Summary
Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.
Abstract
O objetivo deste protocolo é fornecer uma estratégia para estudar o traduzindo eucariótico do nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este artigo descreve métodos otimizados para isolar poliribos derivados de plantas e seus mRNAs associados a serem analisados usando sequenciamento de RNA. Em primeiro lugar, os licoplasatos citoplasmados são obtidos através da homogeneização em condições de preservação de poliso e RNA de nódulos inteiros e congelados de soja. Em seguida, os lysates são limpos por centrifugação de baixa velocidade, e 15% do supernante é usado para o isolamento total do RNA (TOTAL). O restante do lise limpo é usado para isolar pórsomeos por ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%). O mRNA (PAR) associado ao polissomo é purificado a partir de pelotas polissonais após a ressuspensão. Tanto total quanto PAR são avaliados por eletroforese capilar altamente sensível para atender aos padrões de qualidade das bibliotecas de sequenciamento para RNA-seq. Como exemplo de uma aplicação a jusante, após o sequenciamento, os pipelines padrão para análise de expressão genética podem ser usados para obter genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e tradução. Em resumo, este método, em combinação com o RNA-seq, permite o estudo da regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.
Introduction
Plantas leguminous, como a soja (Glycine max), podem estabelecer simbiose com bactérias específicas do solo chamadas rizobia. Essa relação mutualista provoca a formação de novos órgãos, os nódulos simbióticos, nas raízes das plantas. Os nódulos são os órgãos vegetais que hospedam as bactérias e consistem em células hospedeiras cujo citoplasma é colonizado com uma forma especializada de rizobia chamada bacteroides. Esses bacteroides catalisam a redução do nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, que é transferida para a planta em troca de carboidratos 1,2.
Embora essa simbiose fixador de nitrogênio seja uma das simbioses vegetais mais bem estudadas, muitos aspectos continuam sendo melhor compreendidos, como como as plantas submetidas a diferentes condições de estresse abiótico modulam sua interação com seu parceiro simbiótico e como isso afeta o metabolismo do nódulo. Esses processos poderiam ser melhor compreendidos analisando o translatome de nódulo (ou seja, o subconjunto de RNAs mensageiros [mRNAs] traduzido ativamente). Poliribosomes ou polissomos são complexos de ribossomos múltiplos associados ao mRNA, comumente usado para estudar a tradução3. O método de perfil polisome consiste na análise dos mRNAs associados aos polissomos e tem sido utilizado com sucesso para estudar os mecanismos pós-transcriionais que controlam a expressão genética que ocorre em diversos processos biológicos 4,5.
Historicamente, a análise da expressão do genoma tem focado principalmente na determinação da abundância de mRNA 6,7,8,9. No entanto, há falta de correlação entre a transcrição e os níveis de proteína devido aos diferentes estágios de regulação pós-escrita da expressão genética, particularmente a tradução 10,11,12. Além disso, não foi observada dependência entre as alterações no nível do transcriptome e aquelas que ocorrem no nível do traduzome13. A análise direta do conjunto de mRNAs que estão sendo traduzidos permite uma medição mais precisa e completa da expressão genética celular (cujo ponto final é a abundância de proteínas) do que a obtida quando apenas os níveis de mRNA são analisados 14,15,16.
Este protocolo descreve como os polimentos derivados das plantas são purificados de nódulos de soja intactos por centrifugação diferencial através de uma almofada de sacarose de duas camadas (Figura 1). No entanto, uma vez que os ribossomos derivados de bacteroides também estão presentes nos nódulos, uma mistura de ribossomos e espécies de RNA são purificadas, embora as eucarióticas representem a fração principal (90%-95%). O subsequente isolamento do RNA, quantificação e controle de qualidade também são descritos (Figura 1). Este protocolo, em combinação com o RNA-seq, deve fornecer resultados experimentais sobre a regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.
