यह प्रोटोकॉल परिणामी न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया और न्यूरोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक जेब्राफिश लार्वा मॉडल में मस्तिष्क वेंट्रिकुलर क्षेत्र में लिपोपॉलेसेकेराइड के माइक्रोइंजेक्शन को प्रदर्शित करता है।
न्यूरोइन्फ्लेमेशन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। इसलिए, न्यूरोडीजेनेरेशन में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की भूमिका को समझने के लिए विवो न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल में अनुसंधान और विकल्प विकसित करना बहुत रुचि रखता है। इस अध्ययन में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन द्वारा मध्यस्थता वाले न्यूरोइन्फ्लेमेशन के एक लार्वा जेब्राफिश मॉडल को विकसित और मान्य किया गया था। ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश लाइनों elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP, और mpo: EGFP का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण के साथ एकीकृत प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग द्वारा मस्तिष्क न्यूरॉन व्यवहार्यता के वास्तविक समय की मात्रा का ठहराव करने के लिए किया गया था। जेब्राफिश लार्वा के लोकोमोटर व्यवहार को वीडियो-ट्रैकिंग रिकॉर्डर का उपयोग करके स्वचालित रूप से रिकॉर्ड किया गया था। नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) की सामग्री, और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) सहित भड़काऊ साइटोकिन्स के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर, और मानव ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (टीएनएफ -α) की जांच लार्वा जेब्राफिश सिर में एलपीएस-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए की गई थी। एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन के 24 घंटे बाद, जेब्राफिश लार्वा में न्यूरॉन्स का नुकसान और हरकत की कमी देखी गई। इसके अलावा, एलपीएस-प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन ने निषेचन (डीपीएफ) जेब्राफिश लार्वा के 6 दिनों के बाद के सिर में आईएल -6, आईएल -1, और टीएनएफ -α की कोई रिहाई और एमआरएनए अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं की, और इसके परिणामस्वरूप जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती हुई। इस अध्ययन में, 5 डीपीएफ पर 2.5-5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एलपीएस के साथ ज़ेब्राफिश का इंजेक्शन इस फार्माकोलॉजिकल न्यूरोइन्फ्लेमेशन परख के लिए इष्टतम स्थिति के रूप में निर्धारित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एक ज़ेब्राफिश लार्वा में एलपीएस-मध्यस्थता न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकल माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक नई, त्वरित और कुशल पद्धति प्रस्तुत करता है, जो न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है और विवो ड्रग स्क्रीनिंग परख में उच्च-थ्रूपुट के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
न्यूरोइन्फ्लेमेशन को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1 के कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में शामिल एक महत्वपूर्ण एंटी-न्यूरोजेनिक कारक के रूप में वर्णित किया गया है। पैथोलॉजिकल अपमान के बाद, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रतिकूल परिणाम हो सकते हैं, जिसमें न्यूरोजेनेसिस का निषेध और न्यूरोनल सेल मृत्यु 2,3 का प्रेरण शामिल है। सूजन प्रेरण की प्रतिक्रिया को अंतर्निहित प्रक्रिया में, कई भड़काऊ साइटोकिन्स (जैसे टीएनएफ-α, आईएल -1, और आईएल -6) बाह्य अंतरिक्ष में स्रावित होते हैं और न्यूरॉन मृत्यु और न्यूरोजेनेसिस 4,5,6 के दमन में महत्वपूर्णघटकों के रूप में कार्य करते हैं।
मस्तिष्क में सूजन मध्यस्थों (जैसे आईएल -1, एल-आर्जिनिन और एंडोटॉक्सिन) का माइक्रोइंजेक्शन न्यूरोनल सेल में कमी और न्यूरोइन्फ्लेमेशन 7,8,9 का कारण बन सकता है। लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस, चित्रा 1), ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की कोशिका भित्ति में मौजूद एक रोगजनक एंडोटॉक्सिन, न्यूरोइन्फ्लेमेशन को प्रेरित कर सकता है, न्यूरोडीजेनेरेशन को बढ़ा सकता है, और जानवरों में न्यूरोजेनेसिस को कम करसकता है। माउस मस्तिष्क के सीएनएस में सीधे एलपीएस इंजेक्शन ने नाइट्रिक ऑक्साइड, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और अन्य नियामकोंके स्तर में वृद्धि की। इसके अलावा, स्थानीय मस्तिष्क के वातावरण में एलपीएस का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन न्यूरोटॉक्सिक अणुओं के अत्यधिक उत्पादन को प्रेरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ न्यूरोनल फ़ंक्शन और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का बाद में विकास 10,12,13,14,15 हो सकता है। तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में, जीवित जीवों में सेलुलर और जैविक प्रक्रियाओं के लाइव और टाइम-कोर्स सूक्ष्म अवलोकन रोगजनन और औषधीय कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्रको समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी के माउस मॉडल की लाइव इमेजिंग मूल रूप से माइक्रोस्कोपी की सीमित ऑप्टिकल प्रवेश गहराई से बाधित है, जो कार्यात्मक इमेजिंग और विकास प्रक्रियाओं के लाइव अवलोकन को रोकती है 17,18,19। इसलिए, लाइव इमेजिंग द्वारा पैथोलॉजिकल विकास, और न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन के अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए वैकल्पिक न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल का विकास बहुत रुचि रखता है।
ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) अपने विकासात्मक रूप से संरक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली, ऑप्टिकल पारदर्शिता, बड़े भ्रूण क्लच आकार, आनुवंशिक पथीयता और विवो इमेजिंग 19,20,21,22,23 के लिए उपयुक्तता के कारण न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक मॉडल के रूप में उभरा है। . पिछले प्रोटोकॉल ने या तो यांत्रिक मूल्यांकन के बिना लार्वा ज़ेब्राफिश की जर्दी और हिंदब्रेन वेंट्रिकल में सीधे एलपीएस इंजेक्ट किया है, या घातक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 24,25,26,27 को प्रेरित करने के लिए मछली के पानी (कल्चर माध्यम) में एलपीएस जोड़ा है। यहां, हमने मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में एलपीएस के माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, ताकि निषेचन (डीपीएफ) ज़ेब्राफिश लार्वा के बाद 5 दिनों में एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या न्यूरोटॉक्सिसिटी को ट्रिगर किया जा सके। यह प्रतिक्रिया न्यूरोनल सेल हानि, लोकोमोटर व्यवहार घाटे, नाइट्राइट ऑक्साइड रिलीज में वृद्धि, भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता और इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती से स्पष्ट है।
महामारी विज्ञान और प्रयोगात्मक डेटा की बढ़ती मात्रा न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए संभावित जोखिम कारकों के रूप में पुरानी जीवाणु और वायरल संक्रमणको फंसाती है। संक्रमण भड़काऊ प्रक्रियाओं …
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को मकाओ एसएआर के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास कोष (एफडीसीटी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एफडीसीटी0058/2019/ए1 और 0016/2019/एकेपी, अनुसंधान समिति, मकाऊ विश्वविद्यालय (MYRG2020-00183-ICMS और CPG2022-00023-ICMS), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 81803398)।
Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Random primers | Takara | 3802 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |