATM, et les cellules souches hématopoïétiques transplantées, ainsi que les effets des radiosensibilisateurs, tels que le flavopiridol et l’AG1478, dans le modèle du poisson-zèbre ont été rapportés 19,41,42,43,44,45,46 . En utilisant le même système, l’effet radioprotecteur de DF-1 (nanoparticule de fullerène) a été évalué à la fois au niveau systémique et au niveau d’un organe spécifique, et l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour le criblage de radioprotecteurs a également été explorée plus en détail47. Récemment, le miel de Kelulut a été signalé comme radioprotecteur dans les embryons de poisson-zèbre et s’est avéré augmenter la survie des embryons et prévenir les dommages spécifiques aux organes, les dommages à l’ADN cellulaire et l’apoptose48.

De même, les effets radioprotecteurs des polymères générés par la réaction de Hantzsch ont été vérifiés sur des embryons de poisson-zèbre dans le cadre d’un criblage à haut débit, et la protection a été principalement conférée par la protection des cellules contre les dommages à l’ADN49. Dans l’une des études précédentes, la statine lipophile fluvastatine a été trouvée comme radiosensibilisant potentiel en utilisant le modèle du poisson-zèbre avec cette approche50. De même, les nanoparticules d’or sont considérées comme un radiosensibilisateur idéal et ont été utilisées dans de nombreuses études51,52.

Le développement embryonnaire chez le poisson-zèbre implique un clivage dans les 3 premières heures au cours desquelles un zygote unicellulaire se divise pour former 2 cellules, 4 cellules, 8 cellules, 16 cellules, 32 cellules et 64 cellules qui sont facilement identifiées avec un stéréomicroscope. Ensuite, il atteint le stade blastula avec 128 cellules (2,25 h après la fécondation, hpf), où les cellules doublent toutes les 15 minutes et passent par les étapes suivantes : 256 cellules (2,5 hpf), 512 cellules (2,75 hpf) et atteignent 1 000+ cellules en seulement 3 h (Figure 1). À 4 h, l’œuf atteint le stade sphérique, suivi de la formation d’un dôme dans la masse embryonnaire 7,53,54. La gastrulation chez le poisson-zèbre commence à partir de 5,25 hpf54, où elle atteint le stade de bouclier. Le bouclier indique clairement le mouvement de convergence rapide des cellules d’un côté de l’anneau germinatif (Figure 1) et constitue une phase proéminente et distincte de la gastrulation des embryons qui peut être facilement identifiée53,54. Bien que l’exposition aux rayonnements des embryons puisse se faire à n’importe quel stade de leur développement, l’exposition aux rayonnements pendant la gastrulation pourrait avoir des changements morphologiques plus distincts, ce qui faciliterait une meilleure lecture des toxicités induites par les rayonnements55 ; De même, l’administration de médicaments aux embryons peut être commencée dès 2 HPF54.

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Protocol

La présente étude a été menée avec l’approbation préalable et en suivant les directives du Comité institutionnel d’éthique animale de l’Institut des sciences de la vie de Bhubaneswar. Tous les travaux d’entretien et d’élevage des poissons-zèbres ont été effectués dans une installation piscicole ambiante à 28,5 °C, et les embryons ont été maintenus dans un incubateur à demande biologique en oxygène (DBO) à une température de 28,5 °C. Ici, la souche AB du poisson-zèbre a été utilisée, et la mise en scène a été effectuée selon Kimmel et al.54. Le rayonnement X a été administré à 6 hpf (stade bouclier), et différents phénotypes ont été observés jusqu’à 120 hpf.

1. Mise en place de l’élevage et collecte d’embryons

  1. Réglez les bacs d’élevage (en polycarbonate, capacité 1 L, voir Tableau des matériaux). Verser l’eau du système (pH, 6,8-7,5 ; conductivité, 500 μS ; et température, 28,5 °C) dans les bassins d’élevage couvrant près de 40 % de son volume. Placez le séparateur dans le réservoir pour créer deux chambres, l’une pour les femelles et l’autre pour les mâles.
  2. À l’aide d’un filet, prélevez soigneusement deux femelles et un mâle en bonne santé dans les bassins parents, placez-les dans leurs moitiés respectives et gardez-les dans l’obscurité pendant la nuit (minimum 10 h) à 28,5 °C.
  3. Le lendemain matin, retirez le séparateur et laissez les poissons s’accoupler sans déranger les bassins d’élevage.
    REMARQUE : Les femelles commenceront à frayer et les œufs seront vus couchés au fond de l’aquarium dans les 10 à 15 minutes après que les poissons soient autorisés à s’accoupler56,57,58.
  4. remettre les poissons dans leurs aquariums après le frai, recueillir les embryons dans le bac d’élevage à l’aide d’une passoire, les laver correctement avec l’eau du système et conserver les œufs collectés dans une boîte de Pétri avec un milieu E-3 (4,94 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,43 mM de CaCl 2, 0,85 mM de sels de MgCl2, 1 % p/v de bleu de méthylène, voir Tableau des matériaux).
  5. Observez les oeufs au microscope à dissection, retirez les embryons non fécondés ou morts à l’aide d’une pipette Pasteur et conservez les boîtes de Petri contenant les ovules fécondés dans le milieu E-3 à 28,5 °C dans un incubateur pour leur bonne croissance et leur entretien.
    REMARQUE : Les ovules non fécondés peuvent être identifiés avec un aspect blanc laiteux avec un chorion coagulé ou avec des cellules rompues à l’intérieur du chorion. En plus des ovules non fécondés, les ovules qui ne subissent pas de clivage et les ovules présentant des déformations telles que des irrégularités pendant le clivage, par exemple une asymétrie, la formation de vésicules ou des lésions du chorion, ou qui ne se développent pas activement, doivent être jetés pour garder les embryons collectés en bonne santé et pour garder le milieu propre 7,56.

2. Surveillance des embryons et sélection pour les expériences de rayonnement

  1. Surveillez les embryons en croissance au microscope à dissection, identifiez le stade approprié 7,54 et retirez tous les embryons morts ou en mauvaise santé. S’assurer que la stadification embryonnaire est adéquate, car les doses de radiation et de médicament seront administrées à un stade particulier de la gastrulation.
    REMARQUE : Chaque jour, vérifiez le niveau et la qualité des milieux dans les plats de culture. Changez le milieu toutes les 24 heures, ainsi que le retrait des embryons morts. Il est préférable d’utiliser des pipettes Pasteur pour le prélèvement d’embryons ou le changement de milieu.
  2. Avant de commencer l’expérience, répartissez soigneusement les embryons sains dans les plaques expérimentales à l’aide d’une pipette Pasteur. Pour chaque groupe expérimental, prélever 15 à 20 embryons.
    REMARQUE : Ne placer que des embryons sains des stades de développement souhaités dans la plaque expérimentale. Supposons que le traitement médicamenteux doive être effectué avec des embryons à 6 hpf, puis commencez à les ensemencer dans des plaques expérimentales au moins 30 à 60 minutes plus tôt.

3. Traitement de la toxicomanie

  1. Ajouter les médicaments de la concentration désirée aux embryons de poisson-zèbre. Préparez le milieu E-3 contenant le médicament bien à l’avance. Assurez-vous que la solution mère du médicament ne contient pas de médicament non dissous avant de préparer le milieu de travail pour le traitement des embryons de poisson-zèbre.
  2. Avant d’ajouter un médicament à un milieu pour le dépistage par rayonnement, vérifiez l’effet cytotoxique du médicament avec les degrés de concentration du médicament. Suivre les lignes directrices de l’OCDE pour évaluer la CL 50 des médicaments évalués 59,60,61.
    REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous déplacez les assiettes et les plats pendant le temps d’irradiation ou d’observation. Il y a de nombreuses chances que les plaques soient perturbées lors de cette manipulation, ce qui entraînerait une fuite du milieu hors des puits ou le débordement des embryons hors de leurs puits respectifs, contaminant potentiellement les puits voisins et ruinant l’expérience.

