Presentert her er metoder for fremstilling av aktiv nematikk fra mikrotubuli og kinesinmotorer, inkludert proteinpreparasjon og konstruksjon og bruk av brønner for aktiv nematisk inneslutning.
Dannelsen av biopolymerbaserte aktive faser har blitt en viktig teknikk for forskere som er interessert i å utforske det fremvoksende feltet av aktive flytende krystaller og deres mulige roller i cellebiologi. Disse nye systemene består av selvdrevne underenheter som forbruker energi lokalt, og produserer en dynamisk væske utenfor likevekt. For å danne den aktive flytende krystallfasen som er beskrevet i denne rapporten, kombineres rensede proteinkomponenter inkludert biopolymerer og molekylære motorer, og den aktive nematiske fasen dannes spontant i nærvær av adenosintrifosfat (ATP). For å observere nematisk tilstand må materialet begrenses i en egnet geometri for mikroskopi med høy nok tetthet. Denne artikkelen beskriver to forskjellige metoder for dannelse av en aktiv nematisk fase ved bruk av mikrotubuli og kinesinmotorer: montering av et todimensjonalt aktivt lag ved et olje- og vanngrensesnitt og montering under et oljelag ved hjelp av en elastomerisk brønn. Teknikker for å sette det aktive materialet inn i små brønner av forskjellige former er også beskrevet.
Aktive væsker består av energidrevne partikler eller elementer som trekker drivstoff fra sitt lokale miljø. Under de rette forholdene kan disse bevegelige aktive elementene virke kollektivt for å produsere fremvoksende væskedynamikk over lange lengdeskalaer. Det finnes en rekke eksempler på slik ut-av-likevektsfaseoppførsel i litteraturen, og aktive faser finnes over hele spekteret av levende systemer. Noen bemerkelsesverdige eksempler er kolonier av bakterier1, celleark2,3 og flokking eller sverming av organismer 4,5. Aktive faser har også blitt studert grundig i kondenserte faser av cytoskeletale filamenter, enten som en del av celle6 eller i syntetiske systemer designet for å gjøre bruk av biologisk ekstraherte komponenter 7,8,9. Flytende krystallinsk bestilling og dannelse av topologiske defekter i både naturlig forekommende og syntetiske systemer satt sammen av biologiske ekstrakter er av spesiell interesse for forskningsmiljøet. I de senere år har forskningsgrupper undersøkt slike systemer, deres grunnleggende fysiske egenskaper og deres relevans for biologi 2,3,10,11.
Dette papiret fokuserer på dannelsen av den aktive nematiske tilstanden fra en kombinasjon av mikrotubuli og kinesinmotoriske proteiner. Den tradisjonelle nematiske flytende krystallen er en likevektsfase av materie der de konstituerende molekylene utviser orienteringsrekkefølge. For eksempel kan en væske bestående av relativt stive stanglignende molekyler utvise både den nematiske fasen og, ved høyere temperaturer, en uorientert isotropisk væske fase12. Det første eksperimentelle eksemplet på en aktiv nematisk fase ble utviklet av Sanchez et al.13, og tilpasset et tidligere in vitro-eksperiment 14 der klynger av motorproteiner ble brukt til å produsere en skjærebevegelse mellom nærliggende mikrotubulibunter. Da dette mikrotubulisystemet var begrenset til et tynt lag, oppstod spontan nematisk rekkefølge. I de senere år har den aktive nematiske tilstanden blitt studert intensivt av flere eksperimentelle 15,16 og teoretiske 17,18 forskningsgrupper, med fokus på fenomener som aktiv turbulens – en tilstand der væsken produserer selvdrevne kaotiske strømmer 19 – og mobile topologiske defekter. Dette papiret beskriver metoder for å forberede og danne den aktive nematiske tilstanden fra mikrotubuli og kinesinmotorer i forskjellige eksperimentelle geometrier. Først beskrives prepareringsmetoder for de forskjellige komponentløsningene, etterfulgt av metoder for å danne den aktive nematikken ved hjelp av to forskjellige strømningskammergeometrier. Typiske bilderesultater vises. Til slutt beskrives metoder for å begrense den aktive nematikken i brønner og kanaler.
Det er noen få punkter gjennom protokollene der eksperimentøren kan gjøre noen viktige kontroller. Før du fyller en av enhetene med aktivt materiale, bør fluorescensmikroskopi (se figur 1) brukes til å kontrollere at mikrotubuli er polymerisert og ideelt ~ 2-3 μm i lengde. Hvis mikrotubuli ikke er synlige under mikroskopet, kan de ha depolymerisert og den aktive nematiske vil ikke danne seg. Fordi individuelle mikrotubuli er svært små, kan det være utfordrende å observere dem direkte gjennom mikroskopet. I denne studien ble et fluorescenskamera av høy kvalitet designet for utfordrende applikasjoner med lite lys brukt med tilhørende programvare for å verifisere filamentvekst. Signifikante fluorescerende aggregater bør ikke være tilstede på dette stadiet, da dette kan indikere depolymerisering eller tilstedeværelse av denaturert protein. Det er også en god ide å lage et enkelt mikroskoptestskred ved å kombinere mikrotubuli, MIX og ATP i samme forhold som beskrevet i protokollene. Aktiviteten bør begynne på å kombinere komponentene, og materialet skal se ut som det som er vist i figur 2C med bunter tilstede og merkbare filamentbevegelser som er synlige overalt.
Ved bruk av strømningscellemetoden er sentrifugetiden og orienteringen av strømningscellen viktig for dannelsen av et jevnt aktivt lag. Dette trinnet kan kreve litt finjustering avhengig av sentrifugetypen som brukes. Sentrifugering av strømningscellen med det aktive planet orientert vinkelrett på rotasjonsplanet gir de beste resultatene, da materialet kan skyves jevnt på væskegrensesnittet. Dobbeltsjekk at strømningscellen er nøye forseglet før sentrifugering.
Når du bruker den inverterte metoden for å produsere begrenset aktiv nematikk, er det flere trinn for å optimalisere. For det første er det viktig å bruke en 3D-utskriftsmetode som produserer strukturer med høy oppløsning. Ujevne sidevegger kan føre til at mikrotubuli fanger, noe som vil forstyrre strømmen. Brønnene bør ikke være for dype (150-200 μm dype brønner med et 2 mm tykt overliggende oljelag ble brukt i denne studien). Eksperimenter må kanskje justere disse parametrene litt ved prøving og feiling for å få det beste resultatet.
Strømningscellemetoden og den omvendte metoden har blitt brukt av forskjellige forfattere for å se på en rekke effekter som påvirker de aktive strømmene, inkludert forskjellige oljer12 og nedsenkede strukturer13. Valg av metode avhenger av det eksperimentelle målet. Ved hjelp av strømningscellemetoden er optisk avbildning fra over det aktive laget klarere enn for den inverterte metoden på grunn av de forskjellige overliggende væskene. I strømningscellemetoden utføres avbildning gjennom en glassdekselslipp og et tynt lag vann, mens den omvendte metoden er designet for å ha oljelaget på toppen. Dette betyr at et langdistansemål er nødvendig for den inverterte metoden, og bildekvaliteten reduseres. Bildekvalitetsforskjeller kan sees ved å sammenligne figur 2D (flytcellemetode) og figur 3 (invertert metode), og henholdsvis film 1 og film 2. Et lavere forstørrelsesobjektiv med lengre arbeidsavstand var nødvendig for figur 3 enn det som ble brukt for figur 2. Disse avbildningsulempene for den inverterte metoden kan unngås hvis et passende invertert mikroskop er tilgjengelig, kombinert med mål med passende arbeidsavstand for mikroskopets glideunderlag. Tynnere glass kan brukes som substrat for å tillate bruk av standard arbeidsavstandsmål.
Som en fordel tillater den inverterte geometrien bruk av et bredere spekter av oljeviskositeter, krever ikke nødvendigvis svingende bøtte sentrifugering (hvis dette ikke er tilgjengelig), og forberedelse av systemet er relativt enklere når formen er forberedt. For innesperring i brønner ved hjelp av den inverterte metoden kan imidlertid noe sentrifugering være viktig for å få materialet inn i et veldefinert 2D-lag.
Strømningscellemetoden har nylig blitt brukt svært vellykket i eksperimenter der et kontinuerlig aktivt lag er nødvendig. Vårt siste arbeid har sett på dynamikken i topologiske defekter i det aktive laget, hvor høykvalitets bildebehandling og teksturanalyse er viktig19. I tillegg har strømningscellemetoden blitt brukt til å undersøke effekten av oljesenkede mikrostrukturer på aktive strømmer16 og søyler for å fange defekter i de aktive strømmene31. Denne metoden fungerer veldig bra for dannelsen av et kontinuerlig aktivt lag, og bildekvaliteten er utmerket. Imidlertid kan sentrifugeringstrinnet som brukes til å produsere det endelige 2D-aktive laget være vanskelig å utføre, og strømningscellene er utsatt for lekkasjer og luftbobler. Den omvendte metoden er et veldig nyttig alternativ med høy suksessrate, er enkel å konstruere, og kan brukes til ethvert substratmønster eller geometri forutsatt at en høyoppløselig 3D-trykt hovedform kan opprettes. Denne metoden er også nyttig for å se på effekten av geometrisk inneslutning på aktiv nematisk dynamikk fordi den gjør fyllingsbrønner relativt enkle.
I dette papiret beskrives to måter å danne en aktiv nematikk fra mikrotubuli og kinesinmotorer, pluss en teknikk for å begrense materialene i brønner. Systemet som presenteres representerer det reneste eksempelet på en aktiv nematisk fase som for tiden er i litteraturen og har blitt reprodusert av flere grupper rundt om i verden. Betydningen av dette materialet ligger ikke bare i den biologiske opprinnelsen til komponentene, men også fordi den åpner en helt ny retning i aktive bestilte væsker. Ved å jobbe med dette systemet og belyse dets grunnleggende egenskaper, kan forskere bevege seg mot utformingen av helsyntetiske aktive faser.
Forsøkene fokusert på effekten av inneslutning på aktiv nematikk har potensial til å svare på grunnleggende spørsmål angående oppførselen til aktive strømmer og topologisk defektdynamikk under topologisk inneslutning. Metoden som presenteres her vil hjelpe til med utførelsen av en rekke geometrifokuserte eksperimenter og deres analyse, inkludert mikrofluidikk og aktiv blanding.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne National Science Foundation (NSF) prisen DMR-1808926 for sjenerøs finansiering. Prosjektet ble også støttet av NSF gjennom Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines ved University of California Merced (HRD-1547848) og Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vi vil gjerne takke Dr. Bin Liu ved University of California Merced for hjelp med 3D-utskrift av formen, og Dr. Jordi Ignes for vitenskapelig rådgivning under utviklingen av den omvendte eksperimentelle metoden.
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |