Summary
Этот протокол описывает метод очистки эукариотических полисом от интактных соевых конкреций. После секвенирования стандартные конвейеры для анализа экспрессии генов могут быть использованы для идентификации дифференциально экспрессированных генов на уровнях транскриптома и трансплантома.
Abstract
Целью данного протокола является обеспечение стратегии изучения эукариотического транслектома симбиотического узелка сои (Глицин макс). В данной работе описываются методы, оптимизированные для выделения полирибосом растительного происхождения и связанных с ними мРНК, для анализа с использованием РНК-секвенирования. Во-первых, цитоплазматы получают путем гомогенизации в полисом- и РНК-сохраняющих условиях из цельных замороженных соевых конкреций. Затем лизаты очищаются низкоскоростным центрифугированием, и 15% супернатанта используется для полной изоляции РНК (TOTAL). Оставшийся очищенный лизат используют для выделения полисом ультрацентрифугированием через двухслойную сахарозную подушку (12% и 33,5%). Полисомно-ассоциированная мРНК (PAR) очищается от полисомальных гранул после повторной суспензии. Как TOTAL, так и PAR оцениваются высокочувствительным капиллярным электрофорезом для соответствия стандартам качества библиотек секвенирования для RNA-seq. В качестве примера последующего применения, после секвенирования стандартные конвейеры для анализа экспрессии генов могут быть использованы для получения дифференциально экспрессированных генов на уровнях транскриптома и транслейлома. Таким образом, этот метод в сочетании с RNA-seq позволяет изучать трансляционную регуляцию эукариотических мРНК в сложной ткани, такой как симбиотический узелок.
Introduction
Бобовые растения, такие как соя (Glycine max), могут устанавливать симбиоз со специфическими почвенными бактериями, называемыми rhizobia. Эти взаимные отношения вызывают образование новых органов, симбиотических узелков, на корнях растений. Узелки являются растительными органами, содержащими бактерии, и состоят из клеток-хозяев, чья цитоплазма колонизирована специализированной формой ризобии, называемой бактероидами. Эти бактероиды катализируют восстановление атмосферного азота (N2) в аммиак, который передается растению в обмен на углеводы 1,2.
Хотя этот азотфиксирующий симбиоз является одним из наиболее хорошо изученных симбиозов растений и микробов, многие аспекты еще предстоит лучше понять, например, как растения, подвергшиеся различным абиотическим стрессовым условиям, модулируют свое взаимодействие со своим симбиотическим партнером и как это влияет на метаболизм конкреций. Эти процессы можно было бы лучше понять, проанализировав конкретный транслейтом (т.е. подмножество мессенджерных РНК [мРНК], активно транслировавшихся). Полирибосомы или полисомы представляют собой комплексы множественных рибосом, связанных с мРНК, обычно используемых для изучения трансляции3. Метод профилирования полисом состоит из анализа мРНК, связанных с полисомами, и успешно используется для изучения посттранскрипционных механизмов, контролирующих экспрессию генов, возникающих в различных биологических процессах 4,5.
Исторически сложилось так, что анализ экспрессии генома был сосредоточен в первую очередь на определении обилия мРНК 6,7,8,9. Тем не менее, существует отсутствие корреляции между уровнями транскрипта и белка из-за различных стадий посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, особенно трансляции 10,11,12. Более того, не наблюдалось никакой зависимости между изменениями на уровне транскриптома и теми, которые происходят на уровне транслейтома13. Прямой анализ набора транслируемых мРНК позволяет более точно и полно измерить экспрессию клеточного гена (конечной точкой которого является обилие белка), чем тот, который получен, когда анализируются только уровни мРНК 14,15,16.
Этот протокол описывает, как полисомы растительного происхождения очищаются от неповрежденных соевых конкреций путем дифференциального центрифугирования через двухслойную сахарозную подушку (рисунок 1). Однако, поскольку рибосомы, полученные из бактероидов, также присутствуют в узелках, смесь рибосом и видов РНК очищается, хотя эукариотические представляют собой основную фракцию (90%-95%). Описаны также последующее выделение РНК, количественная оценка и контроль качества (рисунок 1). Этот протокол в сочетании с RNA-seq должен обеспечить экспериментальные результаты по трансляционной регуляции эукариотических мРНК в сложной ткани, такой как симбиотический узелок.