Figura 1: Visão geral esquemática da metodologia proposta para purificação de pórsomee eucariótico a partir de nódulos simbióticos. O esquema fornece uma visão geral das etapas seguidas no protocolo de (1) crescimento vegetal e (2) colheita de nódulos até (3) preparação dos extratos citolíticos, (3) obtenção de amostras TOTAIS e (4) amostras PAR e (5) extração e controle de qualidade do RNA. Abreviaturas: PEB = tampão de extração políduo; RB = tampão de resuspensão; TOTAL = RNA total; PAR = mRNA associado ao polissomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Crescimento vegetal e inoculação de rizobia
- Para gerar os nódulos necessários, semeie as sementes de soja escolhidas no substrato selecionado em uma câmara de crescimento em condições controladas.
NOTA: Neste protocolo, as sementes foram semeadas em uma garrafa plástica de 0,5 L recheada com uma mistura de areia:vermiculite (1:1). A câmara de crescimento foi definida com uma temperatura do ciclo dia/noite de 28 °C /20 °C, respectivamente, e um fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h, respectivamente. A intensidade de radiação fotossintética ativa foi de 620 μmol·m−2·s−1. - Prepare com antecedência o líquido Levedura-Extrato mannitol (YEM)-medium (ver a Tabela de Materiais). Autoclave o meio.
- No mesmo dia da semeadura de sementes, inocula um frasco contendo 100 mL de YEM com a cepa Bradyrhizobium elkanii U1302. Incubar o frasco a 28 °C em um agitador orbital a 100 rpm.
- Deixe a rizobia crescer por 2 dias e inocular as mudas com 2 mL da cultura.
2. Tratamento de déficit hídrico (opcional)
NOTA: Este protocolo descreve o tratamento do déficit hídrico das plantas de soja. Esta parte pode ser alterada ou omitida inteiramente dependendo da questão experimental em questão.
- Cultivar as mudas de soja por 19 dias (estágio de desenvolvimento V2-3) sem restrição de água. Mantenha o substrato na capacidade de campo com B&D-médio17 suplementado com 0,5 mM KNO3.
- No dia 20, retire a rega.
NOTA: Aqui, o teor de água foi medido diariamente por gravimetria (teor gravimétrico da água) durante os períodos de crescimento e déficit hídrico. - Meça a condução estomatal em triplicado diariamente na superfície da folha abaxial com um porômetro, conforme instruído pelo fabricante (ver a Tabela de Materiais), do dia 20 até o final do período de déficit hídrico.
NOTA: O fim do período de déficit hídrico foi determinado individualmente para cada planta quando o valor de condução estomatal foi de aproximadamente 50% do obtido no dia 20 da semeadura.
3. Colheita de nódulos
- Colete nitrogênio líquido em um recipiente limpo e rotule tubos de 15 mL (um para cada planta).
ATENÇÃO: Manuseie nitrogênio líquido usando luvas criogenas, escudos faciais e óculos de segurança. - Recupere cada planta individualmente. Corte e descarte a parte aérea. Lave bem a raiz com água para remover qualquer substrato restante.
- Retire cada nódulo da raiz e colete-os em um tubo de 15 mL pré-lhado. Congele os tubos e armazene-os a −80 °C.
4. Preparação de extratos citosóis
NOTA: O objetivo final deste protocolo é obter RNA total de alta qualidade (TOTAL) e RNA (PAR) associada a polisso. Portanto, trabalhe em condições que previnem a degradação do RNA, mantendo sempre as amostras a 4 °C e utilizando equipamentos e soluções de laboratório sem RNase. A menos que especificado, todas as soluções são preparadas com água ultrapura estéril.
- Elaboração de soluções de estoque tampão
- Prepare as soluções de estoque autoclaváveis listadas na Tabela 1, autoclave-as por 15 minutos e mantenha na RT.
- Prepare as soluções de estoque esterilizadas pelo filtro listadas na Tabela 1, esterilize-as por filtro e mantenha-as a −20 °C.
- Prepare o tampão de extração de polissóbio (PEB, consulte a tabela 1) e mantenha-o no gelo.
NOTA: Os volumes dados são para seis amostras. - Esfrie a centrífuga a 4 °C e coloque tubos de microcentrifuuagem de 2 mL no gelo.
- Pesar aproximadamente 0,2 g de nódulos intactos em um prato de pesagem e transferi-los para um tubo pré-cozido de 2 mL.
