Här presenteras metoder för beredning av aktiv nematik från mikrotubuli och kinesinmotorer, inklusive proteinberedning och konstruktion och användning av brunnar för aktiv nematisk inneslutning.
Bildandet av biopolymerbaserade aktiva faser har blivit en viktig teknik för forskare som är intresserade av att utforska det framväxande fältet aktiva flytande kristaller och deras möjliga roller i cellbiologi. Dessa nya system består av självdrivna underenheter som förbrukar energi lokalt och producerar en dynamisk vätska utanför jämvikt. För att bilda den aktiva flytande kristallfasen som beskrivs i denna rapport kombineras renade proteinkomponenter inklusive biopolymerer och molekylära motorer, och den aktiva nematiska fasen bildas spontant i närvaro av adenosintrifosfat (ATP). För att observera det nematiska tillståndet måste materialet begränsas i en lämplig geometri för mikroskopi med tillräckligt hög densitet. Denna artikel beskriver två olika metoder för bildandet av en aktiv nematisk fas med användning av mikrotubuli och kinesinmotorer: montering av ett tvådimensionellt aktivt skikt vid ett olje- och vattengränssnitt och montering under ett oljeskikt med användning av en elastomerbrunn. Tekniker för att sätta in det aktiva materialet i små brunnar av olika former beskrivs också.
Aktiva vätskor består av energidrivna partiklar eller element som drar bränsle från sin lokala miljö. Under rätt förhållanden kan dessa rörliga aktiva element agera kollektivt för att producera framväxande vätskedynamik över långa längdskalor. Det finns en mängd olika exempel på sådant beteende utanför jämviktsfasen i litteraturen och aktiva faser finns över hela spektrumet av levande system. Några anmärkningsvärda exempel är kolonier av bakterier1, cellark2,3 och flockning eller svärmning av organismer 4,5. Aktiva faser har också studerats i stor utsträckning i kondenserade faser av cytoskelettfilament, antingen som en del av cell6 eller i syntetiska system utformade för att använda biologiskt extraherade komponenter 7,8,9. Flytande kristallin ordning och bildandet av topologiska defekter i både naturligt förekommande och syntetiska system sammansatta av biologiska extrakt är av särskilt intresse för forskarsamhället. Under de senaste åren har forskargrupper undersökt sådana system, deras grundläggande fysikaliska egenskaper och deras relevans för biologi 2,3,10,11.
Detta papper fokuserar på bildandet av det aktiva nematiska tillståndet från en kombination av mikrotubuli och kinesinmotorproteiner. Den traditionella nematiska flytande kristallen är en jämviktsfas av materia där de ingående molekylerna uppvisar orienteringsordning. Till exempel kan en vätska bestående av relativt styva stavliknande molekyler uppvisa både den nematiska fasen och, vid högre temperaturer, en oorienterad isotrop vätskefas12. Det första experimentella exemplet på en aktiv nematisk fas utvecklades av Sanchez et al.13 och anpassade ett tidigare in vitro-experiment 14 där kluster av motorproteiner användes för att producera en skjuvningsrörelse mellan angränsande mikrotubulibuntar. När detta mikrotubulisystem var begränsat till ett tunt skikt uppstod spontan nematisk ordning. Under de senaste åren har det aktiva nematiska tillståndet studerats intensivt av flera experimentella15,16 och teoretiska 17,18 forskargrupper, med fokus på fenomen som aktiv turbulens – ett tillstånd där vätskan producerar självdrivna kaotiska flöden 19 – och mobila topologiska defekter. Detta dokument beskriver metoder för att förbereda och bilda det aktiva nematiska tillståndet från mikrotubuli och kinesinmotorer i olika experimentella geometrier. Först beskrivs beredningsmetoder för de olika komponentlösningarna, följt av metoder för att bilda den aktiva nematiken med användning av två olika flödeskammargeometrier. Typiska bildresultat visas. Slutligen beskrivs metoder för att begränsa den aktiva nematiska i brunnar och kanaler.
Det finns några punkter i protokollen där experimenten kan göra några viktiga kontroller. Innan någon av enheterna fylls med aktivt material bör fluorescensmikroskopi (se figur 1) användas för att kontrollera att mikrotubuli är polymeriserade och helst ~ 2-3 μm långa. Om mikrotubuli inte är synliga under mikroskopet kan de ha depolymeriserats och den aktiva nematiska kommer inte att bildas. Eftersom enskilda mikrotubuli är mycket små kan det vara utmanande att observera dem direkt genom mikroskopet. I denna studie användes en högkvalitativ fluorescenskamera utformad för utmanande applikationer i svagt ljus med tillhörande programvara för att verifiera filamenttillväxt. Betydande fluorescerande aggregat bör inte vara närvarande vid detta tillfälle, eftersom detta kan indikera depolymerisation eller närvaron av denaturerat protein. Det är också en bra idé att göra ett enkelt mikroskoptestglas genom att kombinera mikrotubuli, MIX och ATP i samma förhållanden som beskrivs i protokollen. Aktiviteten bör börja med att kombinera komponenterna och materialet bör se ut som det som visas i figur 2C med buntar närvarande och märkbara glödtrådsrörelser synliga hela tiden.
