여기에는 단백질 준비 및 구성과 활성 네마틱 감금을위한 우물 사용을 포함하여 미세 소관 및 키네신 모터에서 활성 네마틱스를 준비하는 방법이 제시됩니다.
생체 고분자 기반 활성상의 형성은 활성 액정의 새로운 분야와 세포 생물학에서의 가능한 역할을 탐구하는 데 관심이있는 연구자에게 중요한 기술이되었습니다. 이 새로운 시스템은 국부적으로 에너지를 소비하는 자체 구동 하위 단위로 구성되어 평형을 벗어난 동적 유체를 생성합니다. 이 보고서에 설명된 활성 액정상을 형성하기 위해 바이오폴리머 및 분자 모터를 포함한 정제된 단백질 성분이 결합되고 활성 네마틱 상이 아데노신 삼인산(ATP)의 존재 하에 자발적으로 형성됩니다. 네마틱 상태를 관찰하려면 재료가 충분히 높은 밀도로 현미경 검사에 적합한 형상으로 제한되어야 합니다. 이 기사에서는 미세 소관과 키네신 모터를 사용하여 활성 네마틱 상을 형성하는 두 가지 방법, 즉 오일과 물 계면에서 2 차원 활성층을 조립하고 엘라스토머 웰을 사용하여 오일 층 아래에서 조립하는 방법에 대해 설명합니다. 활성 물질을 상이한 형상의 작은 우물에 삽입하는 기술이 또한 기재된다.
활성 유체는 에너지 구동 입자 또는 지역 환경에서 연료를 끌어오는 요소로 구성됩니다. 적절한 조건 하에서, 이러한 운동성 활성 요소는 집합 적으로 작용하여 긴 길이 스케일에 걸쳐 창발적 유체 역학을 생성 할 수 있습니다. 문헌에서 이러한 평형 외 위상 거동의 다양한 예가 있으며 활성 위상은 살아있는 시스템의 스펙트럼 전반에 걸쳐 찾을 수 있습니다. 몇 가지 주목할만한 예는 박테리아1의 식민지, 세포 시트2,3 및 유기체 4,5의 무리 또는 떼입니다. 활성기는 또한 세포6의 일부로서 또는 생물학적으로 추출된 성분7,8,9를 사용하도록 설계된 합성 시스템에서, 세포골격 필라멘트의 응축된 단계에서 광범위하게 연구되었다. 생물학적 추출물로부터 조립 된 자연 발생 및 합성 시스템 모두에서 액정 순서 및 토폴로지 결함의 형성은 연구 커뮤니티에 특히 중요합니다. 최근 몇 년 동안 연구 그룹은 그러한 시스템, 기본 물리적 특성 및 생물학 2,3,10,11과의 관련성을 조사했습니다.
이 논문은 미세 소관과 키네신 운동 단백질의 조합으로부터 활성 네마틱 상태의 형성에 초점을 맞추고 있습니다. 전통적인 네마틱 액정은 구성 분자가 방향 순서를 나타내는 물질의 평형 단계입니다. 예를 들어, 비교적 단단한 막대 형 분자로 구성된 유체는 네마틱 상 및 더 높은 온도에서 방향성이없는 등방성 유체 상(12)을 모두 나타낼 수 있습니다. 활성 네마틱 단계의 첫 번째 실험 예는 Sanchez et al.13에 의해 개발되었으며, 운동 단백질 클러스터를 사용하여 인접한 미세 소관 다발 사이의 전단 운동을 생성하는 초기 시험관 내 실험 14를 적용했습니다. 이 미세 소관 시스템이 얇은 층에 국한되었을 때, 자발적인 네마틱 순서가 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 활성 네마틱 상태는 여러 실험 15,16 및 이론적 17,18 연구 그룹에 의해 집중적으로 연구되었으며, 활성 난류 (유체가 자체 구동 혼돈 흐름 19를 생성하는 상태) 및 이동성 토폴로지 결함과 같은 현상에 중점을 둡니다. 이 논문은 다양한 실험 기하학의 미세소관 및 키네신 모터로부터 활성 네마틱 상태를 준비하고 형성하는 방법을 설명합니다. 먼저, 상이한 성분 용액에 대한 제조 방법이 설명되고, 이어서 2개의 상이한 유동 챔버 형상을 사용하여 활성 네마틱을 형성하는 방법이 뒤따른다. 일반적인 이미징 결과가 표시됩니다. 마지막으로, 활성 네마틱을 우물과 채널에 가두는 방법이 설명됩니다.