NOTA: Faça esta etapa rapidamente para evitar o descongelamento das amostras. Alternativamente, um volume de nódulo estimado de 0,4-0,5 mL pode ser usado em vez do 0,2 g. - Adicione 1,2 mL de PEB, deixe a amostra descongelar por 2 minutos e homogeneize com um moedor de tecido até a interrupção completa e homogeneização dos nódulos.
NOTA: Certifique-se de moer os nódulos uma vez descongelados, pois serão macios o suficiente para serem facilmente interrompidos com moedores de tecido (veja a Tabela de Materiais) em tubos de microcentrifuuagem. Nódulos congelados são difíceis de moer. Além disso, recomenda-se colocar os tubos em um refrigerador benchtop (0 °C) para homogeneização adequada, mantendo as amostras frias. - Incubar as amostras no gelo com agitação suave por 10 minutos ou até que todas as amostras tenham sido processadas.
- Centrifugar a 16.000 × g por 15 min a 4 °C para pelotar os detritos. Recupere o supernatante e repita o passo da centrífuga.
- Recupere cuidadosamente o extrato citosolico esclarecido e transfira uma alíquota de 200 μL para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL limpo para isolamento TOTAL (amostras TOTAIS; ver seção 7).
5. Preparação de almofadas de sacarose
NOTA: Este protocolo utiliza uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%) em tubos ultracentrífusos de 13,2 mL (ver a Tabela de Materiais). Todas as soluções são preparadas com água ultrauso estéril.
- Prepare as soluções de sacarose e sal.
- Prepare 100 mL de solução de sacarose de 2 M (68,5%, Tabela 1).
- Prepare a solução de sal 10x (Tabela 1).
- Prepare as duas camadas da almofada de sacarose conforme descrito na Tabela 2. Consulte a Tabela 1 para a composição das soluções de estoque antibiótico (CHX e CHL).
NOTA: Os volumes dados são para seis almofadas. - Despeje 4,5 mL da camada de sacarose de 33,5% nos tubos de centrífuga. Em seguida, adicione 4,5 mL da camada de 12% com cuidado e lentamente com uma micropipette P1000. Coloque os tubos no gelo até a adição do extrato citosolico esclarecido.
6. Purificação polissólida
- Carregar 1 mL do extrato citosolico esclarecido (etapa 4.8) em cima da almofada de sacarose, tubos cuidadosamente na parede lateral do tubo.
- Transfira os tubos ultracentrífugas para baldes pré-cozidos e centrífugas a 217.874 × g (35.000 rpm no rotor referenciado [ver a Tabela de Materiais]) por 2h a 4 °C.
- Descarte o extrato citosolico restante e a almofada de sacarose, e resuspenque a pelota polissomal com 200 μL de RB pré-cozido (previamente preparado de acordo com a Tabela 1).
- Incubar por 30 minutos no gelo e, em seguida, transferir a ressuspensão polissomal para tubos pré-cozidos de 1,5 mL. Proceder com a extração de RNA (amostras PAR).
7. Extração de RNA e controle de qualidade
NOTA: Esta etapa é realizada para amostras TOTAL (etapa 4.8) e PAR (etapa 6.4).
- Prepare 75% DeSI com água ultrapura estéril e esfrie-a a −20 °C. Além disso, esfrie o clorofórmio e o isopropanol a −20 °C.
- Homogeneize as amostras com 750 μL do reagente de isolamento de RNA e incubar por 5 min na RT.
- Adicione 200 μL de clorofórmio frio e agite os tubos vigorosamente por 15 s. Incubar na RT por 10 minutos.
- Centrifugar a 12.000 × g para 15 min a 4 °C para separação de fase. Transfira 500 μL da fase aquosa superior para um tubo limpo sem perturbar a fase orgânica rosa, e adicione 375 μL de isopropanol frio e 0,5 μL de glicogênio livre de RNase (ver a Tabela de Materiais). Misture bem por pipetar para cima e para baixo.
NOTA: Glicogênio é um portador usado como co-precipitante para aumentar a recuperação de ácido nucleico da precipitação do álcool. - Incubar a mistura por 10 min a 4 °C e centrífuga a 12.000 × g por 15 min. Descarte o supernatante.
- Lave o precipitado RNA com 1 mL de frio 75% etoh. Misture por um breve vórtice.
NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C durante a noite. - Centrifugar a 7.500 × g por 5 min a 4 °C, remover cuidadosamente o supernatante com uma micropipette e secar a pelota de RNA.
- Dissolva a pelota em 50 μL de água sem RNase e incubar a 65 °C por 5 min.
- Avalie a concentração e integridade do RNA com eletroforese capilar altamente sensível18 (ver a Tabela de Materiais) e/ou eletroforese em um gel de agarose 2% sem RNase19 (ver a Tabela de Materiais).
NOTA: Se as amostras de RNA não forem usadas imediatamente ou forem enviadas para a instalação de sequenciamento para a preparação da biblioteca RNA-seq, recomenda-se usar o EtOH para precipitar-as.
8. Precipitação de RNA
- Esfrie a centrífuga e EtOH a 4 °C.
- Prepare acetato de sódio de 3 M.
- Prepare 70% EtOH com água ultrapura estéril e esfrie-a a −20 °C.
- Estime o volume da amostra. Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio de 3 M, 3 volumes de EtOH frio e 0,5 μL de glicogênio sem RNase. Homogeneizar.
- Deixe a −20 °C até que seja necessário.
NOTA: As amostras precipitadas de RNA podem ser armazenadas por até 1 ano a −80 °C.
9. Pipeline padrão para análise de expressão genética
- Realize uma média de leituras de extremidade pareada de 40M Desarlumina, com comprimento de leitura >100 bp, para análise de dados de transcriptome e translatome confiantes.
NOTA: A análise padrão de dados RNA-seq inclui as seguintes etapas 9.2-9.5. - Realize a inspeção de qualidade de leitura usando o FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) ou o MultiQCmultisample 20.
- Remova o adaptador e as sequências de baixa qualidade usando Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, foice23 ou Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), entre outros.
- Se um genoma de referência estiver disponível para a espécie, realize o mapeamento de leitura contra a referência, seguido de quantificação de abundância, usando Bowtie224, TopHat225 ou Salmon26, e featureCounts27, além de outras ferramentas de código aberto.
- Realize análise estatística para identificação de genes expressos diferenciais utilizando edgeR28, DESeq229 ou limma30, entre outros.
NOTA: Estes softwares de código aberto podem ser usados localmente, através da linha de comando. Alternativamente, eles podem ser operados através de um navegador da Web em um servidor público, como o Galaxy31 ou GEOexplorer32, que oferecem uma interface gráfica de usuário, de modo que nenhum conhecimento de linha de comando é necessário para seu uso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A quantidade e a avaliação da qualidade das frações TOTAL e PAR purificadas com o procedimento acima mencionado é fundamental para determinar seu sucesso, uma vez que para a maioria das aplicações a jusante, como sequenciamento de RNA, amostras de alta qualidade são fundamentais para a preparação e sequenciamento da biblioteca. Além disso, a integridade das moléculas de RNA permite a captura de um instantâneo do perfil de expressão genética no momento da coleta da amostra18. Neste contexto, um número de integridade de RNA (RIN) é obtido ao realizar essas medições usando um Bioanalyzer. O RIN é usado para atribuir valores de integridade de forma robusta, confiável e independente do usuário, variando de 10 (intactos) a 1 (totalmente degradados)18.
A Figura 2A,B mostra a saída padrão do sistema de eletroforese capilar de alta sensibilidade (Bioanalyzer) para várias frações de amostra TOTAL e PAR. Uma qualidade muito boa é observada para todas as amostras, uma vez que bandas de RNA ribossômico afiadas (rRNA) podem ser visualizadas sem qualquer aparência manchada. No entanto, isso não se reflete nos valores do RIN, pois variam entre 5,9 e 7,5, o que corresponde a amostras não intactas. No entanto, como mencionado anteriormente, não há nenhum sinal visual de degradação da amostra, como pode ser visto na Figura 2C. A Figura 2D mostra um exemplo de resultado bioanalímal de uma amostra quase inteiramente degradada para comparação. O equipamento também não conseguiu identificar os picos 18S e 25S, como visto nos eletroferogramas tanto para amostras TOTAL quanto PAR (Figura 2B). Consequentemente, a proporção das bandas ribossômicas (25S:18S; outro indicador de integridade do RNA) não pôde ser calculada. O RNA de alta qualidade geralmente exibe uma proporção 25S:18S 2:133.