Vid användning av flödescellmetoden är flödescellens centrifugtid och orientering viktiga för bildandet av ett enhetligt aktivt skikt. Detta steg kan kräva viss finjustering beroende på vilken centrifugtyp som används. Centrifugering av flödescellen med det aktiva planet orienterat vinkelrätt mot rotationsplanet ger de bästa resultaten eftersom material kan skjutas på vätskegränssnittet enhetligt. Dubbelkolla att flödescellen är försiktigt förseglad innan centrifugering.
När du använder den inverterade metoden för att producera begränsad aktiv nematik finns det flera steg att optimera. För det första är det viktigt att använda en 3D-utskriftsmetod som producerar högupplösta strukturer. Ojämna sidoväggar kan få mikrotubuli att fånga, vilket kommer att störa flödena. Brunnarna bör inte vara för djupa (150-200 μm djupa brunnar med ett 2 mm tjockt överliggande oljelager användes i denna studie). Experimenterare kan behöva justera dessa parametrar något genom försök och fel för att få bästa resultat.
Flödescellsmetoden och den inverterade metoden har använts av olika författare för att titta på en mängd olika effekter som påverkar de aktiva flödena, inklusive olika oljor12 och nedsänkta strukturer13. Valet av metod beror på det experimentella målet. Med hjälp av flödescellsmetoden är optisk avbildning ovanifrån det aktiva skiktet tydligare än för den inverterade metoden på grund av de olika överliggande vätskorna. I flödescellsmetoden utförs avbildning genom ett glasskydd och ett tunt lager vatten, medan den inverterade metoden är utformad för att ha oljeskiktet ovanpå. Detta innebär att ett långt arbetsdistansmål behövs för den inverterade metoden och bildkvaliteten minskar. Bildkvalitetsskillnader kan ses genom att jämföra figur 2D (flödescellsmetod) och figur 3 (inverterad metod) respektive film 1 och film 2. För figur 3 krävdes en objektiv med lägre förstoringsglas med längre arbetsavstånd än för figur 2. Dessa avbildningsnackdelar för den inverterade metoden kan undvikas om ett lämpligt inverterat mikroskop finns tillgängligt, kombinerat med mål med ett lämpligt arbetsavstånd för mikroskopets glidsubstrat. Tunnare glas kan användas som substrat för att möjliggöra användning av standardmål för arbetsavstånd.
Som en fördel möjliggör den inverterade geometrin användning av ett bredare spektrum av oljeviskositeter, kräver inte nödvändigtvis svängande skopcentrifugering (om detta inte är tillgängligt), och beredningen av systemet är relativt lättare när formen är beredd. För inneslutning i brunnar med den inverterade metoden kan dock viss centrifugering vara viktig för att få materialet i ett väldefinierat 2D-lager.
Flödescellsmetoden har nyligen använts mycket framgångsrikt i experiment där ett kontinuerligt aktivt skikt krävs. Vårt senaste arbete har tittat på dynamiken i topologiska defekter i det aktiva lagret, där högkvalitativ avbildning och texturanalys är viktig19. Dessutom har flödescellsmetoden använts för att undersöka effekterna av oljedränkta mikrostrukturer på aktiva flöden16 och pelare för att fånga defekter i de aktiva flödena31. Denna metod fungerar mycket bra för bildandet av ett kontinuerligt aktivt lager, och bildkvaliteten är utmärkt. Centrifugeringssteget som används för att producera det slutliga 2D-aktiva skiktet kan dock vara svårt att utföra, och flödescellerna är benägna att läcka och luftbubblor. Den inverterade metoden är ett mycket användbart alternativ med hög framgångsgrad, är lätt att konstruera och kan användas för alla substratmönster eller geometrier förutsatt att en högupplöst 3D-tryckt huvudform kan skapas. Denna metod är också användbar för att titta på effekterna av geometrisk inneslutning på aktiv nematisk dynamik eftersom det gör fyllningsbrunnar relativt enkla.
I detta papper beskrivs två sätt att bilda en aktiv nematik från mikrotubuli och kinesinmotorer, plus en teknik för att begränsa materialen i brunnar. Systemet som presenteras representerar det renaste exemplet på en aktiv nematisk fas som för närvarande finns i litteraturen och har reproducerats av flera grupper runt om i världen. Betydelsen av detta material ligger inte bara i det biologiska ursprunget till dess komponenter, utan också för att det öppnar en helt ny riktning i aktiva ordnade vätskor. Genom att arbeta med detta system och belysa dess grundläggande egenskaper kan forskare gå mot utformningen av helt syntetiska aktiva faser.
Experimenten fokuserade på effekterna av inneslutning på aktiv nematik har potential att svara på grundläggande frågor om beteendet hos aktiva flöden och topologisk defektdynamik under topologisk inneslutning. Metoden som presenteras här kommer att hjälpa till att utföra en mängd olika geometrifokuserade experiment och deras analys, inklusive mikrofluidik och aktiv blandning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uppmärksamma National Science Foundation (NSF) utmärkelse DMR-1808926 för generös finansiering. Projektet stöddes också av NSF genom Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines vid University of California Merced (HRD-1547848) och Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vi vill tacka Dr. Bin Liu vid University of California Merced för hjälp med 3D-utskrift av formen, och Dr. Jordi Ignes för vetenskaplig rådgivning under utvecklingen av den inverterade experimentella metoden.
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |