ここで紹介するのは、微小管およびキネシンモーターから活性ネマティクスを調製する方法であり、タンパク質の調製および構築、ならびに活性ネマチック閉じ込めのためのウェルの使用を含む。
生体高分子ベースの活性相の形成は、活性液晶の新興分野と細胞生物学におけるそれらの可能な役割を探求することに関心のある研究者にとって重要な技術となっています。これらの新しいシステムは、エネルギーを局所的に消費し、非平衡の動的流体を生成する自己駆動サブユニットで構成されています。本報告に記載の活性液晶相を形成するには、生体高分子や分子モーターなどの精製タンパク質成分が結合し、アデノシン三リン酸(ATP)の存在下で活性ネマチック相が自発的に形成されます。ネマチック状態を観察するには、材料を顕微鏡に適した形状に十分に高い密度で閉じ込める必要があります。この記事では、微小管とキネシンモーターを使用して活性ネマチック相を形成するための2つの異なる方法について説明します:油と水の界面での2次元活性層の組み立てと、エラストマーウェルを使用した油層の下での組み立て。異なる形状の小さなウェルに活性材料を挿入する技術も記載される。
活性流体は、局所環境から燃料を引き出すエネルギー駆動の粒子または要素で構成されています。適切な条件下では、これらの運動活性要素は集合的に作用して、長い長さスケールにわたって創発的な流体力学を生み出すことができます。このような非平衡相の振る舞いの文献にはさまざまな例があり、活動期は生命系のスペクトル全体で見つけることができます。いくつかの注目すべき例は、細菌1のコロニー、細胞シート2,3、および生物4,5の群れまたは群がりである。活性相はまた、細胞骨格フィラメントの凝縮相において、細胞6の一部として、または生物学的に抽出された成分を利用するように設計された合成系において広く研究されている7、8、9。生物学的抽出物から組み立てられた天然および合成システムの両方における液晶秩序化およびトポロジカル欠陥の形成は、研究コミュニティにとって特に興味深いものです。近年、研究グループはそのようなシステム、それらの基本的な物理的特性、および生物学との関連性を調べてきました2,3,10,11。
この論文は、微小管とキネシンモータータンパク質の組み合わせからの活性ネマチック状態の形成に焦点を当てています。従来のネマチック液晶は、構成分子が配向秩序を示す物質の平衡相です。例えば、比較的剛直な棒状分子からなる流体は、ネマチック相と、より高い温度では、無配向等方性流体相12の両方を示し得る。活性ネマチック相の最初の実験例は、Sanchezら13によって開発され、モータータンパク質のクラスターを使用して隣接する微小管束間のせん断運動を生成する初期のin vitro実験14を適応させた。この微小管系が薄い層に限定されると、自発的なネマティック秩序が出現した。近年、活動的なネマチック状態は、いくつかの実験的15,16および理論的17,18の研究グループによって集中的に研究されており、能動的乱流(流体が自己駆動のカオス流を生成する状態19)や移動トポロジカル欠陥などの現象に焦点を当てています。この論文では、さまざまな実験形状の微小管とキネシンモーターから活性ネマチック状態を調製して形成する方法について説明します。最初に、異なる成分溶液の調製方法が説明され、続いて、2つの異なるフローチャンバ形状を使用して活性ネマチックを形成する方法が説明される。典型的なイメージング結果を示す。最後に、活性ネマチックをウェルおよびチャネル内に閉じ込めるための方法が記載されている。
プロトコル全体を通して、実験者がいくつかの重要なチェックを行うことができるいくつかのポイントがあります。いずれかのデバイスに活物質を充填する前に、蛍光顕微鏡( 図1を参照)を使用して、微小管が重合し、理想的には長さが~2〜3μmであることを確認する必要があります。微小管が顕微鏡下で見えない場合、微小管は解重合している可能性があり、活性ネマティックは形成されません。個々の微小管は非常に小さいため、顕微鏡で直接観察するのは難しい場合があります。この研究では、困難な低照度アプリケーション用に設計された高品質の蛍光カメラを、関連するソフトウェアとともに使用して、フィラメントの成長を検証しました。重要な蛍光凝集体は、解重合または変性タンパク質の存在を示している可能性があるため、この段階では存在すべきではありません。また、微小管、MIX、ATPをプロトコルに記載されているのと同じ比率で組み合わせて、簡単な顕微鏡テストスライドを作成することもお勧めします。コンポーネントを組み合わせることでアクティビティが開始され、材料は 図2C に示すようなものになり、バンドルが存在し、全体に顕著なフィラメントの動きが見えるはずです。