Figura 2: Total de RNA e avaliação de qualidade e quantidade de mRNA associada ao polisome. (A) Reconstrução de gel virtual representativo de eletroforese capilar de alta sensibilidade (Bioanalyzer) resulta de 12 amostras com seus respectivos valores de RIN e concentração. A faixa 1 à pista 6 corresponde ao total de frações de RNA (TOTAL) de seis amostras de nódulos, e a faixa 7 à faixa 12 correspondem a frações mRNA (PAR) associadas a pórsome das mesmas amostras. Linha verde: marcador inferior presente em todas as pistas. (B) A representação do eletroferograma é mostrada para a amostra 4 (como exemplo de TOTAL) e a amostra 10 (como exemplo de PAR). São indicados picos 18S e 25S. Picos possivelmente correspondentes a 16S e 23S (rRNAs procarióticos) são indicados com *. Zoom-ins nesses picos são mostrados (B1 e B2). O ensaio Eucayote Total RNA Nano foi usado no Bioanalyzer. (C) Os resultados representativos da eletroforese do gel agarose de seis amostras (esquerda): 10 μL de frações TOTAL e PAR foram carregados em um gel de 2% de agarose e separados (80 V por 35 min). À direita, há outro gel de amostra 2 apenas, onde os rRNAs procarióticos podem ser visualizados mais claramente. RRNA eucariótica (18S e 25S) são indicados por pontas de flecha pretas e rRNAs procarióticas (16S e 23S) por pontas de flecha cinza. (D) Exemplo de um resultado bioanalzer de uma amostra degradada. L: escada padrão. Linha verde: marcador inferior presente em todas as pistas. Abreviaturas: RIN = número de integridade do RNA; PAR = mRNA associado ao polissomo; nt = nucleotídeos; L = escada padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma vez que essas amostras são de nódulos simbióticos onde os RNAs eucarióticos e procarióticos coexistem, o RNA purificado é uma mistura de ambas as espécies (embora as eucarióticas sejam a maioria). Assim, espera-se observar picos correspondentes a 16S e 23S rRNA nos eletroferógramas (Figura 2B e zoom-in B1 e B2). Esses picos "extras" poderiam explicar os valores rinados mais baixos obtidos.
O equipamento também calcula as concentrações amostrais considerando a escada padrão na faixa 1 como referência. Como esperado, as amostras TOTAL apresentam valores de concentração mais elevados do que as amostras PAR. Ainda assim, mesmo para estes, há RNA suficiente para prosseguir com a preparação da biblioteca e RNA-seq, uma vez que os requisitos de quantidade de amostra normalmente recomendam pelo menos 1,0 μg.
| Soluções autoclaváveis a serem armazenadas à temperatura ambiente |
| 2 M Tris-HCl pH 9.0 |
| 2 M KCl |
| 0,5 M EGTA pH 8.0 (ajustado com 10 M NaOH) |
| 1 M MgCl2 |
| 20% (v/v) PTE (shake bottle antes de pipetting a solução) |
| 10% DOC |
| Mistura de detergente de 20%: 20% (w/v) Brij L23, 20% (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20% (v/v) Tween 20 (dissolver durante o aquecimento a 60 °C) |
| Soluções esterilizadas por filtro a serem congeladas a -20 °C |
| 0,5 M DTT |
| 0,5 M PMSF |
| 50 mg.mL-1 cicloheximida (CHX) (em EtOH) |
| 50 mg.mL-1 cloranfenicol (CHL) (em EtOH) |
| Solução de estoque | Volume (μL) para PEB de 10 mL | Volume (μL) para 2 mL RB |
| 2 M KCl | 1,000 | 200 |
| 0,5 M EGTA pH 8.0 | 500 | 100 |
| 1 M MgCl2 | 356 | 70 |
| 20% (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| Mistura de detergente de 20% | 500 | - |
| 0,5 M DTT | 100 | 20 |
| 0,5 M PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| Solução de sacarose de 2 M (68,5%): 68,5 g de sacarose na água. Mantenha-se em temperatura ambiente (RT). | ||
| Solução de sal 10x: 0,4 M Tris-HCl pH 8.4, 0,2 M KCl, 0,1 M MgCl2; autoclave por 15 min, congele a -20 °C. | ||
Tabela 1: Buffers e soluções utilizadas neste protocolo. Os volumes dados são para seis amostras. Abreviaturas: EGTA = etileno glycol-bis(2-aminoetilether)-N,N,N',N',N'-tetraacético ácido; PTE = polioximetileno (10) éter tridecil; DOC = desoxicolato de sódio; DTT = dithiothreitol; PMSF = flúor fenilmetanosulfonil.