4. Irradiation aux rayons X

  1. Lors de la mise en place d’une expérience sur les rayonnements, inclure un groupe témoin/non irradié et un groupe de rayonnements uniquement. De même, lors d’un dépistage de drogues, inclure un autre groupe où les médicaments seront administrés avec la même concentration que ceux administrés dans l’expérience de dépistage avec la radiothérapie.
    REMARQUE : Étiquetez à la fois le couvercle et la base des plaques de puits ou des boîtes de culture afin que les couvercles ne soient pas égarés.
  2. Distribuer les embryons dans une plaque de puits si les écrans anti-rayonnement peuvent couvrir et protéger les puits supplémentaires contre les rayonnements pendant que les autres puits sont exposés à une dose de rayonnement particulière ; sinon, utilisez des plaques ou des disques individuels pour ensemencer les embryons en fonction de la dose de rayonnement.
  3. Mettez en marche l’appareil d’irradiateur à rayons X (voir le tableau des matériaux) et lancez l’initialisation et le préchauffage de la machine.
    REMARQUE : La valeur de la distance entre la source et le sujet (SSD) doit être de 50 cm ; on peut à nouveau utiliser différents SSD, ce qui nécessite une standardisation.
  4. Placez la plaque expérimentale sous l’irradiateur à l’intérieur de la machine au centre, en veillant à ce que la plaque se trouve directement sous la source de rayons X, puis réglez la dose (par exemple, 5 GY) et démarrez la radiographie.
    REMARQUE : Scellez les plaques avec un film de paraffine pour éviter tout déversement ou contamination indésirable pendant le transport des plaques de l’incubateur à l’irradiateur et vice-versa.
  5. Une fois l’irradiation terminée, retirez les plaques, arrêtez le programme de la machine, éteignez la machine et vérifiez les plaques au microscope immédiatement après la radiothérapie. Retirez les embryons morts et remettez les plaques dans l’incubateur à 28,5 °C. Enregistrez le nombre d’embryons morts après les avoir évalués au microscope à dissection.
    NOTA : Irradier les différents groupes d’embryons avec des doses de rayonnement désignées sans trop de retard entre les groupes individuels, car l’effet du rayonnement peut être considérablement affecté par la différence de stade de développement.
    ATTENTION : Lors de l’utilisation de l’appareil à rayons X, prenez les mesures de protection appropriées.

5. Collecte, imagerie et analyse des données

  1. Recueillez des données à des intervalles de temps prédéterminés, par exemple toutes les 24 heures après l’administration du rayonnement. Noter toutes les observations possibles telles que la survie, l’efficacité de l’éclosion, le stade de développement, le nombre de battements cardiaques, la courbure du corps et de la queue, l’œdème péricardique, l’extension du sac vitellin, la microcéphalie, le développement de la vessie natatoire, la motilité ou l’activité générale, etc.62,63,64.
  2. Pour capturer des images, choisissez des embryons représentatifs sur une lame propre, vérifiez les embryons au microscope, orientez-les dans une direction particulière et cliquez sur les images. Renommez les fichiers image en fonction du groupe et de l’heure.
    REMARQUE : Le même grossissement et le même éclairage doivent être utilisés lors de la capture d’images à des intervalles de temps différents.

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Representative Results

La présentation générale du protocole est illustrée à la figure 2. L’effet du rayonnement et la caractérisation en fonction de la dose ont été évalués à l’aide des analyses suivantes.