Рисунок 1: Схематический обзор предлагаемой методики очистки эукариотических полисом от симбиотических конкреций. Схема дает обзор этапов, используемых в протоколе от (1) роста растений и (2) сбора конкреций до (3) приготовления цитозольных экстрактов, (3) получения ОБЩИХ образцов и (4) образцов PAR, а также (5) экстракции РНК и контроля качества. Сокращения: PEB = буфер экстракции полисом; RB = буфер повторного суспендирования; TOTAL = общая РНК; PAR = полисомно-ассоциированная мРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рост растений и прививка ризобии
- Чтобы получить необходимые конкреции, посейте семена сои по выбору в выбранный субстрат в камере роста в контролируемых условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе семена были посеяны в пластиковую бутылку объемом 0,5 л, наполненную смесью песка: вермикулит (1:1). Камеру роста устанавливали с температурой цикла день/ночь 28 °C /20 °C соответственно и фотопериодом света/темноты 16 ч/8 ч соответственно. Интенсивность фотосинтетически активного излучения составляла 620 мкмоль·м−2·с−1. - Заранее приготовьте жидкий дрожжевой экстракт маннитола (ЙЕМ)-среды (см. Таблицу материалов). Автоклав среды.
- В тот же день посева семян привить одну колбу, содержащую 100 мл YEM, штаммом Bradyrhizobium elkanii U1302. Инкубируйте колбу при 28 °C на орбитальном шейкере при 100 об/мин.
- Дать ризобии расти в течение 2 дней и привить рассаду 2 мл культуры.
2. Вододефицитная очистка (опционально)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается вододефицитная обработка растений сои. Эта часть может быть изменена или полностью опущена в зависимости от рассматриваемого экспериментального вопроса.
- Выращивайте рассаду сои в течение 19 дней (стадия развития V2-3) без ограничения воды. Держите субстрат на полевой мощности с B&D-средой17 , дополненной 0,5 мМ KNO3.
- На 20 день выводят полив.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь содержание воды измерялось ежедневно гравиметрией (содержание воды гравиметрическим) в периоды роста и дефицита воды. - Измеряйте устьичную проводимость в трех экземплярах ежедневно на поверхности абаксиального листа с помощью порометра, по указанию производителя (см. Таблицу материалов), с 20-го дня до конца периода дефицита воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончание периода дефицита воды определялось индивидуально для каждого растения, когда значение устьичной проводимости составляло примерно 50% от того, которое было получено на 20-й день посева.
3. Заготовка конкреций
- Соберите жидкий азот в чистый контейнер и нанесите этикетку на 15 мл пробирки (по одной на каждое растение).
ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с жидким азотом в криочатках, лицевых щитках и защитных очках. - Извлеките каждое растение по отдельности. Вырежьте и выбросьте воздушную часть. Тщательно промойте корень водой, чтобы удалить оставшийся субстрат.
- Отсоедините каждый узелок от корня и соберите их в предварительно охлажденную 15-литровую трубку. Заморозьте трубки и храните их при температуре −80 °C.
4. Приготовление цитозольных экстрактов
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечной целью этого протокола является получение высококачественной общей РНК (TOTAL) и полисом-ассоциированной РНК (PAR). Поэтому работайте в условиях, предотвращающих деградацию РНК, всегда сохраняя образцы при 4 °C и используя лабораторное оборудование и растворы без РНКазы. Если не указано иное, все растворы готовят стерильной сверхчистой водой.
- Приготовление растворов буферного запаса
- Подготовьте автоклавируемые стоковые растворы, перечисленные в таблице 1, автоклавируйте их в течение 15 мин и держите на RT.
- Подготовьте фильтрующие стерилизуемые растворы, перечисленные в таблице 1, фильтруйте и стерилизуйте их и держите при температуре −20 °C.
- Подготовьте буфер экстракции полисом (ПЭБ, см. таблицу 1) и держите его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные тома предназначены для шести образцов. - Охладите центрифугу до 4 °C и поместите на лед микроцентрифужные трубки объемом 2 мл.