프로토콜 전반에 걸쳐 실험자가 몇 가지 중요한 검사를 할 수 있는 몇 가지 사항이 있습니다. 두 장치 중 하나에 활성 물질을 채우기 전에 형광 현미경( 그림 1 참조)을 사용하여 미세소관이 중합되고 이상적으로는 길이가 ~2-3μm인지 확인해야 합니다. 현미경으로 미세소관이 보이지 않으면 해중합되었을 수 있으며 활성 네마틱이 형성되지 않습니다. 개별 미세소관은 매우 작기 때문에 현미경을 통해 직접 관찰하는 것이 어려울 수 있습니다. 이 연구에서는 까다로운 저조도 응용 분야를 위해 설계된 고품질 형광 카메라를 관련 소프트웨어와 함께 사용하여 필라멘트 성장을 확인했습니다. 이 단계에서 중요한 형광 응집체가 존재해서는 안되며, 이는 해중합 또는 변성 단백질의 존재를 나타낼 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 것과 동일한 비율로 미세소관, MIX 및 ATP를 결합하여 간단한 현미경 테스트 슬라이드를 만드는 것도 좋은 생각입니다. 활동은 구성 요소를 결합하는 것으로 시작되어야하며 재료는 그림 2C 에 표시된 것과 유사하게 나타나야하며 번들이 존재하고 전체적으로 눈에 띄는 필라멘트 움직임이 보입니다.
플로우 셀 방법을 사용할 때, 플로우 셀의 원심 분리 시간 및 방향은 균일 한 활성층의 형성에 중요합니다. 이 단계는 사용되는 원심분리기 유형에 따라 약간의 미세 조정이 필요할 수 있습니다. 회전면에 수직으로 배향된 활성 평면으로 플로우 셀을 원심분리하면 재료가 유체 계면에 균일하게 푸시될 수 있으므로 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 원심분리하기 전에 플로우 셀이 조심스럽게 밀봉되었는지 다시 확인하십시오.
반전 방법을 사용하여 제한된 활성 네마틱을 생성할 때 최적화해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 고해상도 구조를 생성하는 3D 프린팅 방법을 사용하는 것이 중요합니다. 측벽이 고르지 않으면 미세 소관이 걸려 흐름을 방해 할 수 있습니다. 우물은 너무 깊지 않아야합니다 (이 연구에서는 2mm 두께의 위에 놓인 오일 층이있는 150-200 μm 깊이의 우물이 사용되었습니다). 실험자는 최상의 결과를 얻기 위해 시행 착오를 통해 이러한 매개 변수를 약간 조정해야 할 수도 있습니다.
유동 셀 방법 및 반전 방법은 상이한 오일(12) 및 침수 구조(13)를 포함하여 활성 유동에 영향을 미치는 다양한 효과를 살펴보기 위해 상이한 저자에 의해 사용되어 왔다. 방법의 선택은 실험 목표에 달려 있습니다. 플로우 셀 방법을 사용하면 활성층 위로부터의 광학 이미징이 서로 다른 위에 놓인 유체로 인해 반전 된 방법보다 선명합니다. 플로우 셀 방법에서 이미징은 유리 커버 슬립과 얇은 물 층을 통해 수행되는 반면 반전 방법은 오일 층이 위에 있도록 설계되었습니다. 즉, 반전 방법에 긴 작동 거리 대물렌즈가 필요하며 이미지 품질이 저하됩니다. 이미지 품질 차이는 그림 2D(플로우 셀 방법)와 그림 3(반전 방법), 동영상 1과 동영상 2를 각각 비교하여 확인할 수 있습니다. 그림 2에 사용된 것보다 그림 3에는 작동 거리가 더 긴 더 낮은 배율 렌즈가 필요했습니다. 도립 방법에 대한 이러한 이미징 단점은 현미경 슬라이드 기판에 적절한 작동 거리를 가진 대물렌즈와 결합된 적절한 도립 현미경을 사용할 수 있는 경우 피할 수 있습니다. 더 얇은 유리는 표준 작동 거리 대물렌즈를 사용할 수 있도록 기판으로 사용할 수 있습니다.
장점으로, 반전 된 형상은 더 넓은 범위의 오일 점도를 사용할 수 있고, 반드시 스윙 버킷 원심 분리가 필요하지 않으며 (사용할 수없는 경우) 금형이 준비되면 시스템 준비가 상대적으로 쉽습니다. 그러나 반전 된 방법을 사용하여 웰을 가두는 경우 재료를 잘 정의 된 2D 층으로 가져 오기 위해 일부 원심 분리가 중요 할 수 있습니다.
플로우 셀 방법은 최근 연속 활성층이 필요한 실험에서 매우 성공적으로 사용되었습니다. 우리의 최근 연구는 고품질 이미징 및 텍스처 분석이 중요한 활성층에서 토폴로지 결함의 역학을 살펴보았습니다19. 또한, 유동 세포 방법은 활성 유동(16 ) 및 활성 유동(31)의 결함을 포착하기 위한 기둥에 대한 오일 침수 미세구조의 효과를 조사하기 위해 사용되어 왔다. 이 방법은 연속 활성층의 형성에 매우 효과적이며 이미지 품질이 우수합니다. 그러나 최종 2D 활성층을 생성하는 데 사용되는 원심 분리 단계는 수행하기 어려울 수 있으며 플로우 셀은 누출 및 기포가 발생하기 쉽습니다. 반전 방법은 성공률이 높고 시공이 쉬우며 고해상도 3D 프린팅 마스터 몰드를 만들 수 있는 모든 기판 패턴 또는 형상에 사용할 수 있는 매우 유용한 대안입니다. 이 방법은 또한 우물을 채우는 것을 비교적 간단하게 만들기 때문에 활성 네마틱 역학에 대한 기하학적 감금의 효과를 보는 데 유용합니다.
이 논문에서는 미세소관과 키네신 모터에서 활성 네마틱을 형성하는 두 가지 방법과 재료를 웰에 가두는 기술에 대해 설명합니다. 제시된 시스템은 현재 문헌에서 활성 네마틱 단계의 가장 깨끗한 예를 나타내며 전 세계의 여러 그룹에 의해 재현되었습니다. 이 물질의 중요성은 구성 요소의 생물학적 기원뿐만 아니라 활성 주문 유체에서 완전히 새로운 방향을 열어주기 때문입니다. 이 시스템으로 작업하고 기본 특성을 설명함으로써 과학자들은 완전 합성 활성상의 설계로 이동할 수 있습니다.
능동 네마틱에 대한 감금의 영향에 초점을 맞춘 실험은 위상학적 감금 하에서 능동 흐름의 거동과 위상학적 결함 역학에 관한 근본적인 질문에 답할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에 제시된 방법은 미세 유체 공학 및 활성 혼합을 포함한 다양한 기하학적 중심 실험 및 분석의 수행에 도움이 될 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 관대 한 자금에 대해 국립 과학 재단 (NSF) 상 DMR-1808926을 인정하고자합니다. 이 프로젝트는 또한 NSF의 지원을 받아 과학 기술 연구 우수 센터: 캘리포니아 대학교 머시드의 세포 및 생체 분자 기계 센터(HRD-1547848)와 브랜다이스 생체 재료 시설 재료 연구 과학 및 엔지니어링 센터(DMR-2011486)를 통해 지원되었습니다. 주형을 3D 프린팅하는 데 도움을 주신 캘리포니아 대학교 머시드의 Bin Liu 박사와 거꾸로 된 실험 방법을 개발하는 동안 과학적 조언을 해주신 Jordi Ignes 박사에게 감사드립니다.
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |