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Neuroscience

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64313
Automatic Translation
1, 1,2
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Abstract

A neuroinflamação é um jogador-chave em vários distúrbios neurológicos, incluindo doenças neurodegenerativas. Portanto, é de grande interesse pesquisar e desenvolver modelos alternativos de neuroinflamação in vivo para entender o papel da neuroinflamação na neurodegeneração. Neste estudo, um modelo larval de peixe-zebra de neuroinflamação mediado por microinjeção ventricular de lipopolissacarídeo (LPS) para induzir uma resposta imune e neurotoxicidade foi desenvolvido e validado. As linhagens transgênicas de peixe-zebra elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP foram utilizadas para quantificação em tempo real da viabilidade dos neurônios cerebrais por imagem viva de fluorescência integrada com análise de intensidade de fluorescência. O comportamento locomotor das larvas de peixe-zebra foi registrado automaticamente por meio de um gravador de vídeo-rastreamento. O conteúdo de óxido nítrico (NO) e os níveis de expressão de mRNA de citocinas inflamatórias, incluindo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral humana α (TNF-α) foram investigados para avaliar a resposta imune induzida por LPS na cabeça larval de peixe-zebra. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral de LPS, foram observadas perda de neurônios e deficiência de locomoção em larvas de peixe-zebra. Além disso, a neuroinflamação induzida por LPS aumentou a liberação de NO e a expressão de mRNA de IL-6, IL-1β e TNF-α na cabeça de larvas de peixe-zebra após 6 dias de fertilização (dpf) e resultou no recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra. Neste estudo, a injeção de peixe-zebra com LPS a uma concentração de 2,5-5 mg/mL a 5 dpf foi determinada como a condição ideal para este ensaio de neuroinflamação farmacológica. Este protocolo apresenta uma metodologia nova, rápida e eficiente para a microinjeção de LPS no ventrículo cerebral para induzir neuroinflamação e neurotoxicidade mediadas por LPS em uma larva de peixe-zebra, que é útil para o estudo da neuroinflamação e também pode ser usada como um ensaio de triagem de drogas in vivo de alto rendimento.

Introduction

A neuroinflamação tem sido descrita como um fator antineurogênico crucial envolvido na patogênese de várias doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC)1. Após insultos patológicos, a neuroinflamação pode resultar em várias consequências adversas, incluindo inibição da neurogênese e indução da morte celular neuronal 2,3. No processo subjacente à resposta à indução da inflamação, múltiplas citocinas inflamatórias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) são secretadas no espaço extracelular e atuam como componentes cruciais na morte dos neurônios e na supressão da neurogênese 4,5,6.

A microinjeção de mediadores inflamatórios (como IL-1β, L-arginina e endotoxinas) no cérebro pode causar redução das células neuronais e neuroinflamação 7,8,9. O lipopolissacarídeo (LPS, Figura 1), endotoxina patogênica presente na parede celular de bactérias Gram-negativas, pode induzir neuroinflamação, exacerbar a neurodegeneração e reduzir a neurogênese em animais10. A injeção de LPS diretamente no SNC do cérebro de camundongos aumentou os níveis de óxido nítrico, citocinas pró-inflamatórias e outros reguladores11. Além disso, a injeção estereotáxica de LPS no ambiente cerebral local pode induzir a produção excessiva de moléculas neurotóxicas, resultando em comprometimento da função neuronal e subsequente desenvolvimento de doenças neurodegenerativas 10,12,13,14,15. No campo da neurociência, observações microscópicas ao vivo e em curso temporal de processos celulares e biológicos em organismos vivos são cruciais para a compreensão dos mecanismos subjacentes à patogênese e à ação farmacológica16. No entanto, a imagem ao vivo de modelos de neuroinflamação e neurotoxicidade em camundongos é fundamentalmente limitada pela profundidade limitada de penetração óptica da microscopia, o que impede a imagem funcional e a observação ao vivo dos processos de desenvolvimento17,18,19. Portanto, o desenvolvimento de modelos alternativos de neuroinflamação é de grande interesse para facilitar o estudo do desenvolvimento patológico e do mecanismo subjacente à neuroinflamação e neurodegeneração, por meio de imagens ao vivo.

O peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um modelo promissor para estudar a neuroinflamação e a neurodegeneração devido ao seu sistema imunológico inato evolutivamente conservado, transparência óptica, grande tamanho da embreagem embrionária, tratabilidade genética e adequação para imagens in vivo 19,20,21,22,23 . Protocolos prévios injetaram diretamente LPS na gema e no ventrículo rombencéfalo de larvas de peixe-zebra sem avaliação mecanicista, ou simplesmente adicionaram LPS à água de peixes (meio de cultura) para induzir uma resposta imune sistêmica letal24,25,26,27. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo para microinjeção de LPS nos ventrículos cerebrais, para desencadear uma resposta imune inata ou neurotoxicidade nos 5 dias pós-fertilização (dpf) larvas de peixe-zebra. Essa resposta é evidenciada pela perda de células neuronais, déficit de comportamento locomotor, aumento da liberação de óxido de nitrito, ativação da expressão gênica inflamatória e recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra 24 h após a injeção.

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Protocol

As linhagens AB de zebrafish do tipo selvagem e zebrafish transgênico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP foram obtidas do Instituto de Ciências Médicas Chinesas (ICMS). A aprovação ética (UMARE-030-2017) para as experiências com animais foi concedida pela Comissão de Ética em Investigação Animal da Universidade de Macau, e o protocolo segue as orientações institucionais de cuidados com os animais.

1. Embrião de peixe-zebra e criação larval

  1. Gerar embriões de peixe-zebra (200-300 embriões por acasalamento) por acasalamento natural em pares, conforme relatado anteriormente28.
  2. Preparar o estoque médio de água do ovo (E3) (60×) dissolvendo 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl 2·2H 2 O e 9,78 g de MgCl 2·6H 2 O em ddH 2 O para um volume final de 2 L e ajustar o pH para7,2 usando NaOH e HCl. Para preparar a concentração de trabalho do meio E3 (1×), diluir a calção 60 vezes em ddH2O. Armazenar a 28,5 °C quando não estiver a ser utilizado.
  3. Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir os embriões de peixe-zebra para um prato contendo meio E3. Criar os embriões a 28,5 °C numa incubadora e monitorizar o seu desenvolvimento e saúde. Remova embriões mortos e substitua o meio E3 impuro por um meio fresco diariamente.
  4. Para experimentos de imagem de peixe-zebra, use uma pipeta de transferência de plástico para coletar embriões de 0-2 h pós-fertilização (hpf) (cerca de 200 ovos) em aproximadamente 15 mL de 1× meio E3 contendo 0,003% de N-feniltioureia (PTU).
    NOTA: A PTU pode inibir a formação de melanóforos durante a embriogênese29. O tratamento de embriões com PTU durante a embriogênese pode melhorar a detecção de sinais em microscopia ou expressão de fluorescência30.
  5. Manter os embriões de peixe-zebra nas condições acima até que os embriões atinjam o estágio larval de desenvolvimento desejado.

2. Preparação para microinjeção

  1. Preparar para a injeção puxando capilares de vidro usando um extrator de micropipeta (ver Tabela de Materiais), seguindo o protocolo de cinco etapas para puxar tubos capilares de vidro (Tabela 1).
  2. Abra a ponta da agulha (capilares de vidro de parede fina [3,5 pol] com filamento, OD 1,14 mm) para o tamanho apropriado em um ângulo usando fórceps (Figura 2A).
  3. Encha a agulha com 0,1 mL de óleo mineral para garantir que não haja bolhas.
  4. Remova a tampa de rosca da agulha de aço do aparelho de microinjeção. Alinhe o orifício da agulha de vidro com a agulha de aço e, em seguida, aperte a tampa de rosca. Monte o aparelho de microinjeção de agulha carregado num micromanipulador (ver Tabela de Materiais).
  5. Ajustar a posição do aparelho de microinjecção de modo a que o micromanipulador possa mover de forma flexível o aparelho ao microscópio. Descarregue um certo volume de óleo de parafina para fazer com que a agulha de aço entre no tubo de vidro capilar.
  6. Solte a solução injetável (como 1× PBS ou 5 mg/mL LPS) em uma lâmina de vidro esterilizada com etanol a 70% e ajuste o aparelho de microinjeção para que a ponta seja inserida na gota líquida. Carregue ~2 μL de solução injetável na agulha.
  7. Configure o micromanipulador (ajustes finos de cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) de modo que a ponta da agulha do aparelho de microinjeção esteja no mesmo campo de visão que as larvas em alta ampliação (Figura 2B).