Évaluation des toxicités induites par les rayons X
À l’aide d’un stéréomicroscope, les anomalies suivantes ont été évaluées et caractérisées après le traitement médicamenteux et/ou la radiothérapie. Conformément aux lignes directrices de l’OCDE 61, pour l’évaluation de la toxicité chez les poissons, quatre paramètres apicaux principaux, y compris la coagulation des embryons, les malformations dans la formation des somites, le non-détachement de la queue du sac vitellin et la réduction ou l’absence de battements cardiaques, ont été inclus pour analyser la toxicité globale61. La toxicité aiguë a été déterminée sur la base d’un résultat positif dans l’une ou l’autre des anomalies ci-dessus. En plus de ces quatre critères d’évaluation principaux, des observations morphologiques de la flexion de la colonne vertébrale ou de la queue, des malformations de la tête et de la microcéphalie, des défauts de développement, des œdèmes péricardiques, des déformations du sac vitellin, des déformations de la vessie natatoire et des modifications de la structure de l’œil ont également été effectuées (Figure 3C et Figure 4). La cote de radiotoxicité pourrait être basée sur le pourcentage de survie et/ou la notation de différentes anomalies morphologiques.

Pourcentage de survie et courbe de survie
Le pourcentage de survie a été calculé en divisant le nombre total d’embryons vivants par le nombre total d’embryons initialement prélevés dans un groupe et en multipliant le résultat par 100 38,50,65. Ensuite, les valeurs correspondant à différents points temporels et à différents groupes expérimentaux ont été tracées pour obtenir la courbe de survie. Cette étude fournit la courbe de survie pour les embryons irradiés à 6 hpf (Figure 3A).

Anomalies majeures associées à la toxicité radio-induite (Figure 3 et Figure 4)
Courbure du corps et flexion de la queue
C’est l’un des paramètres les plus courants pour évaluer les malformations induites par la toxicité chez les embryons de poisson-zèbre 50,65,66. Les déformations de la courbure du corps peuvent être observées selon différents schémas allant de faible à modérée, à sévère, avec une flexion dans la région post-hépatique de la queue ou dans l’axe principal du corps ou même avec une colonne vertébrale complètement semi-circulaire ou plus d’une flexion dans l’axe du corps et dans la queue. À des doses de rayonnement plus faibles, la flexion peut ne pas apparaître dans tous les embryons, mais peut se développer dans la plupart des embryons. Avec une augmentation de la dose, la gravité de la flexion augmente également et affecte tous les individus. Dans cette étude, ces malformations ont été observées chez les embryons traités avec une dose de radiation de 10 SY.

Œdème péricardique et cardiaque
Les embryons traités par des expositions toxiques telles que des radiations et des médicaments au-delà des limites tolérables ou à des doses toxiques développent également un œdème péricardique65,66. Les embryons exposés aux rayons X présentent un œdème péricardique et cardiaque, dans lequel du liquide s’accumule dans la cavité péricardique et le cœur, entraînant un gonflement du péricarde et du cœur.

Œdème du sac vitellin, épaississement du vitellus et constriction du sac vitellin
Après l’exposition aux rayons X, on constate que le sac vitellin de certains poissons est épaissi ou retenu, ce qui implique la toxicité des rayons X. Dans certains cas, une constriction globale du sac vitellin, où l’extension du vitellus est courte, ou un développement d’œdème dans la région vitellin peuvent également être observés.

Réduction de la taille de la tête (microcéphalie)
L’un des résultats attendus d’une irradiation lourde est la réduction de la taille de la tête, ou microcéphalie, qui peut être identifiée lorsque les embryons traités sont comparés aux embryons du groupe témoin.

Déformations de la vessie natatoire
Après l’irradiation, on constate que la vessie natatoire est réduite ou compromise chez quelques embryons, et la déformation de la vessie natatoire est plus importante dans le cas d’embryons soumis à des doses de rayonnement plus élevées, ce qui peut contribuer à la faible locomotion ou à la réduction des capacités de nage chez les embryons exposés à de fortes doses de rayons X.

Modification de la structure de l’œil
Les radiations peuvent causer d’énormes dommages à l’ADN et des altérations des protéines, qui finissent par provoquer la mort cellulaire et une réduction du nombre de cellules ou la mortde certains types de cellules. L’œil peut être affecté par des doses de rayonnement intenses, et une petite taille de l’œil et une diminution de ses couches cellulaires ont été observées55.

Battements cardiaques par minute (bpm)
Les battements cardiaques par minute ont été comptés en observant les embryons au stéréomicroscope. À mesure que la dose de rayonnement augmente, le bpm a tendance à diminuer (figure 3B). Cinq larves ont été prises en compte pour calculer le bpm à chaque point temporel par groupe. Une diminution du nombre de battements cardiaques pourrait indiquer un dysfonctionnement cardiaque66.

En utilisant ce protocole, la dose de rayonnement X de 10 GY était visiblement toxique dans les embryons de poisson-zèbre irradiés à 6 hpf. Dans le groupe témoin et les embryons exposés à 2 GY et 5 GY, il n’y a pas eu de mort significative chez les embryons (Figure 3A). De même, le nombre de battements cardiaques par minute a suggéré que la fréquence cardiaque diminuait énormément avec l’augmentation des doses de rayons X. Dans le groupe témoin, à tous les intervalles de 24 heures, on a constaté une augmentation de la fréquence cardiaque (Figure 3B). Cependant, à chaque instant, la fréquence cardiaque diminuait avec une dose de rayonnement accrue. Cependant, les embryons exposés à 5 GY et 10 GY n’ont montré aucune différence significative jusqu’au jour 5 après la fécondation. Une déformation cardiovasculaire sévère est suspectée chez les embryons exposés à des rayonnements de 15 GY et 20 GY car le rythme cardiaque a énormément chuté (Figure 3B). Comme nous l’avons vu précédemment, différents défauts phénotypiques et de développement sont décrits et évalués pour les embryons exposés à des doses variables de rayonnement à différents moments (Figure 3C et Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Stades du développement de l’embryon du poisson-zèbre. Images représentatives des différents stades du développement précoce du poisson-zèbre. Les stades jusqu’à 75 % d’épibole (8 hpf) sont couverts. Embryons au stade de bouclier ; 6 HPF (couleur verte) est utilisé pour la normalisation des rayonnements. Barre d’échelle = 276,4 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Aperçu général du protocole. (A) Reproduction, collecte d’embryons et stadification. (B) Dispositif expérimental : ensemencement d’embryons dans des plaques de puits et traitement médicamenteux. (C) Embryons des stades requis exposés aux rayonnements et aux changements phénotypiques observés à la suite de l’irradiation. (D) Un aperçu de l’appareil à rayons X et de sa configuration. (E) Observations, acquisition de données et imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effet de différentes doses d’irradiation aux rayons X sur 6 embryons de poisson-zèbre hpf. (A) Courbe de survie montrant la fraction survivante totale d’embryons de poisson-zèbre exposés à des doses de rayonnement individuelles allant de 2 GY à 20 GY. (B) Nombre de battements cardiaques par minute d’embryons de poisson-zèbre exposés à différentes doses de rayons X à 6 hpf les jours suivants de fécondation. (C) Images représentatives d’embryons de poissons-zèbres exposés à des doses variables de rayonnement (de 2 GY à 20 GY), irradiés à 6 hpf. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Représentation des différentes anomalies morphologiques dues à la toxicité radio-induite. (A) A embryons de poisson-zèbre témoins à 72 hpf et (B) embryons irradiés à 72 hpf ; L’embryon supérieur présente des déformations modérées, tandis que l’embryon inférieur présente des malformations sévères. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les poissons-zèbres sont utilisés comme modèles précieux dans de nombreuses études, y compris plusieurs types de recherche sur le cancer. Ce modèle fournit une plate-forme utile pour le dépistage de drogues à grande échelle67,68. Comme toute autre méthode d’évaluation de la toxicité, l’évaluation quantitative des changements biologiques majeurs lors d’une radiothérapie et/ou d’un traitement médicamenteux est la partie la plus cruciale de ce protocole. Dans ce type d’études, la survie ne doit pas être le seul critère d’observation de la toxicité ; Elle doit être étayée par l’évaluation des défauts physiques ou de développement par des systèmes de notation appropriés. Dans ce cas également, jusqu’à 72 hpf, la survie chez les embryons n’est pas très différente entre les groupes dans lesquels les embryons sont exposés à des doses de rayonnement X de 5 GY, 10 GY et 20 GY ; cependant, lorsque la morphologie globale et les phénotypes des embryons sont vérifiés à ces doses particulières, il est clair que la toxicité aux rayons X est plus grave qu’il n’y paraît dans le graphique de survie. La gravité de la déformation morphologique chez les embryons à ces doses est très élevée, reflétant des changements dans leur taille corporelle globale, des défauts de développement, la malformation des organes vitaux et des changements dans leur activité globale. Même dans le groupe de 15 GY et 20 GY, les embryons ne peuvent même pas éclore hors de leur chorion et présentent de nombreuses malformations de manière dose-dépendante. Ainsi, pour évaluer l’effet des substances toxiques, y compris les rayons X hautement mortels, la notation des défauts morphologiques, de développement et physiologiques doit être incluse de toutes les manières possibles, et cela devrait être utilisé pour évaluer la réponse globale des embryons de poisson-zèbre ou des différents médicaments administrés au cours de l’expérience.