| Camada de sacarose (%) | Sacarose 2 M (mL) | Solução de sal 10x (mL) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (mL) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tabela 2: Composição das duas camadas de sacarose (12% e 33,5%). Os volumes dados são para a preparação de seis almofadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Estudar a regulação da expressão genética no nível translacional é fundamental para compreender melhor diferentes processos biológicos, uma vez que o ponto final da expressão genética celular é a abundância deproteínas 13,14. Isso pode ser avaliado analisando o translatório do tecido ou organismo de interesse para o qual a fração polissômica deve ser purificada e seus mRNAs associados analisaram 3,4,34,35,36.
Um método é apresentado aqui para purificar polimentos de nódulos simbióticos de soja através de almofadas de sacarose, seguido pela extração TOTAL e PAR. A obtenção de ambas as frações de RNA é um ponto relevante deste protocolo, uma vez que os gasodutos RNA-seq e padrão para expressão genética poderiam ser implementados posteriormente. Assim, o transcriptome e o translatome do nódulo podem ser estudados.
Um método alternativo para purificação de pórsome é o método de purificação de afinidade ribossômica de tradução (TRAP), no qual a expressão de uma versão marcada por epitope da proteína ribossômica L18 permite a imunoprecipitação de ribossomos37,38. No entanto, esse método requer a geração de plantas transgênicas, o que pode ser desafiador para algumas espécies, como a soja. Além disso, o perfil ribossomo ou método Ribo-seq 15,39,40,41, que envolve o sequenciamento profundo de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomo após a purificação de polissoma, é uma alternativa para estudar o translatome com maior resolução do que o perfil polisome, uma vez que o número exato e a posição dos ribossomos em mRNAs individuais podem ser avaliados. No entanto, essa abordagem é mais trabalhosa, requer maiores quantidades de amostra e é computacionalmente intensiva, uma vez que pequenos fragmentos de RNA são recuperados.
Existem vários aspectos experimentais críticos a serem considerados, como a qualidade da amostra da qual os polissomos serão purificados, especialmente se o tecido congelado for usado, como é o caso deste protocolo. Os nódulos intactos devem ser separados da raiz e imediatamente congelados em nitrogênio líquido antes do armazenamento a −80 °C. Em nossa experiência, polissóis e seus mRNAs associados podem ser purificados com sucesso a partir de nódulos dentro de alguns meses de armazenamento. Além disso, todo o protocolo deve ser implementado em condições que impeçam a degradação do RNA para obter total e PAR de alta qualidade, o que é fundamental para aplicações a jusante, como síntese de CDNA e sequenciamento de alto rendimento.
Uma grande limitação do método é a etapa de ultracentrifugação, já que ultracentrifuges não estão amplamente disponíveis em muitos laboratórios. Além disso, é relevante mencionar que a pelota obtida após a etapa de centrifugação pode conter, além de polimentos, outros complexos ribonucleoproteínos que não são traduções ativos. Além disso, uma consideração se a realização do protocolo aqui apresentado com outro tecido de soja é que provavelmente exigirá a otimização da quantidade de amostra, a razão amostral:PEB e o procedimento de homogeneização.
Considerando que a amostra utilizada neste protocolo é um órgão formado devido a uma interação simbiótica entre uma célula radicular vegetal e uma bactéria, realizar uma análise Dual RNA-seq42 (com amostras TOTAL e PAR) seria interessante, pois permitiria o exame das respostas transcricional e translacional de ambos os organismos. O método aqui descrito pode ser útil para este assunto se a extração das RNAs bacterianas for otimizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela bolsa CSIC I+D 2020 nº 282, FVF 2017 grant No. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