- Взвесьте приблизительно 0,2 г неповрежденных конкреций в весовой посуде и переложите их в предварительно охлажденную трубку объемом 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг быстро, чтобы избежать размораживания образцов. В качестве альтернативы вместо 0,2 г может использоваться расчетный объем конкреций 0,4-0,5 мл. - Добавьте 1,2 мл ПЭБ, дайте образцу разморозиться в течение 2 мин и гомогенизировать с помощью тканевой шлифовальной машины до полного разрушения и гомогенизации конкреций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно измельчите узелки после размораживания, так как они будут достаточно мягкими, чтобы их можно было легко разрушить с помощью тканевых шлифовальных машин (см. Таблицу материалов) в микроцентрифужных трубках. Замороженные конкреции трудно измельчить. Кроме того, рекомендуется помещать трубки в настольный охладитель (0 ° C) для правильной гомогенизации при сохранении образцов охлажденными. - Инкубируйте образцы на льду с мягким перемешиванием в течение 10 минут или до тех пор, пока все образцы не будут обработаны.
- Центрифуга при 16 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для гранулирования мусора. Извлеките супернатант и повторите шаг центрифуги.
- Осторожно извлеките осветленный цитозольный экстракт и перенесите аликвоту объемом 200 мкл в чистую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для ПОЛНОЙ изоляции (ОБРАЗЦЫ ВСЕГО; см. раздел 7).
5. Приготовление сахарозных подушек
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется двухслойная сахарозная подушка (12% и 33,5%) в ультрацентрифужных трубках объемом 13,2 мл (см. Таблицу материалов). Все растворы готовятся стерильной сверхчистой водой.
- Приготовьте растворы сахарозы и соли.
- Готовят 100 мл 2 М раствора сахарозы (68,5%, табл. 1).
- Готовят 10-кратный солевой раствор (табл. 1).
- Подготовьте два слоя сахарозной подушки, как описано в таблице 2. См. таблицу 1 состава антибиотиков (CHX и CHL) стоковых растворов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные объемы предназначены для шести подушек. - Влейте 4,5 мл 33,5% слоя сахарозы в трубки центрифуги. Затем добавьте 4,5 мл 12% слоя осторожно и медленно с помощью микропипетки P1000. Положите пробирки на лед до добавления осветленного цитозольного экстракта.
6. Полисомная очистка
- Загрузите 1 мл осветленного цитозольного экстракта (стадия 4.8) поверх подушки сахарозы путем тщательного пипетирования на боковую стенку трубки.
- Передавайте ультрацентрифужные трубки в предварительно охлажденные ведра и центрифугу со скоростью 217 874 × g (35 000 об/мин в указанном роторе [см. Таблицу материалов]) в течение 2 ч при 4 °C.
- Откажитесь от оставшегося цитозольного экстракта и сахарозной подушки и повторно суспендируйте полисомальную гранулу 200 мкл предварительно охлажденного RB (предварительно приготовленного согласно таблице 1).
- Инкубировать в течение 30 мин на льду, а затем перенести полисомальную ресуспенсию в предварительно охлажденные трубки объемом 1,5 мл. Приступайте к экстракции РНК (образцы PAR).
7. Экстракция РНК и контроль качества
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для образцов TOTAL (шаг 4.8) и PAR (шаг 6.4).
- Приготовьте 75% EtOH со стерильной сверхчистой водой и охладите ее до -20 °C. Дополнительно охлаждают хлороформ и изопропанол до −20 °C.
- Гомогенизировать образцы 750 мкл реагента выделения РНК и инкубировать в течение 5 мин при РТ.
- Добавьте 200 мкл холодного хлороформа и энергично встряхните пробирки в течение 15 с. Инкубировать в RT в течение 10 мин.
- Центрифуга при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для разделения фаз. Переложите 500 мкл верхней водной фазы в чистую трубку, не нарушая розовую органическую фазу, и добавьте 375 мкл холодного изопропанола и 0,5 мкл гликогена без РНКазы (см. Таблицу материалов). Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гликоген является носителем, используемым в качестве сопреципитатора для увеличения извлечения нуклеиновых кислот из осаждения спирта. - Инкубировать смесь в течение 10 мин при 4 °C и центрифугу при 12 000 × г в течение 15 мин. Выбросьте супернатант.
- Промыть осадок РНК 1 мл холодного 75% EtOH. Перемешать коротким вихрем.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре −20 °C в течение ночи. - Центрифугу при 7 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, осторожно удаляют супернатант с помощью микропипетки и сушат на воздухе гранулу РНК.
- Растворить гранулы в 50 мкл воды, не содержащей РНКазы, и инкубировать при 65 °C в течение 5 мин.
- Оценить концентрацию и целостность РНК с помощью высокочувствительного капиллярного электрофореза18 (см. Таблицу материалов) и/или электрофореза на 2% безрназном агарозном геле19 (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы РНК не будут использоваться немедленно или будут отправлены в центр секвенирования для подготовки библиотеки РНК-секв, рекомендуется использовать EtOH для их осаждения.
8. Осаждение РНК
- Охладите центрифугу и EtOH до 4 °C.
- Готовят 3 М ацетата натрия.
- Приготовьте 70% EtOH со стерильной сверхчистой водой и охладите ее до -20 °C.
- Оцените объем выборки. Добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия, 3 объема холодного EtOH и 0,5 мкл гликогена без РНКазы. Тщательно перемешать.
- Оставить при температуре −20 °C до тех пор, пока это не понадобится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осажденные образцы РНК могут храниться до 1 года при температуре −80 °C.
9. Стандартный конвейер для анализа экспрессии генов
- Выполняйте в среднем 40M Парных считываний Illumina с длиной считывания >100 bp для уверенного анализа данных транскриптома и трансплантома.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный анализ данных RNA-seq включает следующие этапы 9.2-9.5. - Проводите проверку качества считывания с помощью FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) или многовыборочного MultiQC20.
- Удалите адаптер и низкокачественные последовательности, используя, среди прочего, Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, серп23 или Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).
- Если для вида доступен эталонный геном, выполните чтение картирования по ссылке, а затем количественное определение численности, используя Bowtie224, TopHat225 или Salmon26 и featureCounts27, помимо других инструментов с открытым исходным кодом.
- Выполните статистический анализ для дифференциальной экспресс-идентификации генов с использованием edgeR28, DESeq229 или limma30, среди прочих.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение с открытым исходным кодом можно использовать локально, через командную строку. В качестве альтернативы они могут управляться через веб-браузер на общедоступном сервере, таком как Galaxy31 или GEOexplorer32, которые предлагают графический пользовательский интерфейс, так что для их использования не требуется знание командной строки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка количества и качества фракций TOTAL и PAR, очищенных с помощью вышеупомянутой процедуры, является ключом к определению ее успеха, поскольку для большинства последующих приложений, таких как секвенирование РНК, высококачественные образцы имеют основополагающее значение для подготовки библиотеки и секвенирования. Кроме того, целостность молекул РНК позволяет сделать снимок профиля экспрессии генов в момент сбора образца18. В этом контексте число целостности РНК (RIN) получается при выполнении этих измерений с использованием биоанализатора. RIN используется для присвоения значений целостности надежным, надежным и независимым от пользователя способом, в диапазоне от 10 (неповрежденный) до 1 (полностью деградированный)18.
На рисунке 2A,B показан стандартный выход высокочувствительной системы капиллярного электрофореза (Bioanalyzer) для нескольких фракций образцов TOTAL и PAR. Очень хорошее качество наблюдается для всех образцов, так как резкие полосы рибосомальной РНК (рРНК) могут быть визуализированы без какого-либо смазанного вида. Однако это не отражено в значениях RIN, поскольку они находятся в диапазоне от 5,9 до 7,5, что соответствует неповрежденным образцам. Тем не менее, как упоминалось ранее, визуальных признаков деградации образца нет, как видно на рисунке 2C. На рисунке 2D показан пример результата биоанализатора почти полностью деградировавшего образца для сравнения. Оборудование также не смогло идентифицировать пики 18S и 25S, как видно на электроферограммах как для образцов TOTAL, так и par (рисунок 2B). Следовательно, пропорция рибосомных полос (25S:18S; еще один показатель целостности РНК) не могла быть рассчитана. Высококачественная РНК обычно демонстрирует соотношение 25S:18S 2:133.
Рисунок 2: Оценка количества и качества мРНК, связанных с полисомами. (A) Репрезентативная виртуальная гелевая реконструкция высокочувствительного капиллярного электрофореза (биоанализатора) получена из 12 образцов с соответствующими значениями RIN и концентрации. Полоса 1 - полоса 6 соответствуют общим фракциям РНК (TOTAL) шести образцов конкреций, а полоса 7 - полоса 12 соответствуют полисомно-ассоциированным фракциям мРНК (PAR) одних и тех же образцов. Зеленая линия: нижний маркер присутствует во всех полосах. (B) Представление электроферограммы показано для образца 4 (в качестве примера TOTAL) и образца 10 (в качестве примера PAR). Указаны пики 18S и 25S. Пики, возможно, соответствующие 16S и 23S (прокариотическим рРНК), обозначаются *. Показаны увеличения на этих пиках (B1 и B2). В биоанализаторе был использован анализ Eukaryote Total RNA Nano. (C) Результаты электрофореза репрезентативного агарозного геля из шести образцов (слева): 10 мкл фракций TOTAL и PAR были загружены на 2% агарозный гель и отделены (80 В в течение 35 мин). Справа есть еще один гель только образца 2, где прокариотические рРНК могут быть визуализированы более четко. Эукариотические рРНК (18S и 25S) обозначены черными наконечниками стрел, а прокариотические рРНК (16S и 23S) серыми наконечниками стрел. (D) Пример результата биоанализатора деградированного образца. L: стандартная лестница. Зеленая линия: нижний маркер присутствует во всех полосах. Сокращения: RIN = номер целостности РНК; PAR = полисомно-ассоциированная мРНК; nt = нуклеотиды; L = стандартная лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Поскольку эти образцы взяты из симбиотических узелков, где сосуществуют эукариотические и прокариотические РНК, очищенная РНК представляет собой смесь обоих видов (хотя эукариотические являются большинством). Следовательно, ожидается, что в электроферограммах будут наблюдаться пики, соответствующие рРНК 16S и 23S (рисунок 2B и увеличение B1 и B2). Эти «дополнительные» пики могут объяснить более низкие значения RIN.
Оборудование также рассчитывает концентрации проб с учетом стандартной лестницы в полосе 1 в качестве эталона. Как и ожидалось, образцы TOTAL имеют более высокие значения концентрации, чем образцы PAR. Тем не менее, даже для них достаточно РНК, чтобы приступить к подготовке библиотеки и РНК-seq, поскольку требования к количеству образцов обычно рекомендуют не менее 1,0 мкг.
| Автоклавируемые растворы для хранения при комнатной температуре |
| 2 M Трис-HCl pH 9.0 |
| 2 млн кКл |
| 0,5 М EGTA pH 8,0 (скорректировано с 10 М NaOH) |
| 1 ММгCl2 |
| 20% (v/v) PTE (встряхните флакон перед пипеткой раствора) |
| 10% DOC |
| 20% Смесь моющих средств: 20% (мас./об.) Brij L23, 20% (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20% (v/v) Tween 20 (растворяется при нагревании при 60 °C) |
| Фильтрующие стерилизуемые растворы для замораживания при -20 °C |
| 0,5 М DTT |
| 0,5 М ПМСФ |
| 50 mg.mL-1 циклогексимид (CHX) (в EtOH) |
| 50 mg.mL-1 хлорфеникол (CHL) (в EtOH) |
| Складское решение | Объем (мкл) для 10 мл ПЭБ | Объем (мкл) для 2 мл RB |
| 2 млн кКл | 1,000 | 200 |
| 0,5 М ЭГТА рН 8,0 | 500 | 100 |
| 1 ММгCl2 | 356 | 70 |
| 20% (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| 20% Смесь моющих средств | 500 | - |
| 0,5 М DTT | 100 | 20 |
| 0,5 М ПМСФ | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 КХЛ | 10 | 2 |
| Н2О | 5,004 | 1,406 |
| 2 М раствора сахарозы (68,5%): 68,5 г сахарозы в воде. Хранить при комнатной температуре (RT). | ||
| 10x раствор соли: 0,4 М Трис-ГКл рН 8,4, 0,2 М ККл, 0,1 ММгЛ2; автоклав в течение 15 мин, заморозить при -20 °C. | ||
Таблица 1: Буферы и решения, используемые в этом протоколе. Приведенные объемы рассчитаны на шесть образцов. Сокращения: EGTA = этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэтер)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота; PTE = полиоксиэтилен(10)тридециловый эфир; DOC = дезоксихолат натрия; DTT = дитиотрейтол; PMSF = фенилметансульфонилфторид.