フローセル法を使用する場合、フローセルの遠心分離時間と配向は、均一な活性層の形成にとって重要です。この手順では、使用する遠心分離機の種類によっては微調整が必要になる場合があります。回転面に垂直な方向を向いた活性面でフローセルを遠心分離すると、材料を流体界面に均一に押し込むことができるため、最良の結果が得られます。遠心分離する前に、フローセルが慎重に密閉されていることを再確認してください。
反転法を使用して閉じ込められたアクティブネマティクスを生成する場合、最適化するためのいくつかのステップがあります。まず、高解像度の構造を生成する3D印刷方法を使用することが重要です。不均一な側壁は微小管を引っ掛ける原因となり、流れを乱す可能性があります。井戸は深すぎてはいけません(この研究では、厚さ2 mmの油層を持つ深さ150〜200 μmの井戸を使用しました)。実験者は、最良の結果を得るために、試行錯誤によってこれらのパラメータをわずかに調整する必要がある場合があります。
フローセル法および反転法は、異なる油12および水中構造13を含む、活性流に影響を与える様々な効果を調べるために異なる著者によって使用されてきた。方法の選択は実験目的によって異なります。フローセル法を使用すると、活性層の上方からの光学イメージングは、上にある流体が異なるため、反転法よりも鮮明になります。フローセル法では、ガラスカバースリップと薄い水層を介してイメージングが行われますが、反転法は油層を上に持つように設計されています。これは、反転法では長い作動距離の対物レンズが必要であり、画質が低下することを意味します。画質の違いは、図2D(フローセル法)と図3(反転法)、およびムービー1とムービー2をそれぞれ比較することで確認できます。図3では、図2よりも作動距離の長い低倍率レンズが必要でした。倒立法のこれらのイメージングの欠点は、顕微鏡スライド基板の適切な作動距離を持つ対物レンズと組み合わせて、適切な倒立顕微鏡が利用可能であれば回避できます。より薄いガラスを基板として使用して、標準的な作動距離対物レンズを使用できます。
利点として、反転形状により、より広い範囲のオイル粘度の使用が可能になり、必ずしもスイングバケット遠心分離を必要とせず(これが利用できない場合)、金型が準備されるとシステムの準備が比較的容易になります。ただし、反転法を使用してウェルに閉じ込めるには、材料を明確に定義された2D層にするために遠心分離が重要な場合があります。
フローセル法は、最近、連続活性層が必要な実験で非常にうまく使用されています。私たちの最近の研究では、高品質のイメージングとテクスチャ解析が重要な活性層のトポロジカル欠陥のダイナミクスを調べました19。また、フローセル法は、油沈下微細構造が活性流16 および柱に及ぼす影響を調査して、活性流31の欠陥をトラップするために使用されている。この方法は、連続活性層の形成に非常に適しており、画質が優れています。ただし、最終的な2D活性層の生成に使用される遠心分離ステップは実行が困難な場合があり、フローセルは漏れや気泡が発生しやすくなります。反転法は、成功率が高く、構築が容易で、高解像度の3Dプリントマスターモールドを作成できれば、あらゆる基板パターンまたは形状に使用できる非常に有用な代替手段です。この方法は、充填井を比較的簡単にするため、活性ネマティックダイナミクスに対する幾何学的閉じ込めの影響を調べるのにも役立ちます。
本論文では、微小管とキネシンモーターから活性ネマチックを形成する2つの方法と、材料をウェルに閉じ込める技術について説明します。提示されたシステムは、現在文献にあるアクティブなネマチック相の最もクリーンな例を表しており、世界中のいくつかのグループによって再現されています。この材料の重要性は、その成分の生物学的起源にあるだけでなく、活性秩序流体のまったく新しい方向性を開くことにもあります。このシステムを使用してその基本的な特性を解明することにより、科学者は完全に合成された活性相の設計に進むことができます。
閉じ込めが能動ネマティクスに及ぼす影響に着目した実験は、トポロジカル閉じ込め下での能動流の挙動やトポロジカル欠陥ダイナミクスに関する根本的な疑問に答える可能性を秘めています。ここで紹介する方法は、マイクロフルイディクスやアクティブミキシングなど、形状に焦点を当てたさまざまな実験とその分析の実行に役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、寛大な資金提供に対して全米科学財団(NSF)の賞DMR-1808926に感謝したいと思います。このプロジェクトは、カリフォルニア大学マーセド校の細胞および生体分子機械センター(HRD-1547848)およびブランダイス生体材料施設材料研究科学工学センター(DMR-2011486)を通じてNSFによっても支援されました。金型の3Dプリントを支援してくれたカリフォルニア大学マーセド校のビン・リュー博士と、反転実験法の開発中に科学的アドバイスをしてくれたジョルディ・イグネス博士に感謝します。
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |