Summary
Denne protokollen beskriver en metode for eukaryotisk polysomrensing fra intakte soyabønneknuter. Etter sekvensering kan standard rørledninger for genuttrykksanalyse brukes til å identifisere differensielt uttrykte gener på transkriptom- og translatomnivå.
Abstract
Målet med denne protokollen er å gi en strategi for å studere eukaryotisk translatom av soyabønner (Glycine max) symbiotisk knute. Dette papiret beskriver metoder optimalisert for å isolere planteavledede polyribosomer og deres tilhørende mRNA som skal analyseres ved hjelp av RNA-sekvensering. Først oppnås cytoplasmatiske lysater gjennom homogenisering i polysom- og RNA-bevarende forhold fra hele, frosne soyabønneknuter. Deretter fjernes lysater ved lavhastighets sentrifugering, og 15% av supernatanten brukes til total RNA (TOTAL) isolasjon. Det gjenværende klarerte lysatet brukes til å isolere polysomer ved ultrasentrifugering gjennom en tolags sukrosepute (12% og 33,5%). Polysomassosiert mRNA (PAR) renses fra polysomale pellets etter resuspendering. Både TOTAL og PAR evalueres ved høysensitiv kapillærelektroforese for å oppfylle kvalitetsstandardene for sekvenseringsbiblioteker for RNA-seq. Som et eksempel på en nedstrøms applikasjon, etter sekvensering, kan standard rørledninger for genuttrykksanalyse brukes til å oppnå differensielt uttrykte gener på transkriptom- og translatomnivå. Oppsummert tillater denne metoden, i kombinasjon med RNA-seq, studiet av translasjonsreguleringen av eukaryote mRNA i et komplekst vev som den symbiotiske knuten.
Introduction
Leguminøse planter, som soyabønne (Glycine max), kan etablere symbiose med spesifikke jordbakterier kalt rhizobia. Dette mutualistiske forholdet fremkaller dannelsen av nye organer, de symbiotiske knutene, på planterøttene. Knutene er planteorganene som er vert for bakteriene og består av vertsceller hvis cytoplasma er kolonisert med en spesialisert form for rhizobia kalt bakterier. Disse bakterieoidene katalyserer reduksjonen av atmosfærisk nitrogen (N 2) til ammoniakk, som overføres til planten i retur for karbohydrater 1,2.
Selv om denne nitrogenfikserende symbiosen er en av de mest studerte plantemikrobesymbiosene, gjenstår mange aspekter å bli bedre forstått, for eksempel hvordan planter utsatt for forskjellige abiotiske stressforhold modulerer samspillet med deres symbiotiske partner og hvordan dette påvirker knutemetabolismen. Disse prosessene kan forstås bedre ved å analysere knutetranslatomet (dvs. delmengden av messenger-RNA [mRNA] aktivt oversatt). Polyribosomer eller polysomer er komplekser av flere ribosomer assosiert med mRNA, som vanligvis brukes til å studere oversettelse3. Polysomprofileringsmetoden består av analysen av mRNA assosiert med polysomer og har blitt brukt til å studere posttranskripsjonsmekanismer som styrer genuttrykk som forekommer i ulike biologiske prosesser 4,5.
Historisk sett har genomuttrykksanalyse primært fokusert på å bestemme mRNA-overflod 6,7,8,9. Imidlertid er det mangel på korrelasjon mellom transkripsjon og proteinnivåer på grunn av de forskjellige stadiene av posttranskripsjonell regulering av genuttrykk, spesielt oversettelse10,11,12. Videre er det ikke observert avhengighet mellom endringene på transkriptomnivået og de som forekommer på translatomnivået13. Den direkte analysen av settet av mRNA som oversettes, tillater en mer nøyaktig og fullstendig måling av cellegenuttrykket (hvis endepunkt er proteinoverflod) enn det som oppnås når bare mRNA-nivåer analyseres14,15,16.
Denne protokollen beskriver hvordan planteavledede polysomer renses fra intakte soyabønneknuter ved differensiell sentrifugering gjennom en tolags sukrosepute (figur 1). Men siden bakterieformede ribosomer også er tilstede i knutene, blir en blanding av ribosomer og RNA-arter renset, selv om de eukaryote representerer hovedfraksjonen (90% -95%). Den påfølgende RNA-isolasjonen, kvantifiseringen og kvalitetskontrollen er også beskrevet (figur 1). Denne protokollen, i kombinasjon med RNA-seq, skal gi eksperimentelle resultater på translasjonsregulering av eukaryote mRNA i et komplekst vev som den symbiotiske knuten.
Figur 1: Skjematisk oversikt over foreslått metodikk for eukaryotisk polysomrensing fra symbiotiske knuter. Ordningen gir en oversikt over trinnene som følges i protokollen fra (1) plantevekst og (2) knutehøsting til (3) fremstilling av cytosoliske ekstrakter, (3) innhenting av TOTAL-prøver og (4) PAR-prøver, og (5) RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll. Forkortelser: PEB = polysomekstraksjonsbuffer; RB = resuspension buffer; TOTALT = totalt RNA; PAR = polysomassosiert mRNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantevekst og rhizobia inokulasjon
- For å generere de nødvendige knutene, så soyabønnefrøene som er valgt i det valgte substratet i et vekstkammer under kontrollerte forhold.
MERK: I denne protokollen ble frø sådd i en 0,5 L plastflaske fylt med en blanding av sand: vermikulitt (1: 1). Vekstkammeret ble satt med en dag/natt-syklustemperatur på henholdsvis 28 °C/20 °C og en lys/mørke-fotoperiode på 16 timer/8 timer. Den fotosyntetisk aktive strålingsintensiteten var 620 μmol·m−2·s−1. - Forbered på forhånd flytende gjærekstrakt mannitol (YEM) -medium (se materialtabellen). Autoklav mediet.
- På samme dag med frøsåing, inokulerer du en kolbe som inneholder 100 ml YEM med Bradyrhizobium elkanii U1302-stammen. Inkuber kolben ved 28 °C på en orbital shaker ved 100 o / min.
- La rhizobia vokse i 2 dager og inokulere plantene med 2 ml av kulturen.
2. Behandling av vannunderskudd (valgfritt)
MERK: Denne protokollen skisserer vannunderskuddsbehandlingen av soyabønneanleggene. Denne delen kan endres eller utelates helt avhengig av det aktuelle eksperimentelle spørsmålet.
- Dyrk soyabønneplantene i 19 dager (V2-3 utviklingsstadium) uten vannbegrensning. Hold underlaget på feltkapasitet med B&D-medium17 supplert med 0,5 mM KNO3.
- På dag 20, trekk vanning.
MERK: Her ble vanninnholdet målt daglig ved gravimetri (vanngravimetrisk innhold) i vekst- og vannunderskuddsperioder. - Mål stomatal konduktans i tre eksemplarer daglig på den abaxiale bladoverflaten med et porometer, som instruert av produsenten (se materialtabellen), fra dag 20 til slutten av vannunderskuddsperioden.
MERK: Slutten av vannunderskuddsperioden ble bestemt individuelt for hvert anlegg når den stomatale konduktansverdien var ca. 50% av den som ble oppnådd på dag 20 fra såing.
3. Nodule høsting
- Samle flytende nitrogen i en ren beholder og merk 15 ml rør (en for hver plante).
FORSIKTIG: Håndter flytende nitrogen med kryohansker, ansiktsskjermer og vernebriller. - Hent hver plante individuelt. Klipp og kast antennedelen. Vask roten grundig med vann for å fjerne gjenværende underlag.
- Løsne hver knute fra roten og samle dem i et forkjølt 15 ml rør. Frys slangene og oppbevar dem ved −80 °C.
4. Fremstilling av cytosoliske ekstrakter
MERK: Det endelige målet med denne protokollen er å oppnå høy kvalitet totalt RNA (TOTAL) og polysomassosiert RNA (PAR). Arbeid derfor under forhold som forhindrer RNA-nedbrytning, hold alltid prøvene ved 4 ° C og bruk RNase-fritt laboratorieutstyr og løsninger. Med mindre det er spesifisert, fremstilles alle oppløsningene med sterilt ultrarent vann.
- Fremstilling av bufferlagerløsninger
- Forbered de autoklaverbare lagerløsningene som er oppført i tabell 1, autoklav dem i 15 minutter, og hold på RT.
- Forbered de filtersteriliserbare stamløsningene som er oppført i tabell 1, filtrer dem og hold dem ved -20 °C.
- Klargjør polysomekstraksjonsbuffer (PEB, se tabell 1) og hold den på is.