Bien qu’il n’existe pas de système de notation définitif pour évaluer spécifiquement la radiotoxicité dans le modèle embryonnaire de poisson-zèbre, la survie globale et/ou les changements morphologiques tels que la flexion du corps, l’œdème péricardique, les changements dans le sac vitellin, la microcéphalie, les changements dans la vessie natatoire et l’œil, les changements du rythme cardiaque et les défauts de locomotion ont été pris en compte dansdiverses études. 63,64. La survie des embryons pourrait être évaluée en fonction du rythme cardiaque ou de l’évaluation des paramètres apicaux, comme décrit dans les lignes directrices de l’OCDE. Dans le même temps, les anomalies morphologiques observées dans de telles expériences ont pu être notées individuellement ; Par exemple, la notation de la flexion de la queue a été adoptée par de nombreux chercheurs61.

Lorsque l’on travaille avec le poisson-zèbre et que l’on applique ce protocole, il faut faire attention à certaines considérations. Il s’agit notamment du groupe reproducteur, qui doit toujours appartenir à la même souche de poisson. Toutes les expériences doivent porter sur une souche prédéfinie d’embryon de poisson-zèbre. Un autre facteur important est le stade embryonnaire ; Il faut être méticuleux avec le stade de développement auquel les embryons sont irradiés, car un léger changement dans le moment ou le stade conduira à des résultats différents. Certains médicaments peuvent affecter le développement ou causer de graves dommages aux embryons lorsqu’ils sont administrés à un stade précoce du développement, comme 2 hpf. Dans ce cas, la dose sublétale appropriée du médicament doit être déterminée, puis le dépistage peut être effectué.

Les paramètres d’irradiation aux rayons X doivent être uniformes pour toutes les expériences réalisées. Les trois aspects importants d’un irradiateur à rayons X standard sont le type de filtre, la dose de rayonnement et le modèle d’irradiation, ainsi que la distance entre la source de rayons X et l’objet. Il existe principalement deux types de filtres utilisés pour générer des faisceaux de rayons X : les filtres en aluminium et les filtres en cuivre ; cependant, des filtres avec des combinaisons variables de cuivre et d’aluminium ou d’autres métaux sont également utilisés pour générer des rayons X dans d’autres cas69. Pour les embryons de poisson-zèbre, le filtre supérieur est utilisé ici pour produire des rayons X. La distance entre la source de rayons X et le sujet expérimental est appelée distance de la source au sujet (SSD). Dans cette étude, le SSD a été fixé à 50 cm. Le rayonnement X a été administré à l’aide d’un filtre Cu de 0,3 mm. Une seule exposition de la dose désirée a été administrée à un débit de dose de 140,32 cGY/min dans la gamme de longueurs d’onde de 0,01 à 10 nm. Avant de procéder à toute expérience radiologique, la dose de rayonnement adaptée à l’expérience et à l’objectif doit être normalisée. L’objectif de l’étude, le moment de l’irradiation et la dose de rayonnement sont les trois principaux critères de normalisation de la dose de rayonnement. Le moment de la radiothérapie comprendra à la fois le stade de développement de l’embryon où la radiothérapie doit être administrée et la période pendant laquelle l’embryon sera exposé à une radiation d’une dose déterminée. Il est bien connu qu’aux premiers stades du développement, l’effet des rayonnements est maximisé. Dans ce protocole, les embryons ont été irradiés à un stade de développement de 6 hpf avec différentes doses de radiation (2 GY, 5 GY, 10 GY, 15 GY et 20 GY) et observés pendant 5 jours après la fécondation. Tout écart par rapport au protocole habituel doit être clairement défini et normalisé.