3. Montagem de peixe-zebra para microinjeções

NOTA: O desenvolvimento do cérebro do peixe-zebra ocorre dentro de 3 dpf e amadurece a 5 dpf com um sistema nervoso central bem desenvolvido31,32. Portanto, as larvas de 5 dpf já são adequadas para estudar o dano neuronal mediado por LPS, bem como as respostas comportamentais e inflamatórias.

  1. Injete as larvas de peixe-zebra dentro de aproximadamente 30 minutos de atingir o estágio de interesse, para manter a consistência do tempo de injeção.
  2. Para anestesiar as larvas de peixe-zebra, combine tricaine com água limpa do tanque de peixes (concentração final de 0,02% p/v de tricaína).
  3. Derreter uma solução de agarose a 2% em ddH2O utilizando um micro-ondas. Despeje a agarose derretida em um prato de plástico. O prato de plástico revestido de acarose a 2% pode ser armazenado a 4 °C por até 2 semanas.
  4. Use uma pipeta de transferência de plástico para transportar larvas anestesiadas para o centro do prato de plástico revestido de acarose a 2%. Oriente as larvas montadas com o lado do cérebro para cima para o acesso da agulha.

4. Injetar o ventrículo cerebral

  1. Ajustar a ampliação do microscópio para que a estrutura ventricular cerebral do peixe-zebra seja claramente exibida no campo de visão (Figura 2B).
  2. Coloque a agulha cuidadosamente acima do tecto cerebral (Figura 2C).
  3. Perfure a pele do cérebro do peixe-zebra com a ponta da agulha lentamente usando o micromanipulador.
  4. Pressione o pedal para ejetar 1 nL de 1x PBS ou diferentes concentrações de LPS (1,0, 2,5 e 5,0 mg/mL) (consulte Tabela de Materiais). Imagens bem-sucedidas de injeção de ventrículo nas quais o ventrículo cerebral foi injetado com 1 nL de corante azul de Evans a 1% (diluído em PBS) são mostradas como exemplo (Figura 2D). Transfira as larvas para limpar o meio E3 imediatamente após a injeção. Após 24 h, coletar as larvas para imagens microscópicas, ensaio comportamental locomotor e determinação de outros indicadores.

5. Imagens

  1. Prepare uma solução de agarose de baixa fusão a 1,5% em meio E3 e aqueça-a em um micro-ondas para formar um líquido claro.
  2. Use uma pipeta de transferência de plástico limpa para transportar as larvas para uma lâmina de vidro e remova o máximo de água possível.
  3. Use uma pipeta de transferência de plástico para adicionar uma gota de agarose de baixo derretimento de 1,5% às larvas.
    NOTA: Arrefecer a agarose de baixa fusão na pipeta durante algum tempo antes de adicionar de modo a não ferir as larvas.
  4. Use uma agulha de seringa de 1 mL para orientar as larvas. Espere até que a agarose esfrie e solidifique antes de iniciar a imagem.
  5. Observe e fotografe a região do neurônio em todo o cérebro do peixe-zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e Tg(elavl3:mCherry), bem como o recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra Tg(mpo:EGFP) sob um microscópio estéreo de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: As configurações do microscópio de fluorescência usadas para imagens são mostradas abaixo. Tg (ETvmat2: EGFP) cérebro de peixe-zebra (comprimento de onda de excitação: 450-490 nm, comprimento de onda de emissão: 500-550 nm, ampliação visual: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cérebro de peixe-zebra (comprimento de onda de excitação: 541-551 nm, comprimento de onda de emissão: 590 nm, ampliação visual: 100x); Tg (mpo: EFGP) cérebro de peixe-zebra (comprimento de onda de excitação: 450-490 nm, comprimento de onda de emissão: 500-550 nm, ampliação visual: 63x).
  6. Meça e analise a intensidade e o comprimento da fluorescência da região do neurônio Ra no peixe-zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e a intensidade de fluorescência dos neurônios cerebrais do peixe-zebra Tg(elavl3:mCherry) usando o software ImageJ. Conte manualmente os neutrófilos na região do cérebro do peixe-zebra Tg(mpo:EFGP).