| Слой сахарозы (%) | Сахароза 2 М (мл) | Солевой раствор 10x (мл) | CHX 50 mg.mL-1 (мкл) | CHL 50 mg.mL-1 (мкл) | H2O (мл) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Таблица 2: Состав двух слоев сахарозы (12% и 33,5%). Приводимые объемы предназначены для приготовления шести подушек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение регуляции экспрессии генов на трансляционном уровне имеет решающее значение для лучшего понимания различных биологических процессов, поскольку конечной точкой экспрессии клеточных генов является обилие белка13,14. Это можно оценить, проанализировав транслейтом интересующей ткани или организма, для которого должна быть очищена полисомальная фракция, а связанные с ней мРНК проанализированы 3,4,34,35,36.
Здесь представлен способ очистки полисом симбиотических конкреций сои с помощью сахарозных подушек с последующей экстракцией TOTAL и PAR. Получение обеих фракций РНК является одним из важных моментов этого протокола, поскольку RNA-seq и стандартные конвейеры для экспрессии генов могут быть реализованы впоследствии. Таким образом, транскриптом и транслейтом узелка могут быть изучены.
Альтернативным методом очистки полисом является метод трансляции рибосомной аффинной очистки (TRAP), в котором экспрессия эпитопно-меченой версии рибосомного белка L18 позволяет осуществлять иммунопреципитацию рибосом37,38. Однако этот метод требует генерации трансгенных растений, что может быть сложной задачей для некоторых видов, таких как соя. Более того, рибосомное профилирование или ribo-seq метод 15,39,40,41, который предполагает глубокое секвенирование рибосомно-защищенных фрагментов мРНК после полисомной очистки, является альтернативой для изучения транслейлома с более высоким разрешением, чем профилирование полисом, поскольку можно оценить точное количество и положение рибосом на отдельных мРНК. Тем не менее, этот подход является более трудоемким, требует большего количества образца и является вычислительно интенсивным, поскольку восстанавливаются небольшие фрагменты РНК.
Существует несколько критических экспериментальных аспектов, таких как качество образца, из которого будут очищены полисомы, особенно если используется замороженная ткань, как в этом протоколе. Интактные конкреции должны быть отделены от корня и немедленно заморожены в жидком азоте перед хранением при −80 °C. По нашему опыту, полисомы и связанные с ними мРНК могут быть успешно очищены от конкреций в течение нескольких месяцев хранения. Кроме того, весь протокол должен быть реализован в условиях, предотвращающих деградацию РНК для получения высококачественных TOTAL и PAR, что имеет решающее значение для последующих приложений, таких как синтез кДНК и высокопроизводительное секвенирование.
Основным ограничением метода является стадия ультрацентрифугирования, поскольку ультрацентрифуги не широко доступны во многих лабораториях. Кроме того, уместно упомянуть, что гранула, полученная после стадии центрифугирования, может содержать, помимо полисом, другие комплексы рибонуклеопротеинов, которые не являются трансляционно активными. Более того, одним из соображений при выполнении представленного здесь протокола с другой соевой тканью является то, что это, вероятно, потребует оптимизации количества образца, соотношения образца: PEB и процедуры гомогенизации.
Учитывая, что образец, используемый в этом протоколе, является органом, образованным в результате симбиотического взаимодействия между корневой клеткой растения и бактерией, выполнение двойного анализа РНК-seq42 (с образцами TOTAL и PAR) было бы интересно, поскольку это позволило бы исследовать транскрипционные и трансляционные ответы обоих организмов. Метод, описанный здесь, может быть полезен для этого вопроса, если экстракция бактериальных РНК оптимизирована.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось грантом CSIC I+D 2020 No 282, грантом FVF 2017 No 210 и PEDECIBA (Мария Марта Сайнс).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