MERK: Volumene som er gitt er for seks prøver. - Avkjøl sentrifugen til 4 °C og legg 2 ml mikrosentrifugerør på is.
- Vei ca. 0,2 g intakte knuter i en veieskål og overfør dem til et forkjølt rør på 2 ml.
MERK: Utfør dette trinnet raskt for å unngå tining av prøvene. Alternativt kan et estimert knutevolum på 0,4-0,5 ml brukes i stedet for 0,2 g. - Tilsett 1,2 ml PEB, la prøven tine i 2 minutter, og homogeniser med en vevkvern til fullstendig forstyrrelse og homogenisering av knutene.
MERK: Sørg for å male knutene når de er tint, da de vil være myke nok til å lett forstyrres med vevskverner (se materialtabellen) i mikrosentrifugerør. Frosne knuter er vanskelige å male. Det anbefales også å plassere rørene i en benkkjøler (0 ° C) for riktig homogenisering mens du holder prøvene kjølige. - Inkuber prøvene på is med forsiktig omrøring i 10 minutter eller til alle prøvene er behandlet.
- Sentrifuge ved 16 000 × g i 15 minutter ved 4 °C for å pelletere avfallet. Gjenopprett supernatanten og gjenta sentrifugetrinnet.
- Gjenvinn forsiktig det klargjorte cytosoliske ekstraktet og overfør et 200 μL aliquot til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør for TOTAL isolasjon (TOTAL-prøver; se pkt. 7).
5. Tilberedning av sukroseputer
MERK: Denne protokollen bruker en tolags sukrosepute (12% og 33,5%) i 13,2 ml ultrasentrifugerør (se materialtabellen). Alle løsninger fremstilles med sterilt ultrarent vann.
- Forbered sukrose- og saltmasseløsningene.
- Forbered 100 ml 2 M sukroseoppløsning (68,5%, tabell 1).
- Forbered 10x saltoppløsning (tabell 1).
- Forbered de to lagene av sukroseputen som beskrevet i tabell 2. Se tabell 1 for sammensetning av stamløsninger for antibiotika (CHX og CHL).
MERK: Volumene som er gitt er for seks puter. - Hell 4,5 ml av 33,5% sukroselaget i sentrifugerørene. Tilsett deretter 4,5 ml av 12%-laget forsiktig og sakte med en P1000 mikropipette. Legg rørene på is til tilsetning av det avklarte cytosoliske ekstraktet.
6. Polysom rensing
- Legg 1 ml av det klargjorte cytosoliske ekstraktet (trinn 4,8) på toppen av sukroseputen ved å pipettere forsiktig på rørets sidevegg.
- Overfør ultrasentrifugerørene til forkjølte bøtter og sentrifuge ved 217 874 × g (35 000 o / min i den refererte rotoren [se materialtabellen]) i 2 timer ved 4 ° C.
- Kast det gjenværende cytosoliske ekstraktet og sukroseputen, og resuspender den polysomale pelleten med 200 μL forkjølt RB (tidligere tilberedt i henhold til tabell 1).
- Inkuber i 30 minutter på is og overfør deretter den polysomale resuspensjonen til 1,5 ml forkjølte rør. Fortsett med RNA-ekstraksjonen (PAR-prøver).
7. RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll
MERK: Dette trinnet utføres for TOTAL- (trinn 4.8) og PAR-prøver (trinn 6.4).
- Forbered 75% EtOH med sterilt ultrarent vann og avkjøl det til -20 ° C. I tillegg avkjøles kloroform og isopropanol til -20 °C.
- Homogeniser prøvene med 750 μL av RNA-isolasjonsreagenset og inkuber i 5 minutter ved RT.
- Tilsett 200 μL kald kloroform og rist rørene kraftig i 15 s. Inkuber ved RT i 10 min.
- Sentrifuge ved 12 000 × g i 15 minutter ved 4 °C for faseseparasjon. Overfør 500 μL av den øvre vandige fasen til et rent rør uten å forstyrre den rosa organiske fasen, og tilsett 375 μL kald isopropanol og 0,5 μL RNase-fri glykogen (se materialtabellen). Bland godt ved pipettering opp og ned.
MERK: Glykogen er en bærer som brukes som en co-bunnfall for å øke nukleinsyreutvinningen fra alkoholutfelling. - Inkuber blandingen i 10 minutter ved 4 °C og sentrifuger ved 12 000 × g i 15 minutter. Kast supernatanten.
- Vask RNA-bunnfallet med 1 ml kald 75% EtOH. Bland ved kort vortexing.
MERK: På dette tidspunktet kan prøvene lagres ved -20 °C over natten. - Sentrifuge ved 7 500 × g i 5 minutter ved 4 °C, fjern supernatanten forsiktig med en mikropipette og lufttørk RNA-pelleten.
- Løs opp pelleten i 50 μL RNase-fritt vann og inkuber ved 65 °C i 5 minutter.
- Vurder RNA-konsentrasjonen og integriteten med høysensitiv kapillærelektroforese18 (se materialtabellen) og/eller elektroforese på en 2 % RNase-fri agarosegel19 (se materialtabellen).
MERK: Hvis RNA-prøvene ikke skal brukes umiddelbart eller skal sendes til sekvenseringsanlegget for RNA-seq-bibliotekforberedelse, anbefales det å bruke EtOH for å utfelle dem.
8. RNA-nedbør
- Avkjøl sentrifugen og EtOH til 4 °C.
- Forbered 3 M natriumacetat.
- Forbered 70% EtOH med sterilt ultrarent vann og avkjøl det til -20 ° C.
- Beregn prøvevolumet. Tilsett 0,1 volumer 3 M natriumacetat, 3 volumer kald EtOH og 0,5 μL RNase-fri glykogen. Bland godt.
- La stå ved −20 °C til det er nødvendig.
MERK: RNA-utfelte prøver kan lagres i opptil 1 år ved -80 ° C.
9. Standard pipeline for genuttrykksanalyse
- Utfør i gjennomsnitt 40M Illumina parede avlesninger, med leselengde >100 bp, for sikker transkriptom- og translatomdataanalyse.
MERK: Standard RNA-seq dataanalyse inkluderer følgende trinn 9.2-9.5. - Utfør lesekvalitetsinspeksjon ved hjelp av FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) eller multisample MultiQC20.
- Fjern adapter og sekvenser av lav kvalitet ved hjelp av blant annet Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt 22, sickle23 eller Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).
- Hvis et referansegenom er tilgjengelig for arten, utfør lesekartlegging mot referansen, etterfulgt av overflodskvantifisering, ved hjelp av Bowtie2 24, TopHat225 eller Salmon26, og featureCounts27, i tillegg til andre åpen kildekodeverktøy.
- Utfør statistisk analyse for identifisering av differensialuttrykk ved bruk av blant annet edgeR28, DESeq229 eller limma30.
MERK: Disse open source-programvarene kan brukes lokalt, via kommandolinjen. Alternativt kan de betjenes via en nettleser på en offentlig server, for eksempel Galaxy31 eller GEOexplorer32, som tilbyr et grafisk brukergrensesnitt, slik at det ikke kreves kommandolinjekunnskap for deres bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantitets- og kvalitetsvurderingen av TOTAL- og PAR-fraksjonene renset med ovennevnte prosedyre er nøkkelen til å bestemme suksessen, siden for de fleste nedstrømsapplikasjoner, for eksempel RNA-sekvensering, er prøver av høy kvalitet grunnleggende for bibliotekforberedelse og sekvensering. Videre tillater integriteten til RNA-molekylene fangst av et øyeblikksbilde av genuttrykksprofilen i øyeblikket av prøveinnsamling18. I denne sammenheng oppnås et RNA-integritetsnummer (RIN) ved utførelse av disse målingene ved hjelp av en bioanalysator. RIN brukes til å tilordne integritetsverdier på en robust, pålitelig og brukeruavhengig måte, fra 10 (intakt) til 1 (helt degradert)18.
Figur 2A,B viser standardutgangen for høysensitivt kapillærelektroforesesystem (Bioanalyzer) for flere TOTAL- og PAR-prøvefraksjoner. Meget god kvalitet observeres for alle prøvene siden skarpe ribosomale RNA (rRNA) bånd kan visualiseres uten smurt utseende. Dette gjenspeiles imidlertid ikke i RIN-verdiene, da de varierer mellom 5,9 og 7,5, noe som tilsvarer ikke-intakte prøver. Likevel, som tidligere nevnt, er det ingen visuelle tegn på prøveforringelse, som det fremgår av figur 2C. Figur 2D viser et eksempel på et bioanalysatorresultat av en nesten helt nedbrutt prøve for sammenligning. Utstyret klarte heller ikke å identifisere toppene 18S og 25S, som vist i elektroferogrammene både for TOTAL- og PAR-prøver (figur 2B). Følgelig kunne andelen av de ribosomale båndene (25S: 18S; en annen indikator på RNA-integritet) ikke beregnes. RNA av høy kvalitet viser vanligvis et 25S: 18S 2: 1-forhold33.
Figur 2: Total RNA og polysomassosiert mRNA kvantitets- og kvalitetsvurdering . (A) Representativ virtuell gelrekonstruksjon av høysensitiv kapillærelektroforese (Bioanalyzer) resultater fra 12 prøver med deres respektive RIN- og konsentrasjonsverdier. Lane 1 til lane 6 tilsvarer totale RNA (TOTAL) fraksjoner av seks knuteprøver, og lane 7 til lane 12 tilsvarer polysom-assosierte mRNA (PAR) fraksjoner av de samme prøvene. Grønn linje: nedre markør til stede i alle baner. (B) Elektroferogramrepresentasjon er vist for prøve 4 (som et eksempel på TOTAL) og prøve 10 (som et eksempel på PAR). 18S og 25S topper er angitt. Topper som muligens tilsvarer 16S og 23S (prokaryote rRNA) er indikert med *. Zoom-ins på disse toppene vises (B1 og B2). Eukaryote Total RNA Nano-analysen ble brukt i Bioanalyzer. (C) Representative agarosegelelektroforeseresultater fra seks prøver (venstre): 10 μL TOTAL- og PAR-fraksjoner ble lastet på en 2% agarosegel og separert (80 V i 35 minutter). Til høyre er det en annen gel av prøve 2 bare, hvor de prokaryote rRNAene kan visualiseres tydeligere. Eukaryotisk rRNA (18S og 25S) er indikert med svarte pilspisser og prokaryote rRNA (16S og 23S) med grå pilspisser. (D) Eksempel på et bioanalysatorresultat av en degradert prøve. L: standard stige. Grønn linje: nedre markør til stede i alle baner. Forkortelser: RIN = RNA-integritetsnummer; PAR = polysomassosiert mRNA; nt = nukleotider; L = standard stige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Siden disse prøvene er fra symbiotiske knuter der eukaryote og prokaryote RNA sameksisterer, er det rensede RNA en blanding av begge artene (selv om de eukaryote er flertallet). Derfor forventes det å observere topper tilsvarende 16S og 23S rRNA i elektroferogrammene (figur 2B og zoom-inn B1 og B2). Disse "ekstra" toppene kan forklare de lavere RIN-verdiene som er oppnådd.
Utstyret beregner også prøvekonsentrasjoner med tanke på standardstigen i kjørefelt 1 som referanse. Som forventet presenterer TOTAL-prøvene høyere konsentrasjonsverdier enn PAR-prøvene. Likevel, selv for disse, er det nok RNA til å fortsette med bibliotekforberedelse og RNA-seq siden prøvemengdekrav vanligvis anbefaler minst 1,0 μg.
| Autoklaverbare løsninger som skal oppbevares ved romtemperatur |
| 2 m Tris-HCl pH 9,0 |
| 2 m KCl |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 (justert med 10 M NaOH) |
| 1 m mgcl2 |
| 20 % (v/v) PTE (rist flasken før pipettering av oppløsningen) |
| 10% DOC |
| 20 % blanding av vaskemiddel: 20 % (u/v) Brij L23, 20 % (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20 % (v/v) Tween 20 (oppløses ved oppvarming ved 60 °C) |
| Filtersteriliserbare oppløsninger som skal fryses ved -20 °C |
| 0,5 m DTT |
| 0,5 m PMSF |
| 50 mg.mL-1 cykloheksimid (CHX) (i EtOH) |
| 50 mg.mL-1 klorfenikol (CHL) (i EtOH) |
| Lager løsning | Volum (μL) for 10 ml PEB | Volum (μL) for 2 ml RB |
| 2 m KCl | 1,000 | 200 |
| 0,5 m EGTA pH 8,0 | 500 | 100 |
| 1 m mgcl2 | 356 | 70 |
| 20 % (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| 20% vaskemiddel blanding | 500 | - |
| 0,5 m DTT | 100 | 20 |
| 0,5 m PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M sukroseoppløsning (68,5%): 68,5 g sukrose i vann. Oppbevares i romtemperatur (RT). | ||
| 10x saltløsning: 0,4 M Tris-HCl pH 8,4, 0,2 M KCl, 0,1 M MgCl2; autoklav i 15 min, frys ved -20 °C. | ||
Tabell 1: Buffere og løsninger som brukes i denne protokollen. Oppgitte volumer er for seks prøver. Forkortelser: EGTA = etylenglykol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre; PTE = polyoksyetylen (10) tridecyleter; DOC = natriumdeoksykolat; DTT = dithiothreitol; PMSF = fenylmetansulfonylfluorid.
| Sukroselag (%) | Sukrose 2 m (ml) | Saltløsning 10x (ml) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (ml) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tabell 2: Sammensetning av de to sukroselagene (12 % og 33,5 %). Volumene som er gitt er for forberedelse av seks puter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å studere regulering av genuttrykk på translasjonsnivå er avgjørende for å bedre forstå forskjellige biologiske prosesser siden endepunktet for cellegenuttrykk er proteinoverflod13,14. Dette kan vurderes ved å analysere translatomet av vevet eller organismen av interesse som den polysomale fraksjonen skal renses for og tilhørende mRNA analyseres 3,4,34,35,36.
En metode presenteres her for å rense soyabønner symbiotiske knutepolysomer gjennom sukroseputer, etterfulgt av TOTAL og PAR ekstraksjon. Å oppnå begge RNA-fraksjonene er et relevant punkt i denne protokollen siden RNA-seq og standard rørledninger for genuttrykk kan implementeres etterpå. Dermed kan transkriptomet og nodulens translatom studeres.
En alternativ metode for polysomrensing er TRAP-metoden (translating av ribosomaffinitetsrensing), der uttrykket av en epitopmerket versjon av ribosomalt protein L18 tillater immunutfelling av ribosomer37,38. Imidlertid krever denne metoden generering av transgene planter, noe som kan være utfordrende for noen arter som soyabønner. Videre er ribosomprofilering eller Ribo-seq-metoden 15,39,40,41, som innebærer dyp sekvensering av ribosombeskyttede mRNA-fragmenter etter polysomrensing, et alternativ for å studere translatomet med høyere oppløsning enn polysomprofilering, siden det nøyaktige antallet og posisjonen til ribosomer på individuelle mRNA kan vurderes. Likevel er denne tilnærmingen mer arbeidskrevende, krever høyere mengder prøve, og er beregningsintensiv, siden små RNA-fragmenter gjenvinnes.
Det er flere kritiske eksperimentelle aspekter å vurdere, for eksempel kvaliteten på prøven som polysomene skal renses fra, spesielt hvis frosset vev brukes, slik tilfellet er i denne protokollen. Intakte knuter skal løsnes fra roten og umiddelbart fryses ned i flytende nitrogen før lagring ved -80 °C. Etter vår erfaring kan polysomer og tilhørende mRNA renses vellykket fra knuter innen få måneder etter lagring. Videre må hele protokollen implementeres under forhold som forhindrer RNA-nedbrytning for å oppnå høy kvalitet TOTAL og PAR, noe som er kritisk for nedstrømsapplikasjoner som cDNA-syntese og høy gjennomstrømningssekvensering.
En stor begrensning av metoden er ultracentrifugation-trinnet, da ultracentrifuger ikke er allment tilgjengelige i mange laboratorier. Det er også relevant å nevne at pelleten oppnådd etter sentrifugeringstrinnet kan inneholde, i tillegg til polysomer, andre ribonukleoproteinkomplekser som ikke er translasjonelt aktive. Videre er en vurdering hvis du utfører protokollen som presenteres her med et annet soyabønnevev, at det sannsynligvis vil kreve optimalisering av mengden prøve, sample: PEB-forholdet og homogeniseringsprosedyren.
Tatt i betraktning at prøven som brukes i denne protokollen er et organ dannet på grunn av en symbiotisk interaksjon mellom en planterotcelle og en bakterie, vil det være interessant å utføre en Dual RNA-seq-analyse42 (med TOTAL- og PAR-prøver) siden det ville tillate undersøkelse av transkripsjons- og translasjonsresponsene fra begge organismer. Metoden beskrevet her kan være nyttig for denne saken hvis ekstraksjonen av bakterielle RNA er optimalisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av CSIC I + D 2020-stipend nr. 282, FVF 2017-stipend nr. 210 og PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