Ce modèle présente plusieurs avantages pour étudier l’effet des radiosensibilisateurs ou des protecteurs dans une étude quasi longitudinale, tels que la possibilité d’obtenir plusieurs embryons à partir d’un élevage individuel, de se reproduire chaque semaine à partir d’un seul réservoir parental, de placer un nombre important d’embryons dans des groupes expérimentaux, d’observer des effets phénotypiques en quelques jours après le traitement, et de voir un spectre de variables phénotypiques après les traitements. Ce modèle peut refléter l’impact de la radiothérapie sur presque tous les systèmes de l’embryon, et plusieurs médicaments peuvent être testés à la fois dans des formats de plaques de puits. Cependant, cette approche se heurte également à certaines limites. Par exemple, ce modèle ne peut pas récapituler toutes les déformations montrées par les radiations chez les animaux supérieurs et les humains. De plus, de nombreuses études à base de protéines ou mécanistiques chez ces poissons sont limitées en raison de problèmes de disponibilité des réactifs, comme avec les anticorps. Cependant, malgré ces limites, le poisson-zèbre s’avère être un excellent modèle pour les études radiologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas déclaré d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Le laboratoire de SS et le laboratoire de RKS sont financés par des subventions de DBT et de SERB, en Inde. APM est récipiendaire de la bourse de l’ICMR du gouvernement de l’Inde. Le Programme du diplôme est récipiendaire d’une bourse du CSIR du gouvernement de l’Inde. L’ONU est récipiendaire de la bourse DST-Inspire du gouvernement de l’Inde. La figure 2 a été générée à l’aide de Biorender (https://biorender.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Well plates Corning CLS3335 Polystyrene
B.O.D Incubator Oswald JRIC-10
Calcium Chloride Fisher Scientific 10101-41-4
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTE Polycarbonate
Glass petriplates Borosil 3165A75 Glass
GraphpadPrism GraphPad Software, Inc. Version 5.01
Kline concavity slides Himedia GW092-1PK Glass
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Methylene blue hydrate Sigma-Aldrich 66720-100G
Parafilm Tarsons 380020 Paraffin film
Pasteur pipettes Himedia PW1212-1X500NO Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTI Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTD Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTL Polycarbonate
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet SRL 1949181
Stereo Microscope Leica M205FA Leica Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray Precision X-Ray X-RAD 225XL

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Larves de poisson-zèbre Modèle Radiosensibilisateurs Protecteurs Recherche sur les rayonnements Modèle in vivo Dommages à l’ADN induits par les rayonnements Études sur le cancer Modificateurs de rayonnement Radiothérapie Dépistage de drogues Évaluation de la toxicité Exposition aux rayons X Procédure Fiabilité Reproductibilité
Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels
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Mohapatra, A. P., Parida, D.,… More

Mohapatra, A. P., Parida, D., Mohapatra, D., Nayak, U., Swain, R. K., Senapati, S. Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors. J. Vis. Exp. (186), e64233, doi:10.3791/64233 (2022).

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