6. Determinação dos marcadores de expressão gênica

  1. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral LPS, prossiga com a determinação dos marcadores de expressão gênica. Para fazer isso, anestesiar larvas de peixe-zebra com tricaína a 0,02% (conforme mencionado na etapa 3.2).
  2. Utilizar duas seringas de 1 mL para separar as porções da cabeça das larvas (40 larvas por grupo) sem as regiões do olho e do saco vitelino (Figura 2E).
  3. Extraia o RNA das porções da cabeça larval.
    1. Para a extração de ARN, homogeneizar a porção da cabeça com 200 μL de reagente de extração de ARN (ver Tabela de Materiais) utilizando um moedor de tecidos (ver Tabela de Materiais) a uma velocidade de rotação de 11.000 rpm durante 5 s.
    2. Realizar a extração de RNA usando o método clorofórmio-isopropanol. Para fazer isso, adicione 40 μL de clorofórmio, agite os tubos vigorosamente e incube-os à temperatura ambiente por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    3. Transfira a fase aquosa para um tubo fresco (cerca de 100 μL) e adicione 100 μL de isopropanol. Incubar durante 10 min e, em seguida, centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Remova o sobrenadante.
    4. Adicione 200 μL de etanol a 75% para lavar o pellet de RNA. Vórtice brevemente as amostras e, em seguida, centrifugar a 7500 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e lave o pellet de RNA novamente.
    5. Seque ao ar o pellet de RNA por 5-10 min, em seguida, adicione 30 μL de água livre de RNase para dissolver o pellet de RNA. Verificar a pureza (razão de absorvância a 260 nm e 280 nm) e a integridade do RNA usando um espectrofotômetro de microvolume (ver Tabela de Materiais).
  4. Sintetizar cDNA a partir do RNA extraído na etapa 6.3, usando transcriptase reversa com primers aleatórios (ver Tabela de Materiais).
    1. Adicione 1 μL de primers aleatórios, 1 μL de dNTPs, 1 μg de RNA e água destilada (volume total de 12 μL) a um tubo livre de nuclease. Aqueça a mistura a 65 °C durante 5 min e arrefeça rapidamente no gelo.
    2. Adicione 1 μL de TDT 0,1 M, 1 μL de inibidor de RNase, 4 μL de tampão de primeira fita 5× e 1 μL de transcriptase reversa M-MLV (volume total: 20 μL) ao tubo. Misturar suavemente e incubar o tubo a 25 °C durante 2 min, seguido de 42 °C durante 50 min. Inicie a reacção aquecendo a 70 °C durante 15 min.
  5. Execute PCR em tempo real em um sistema de qPCR (consulte Tabela de Materiais) usando um kit RT-qPCR comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais) para determinar a expressão dos genes-alvo (IL-1β, IL-6 e TNF-α). A mistura de reação (20 μL) continha 10 μL de verde SYBR, 0,4 μL de corante de referência ROX, 0,8 μL cada um dos primers dianteiro e reverso, 6 μL de ddH 2 O e2μL de cDNA molde (1 μg). Realizar amplificação por PCR nas condições: 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 34 s, e com um estágio de dissociação de 95 °C por 15 s, 60 °C por 60 s e 95 °C por 15 s.
  6. Normalizar os níveis de mRNA dos genes-alvo para o de um gene de limpeza, fator de alongamento 1 α (Ef1α). Calcular os níveis de expressão para cada gene alvo pelo método 2−ΔΔCT33. As sequências de iniciadores de cada gene estão descritas na Tabela 2.
  7. Para a determinação do óxido nítrico, homogeneizar a porção da cabeça (obtida na etapa 6.2) em 100 μL de PBS frio utilizando um moedor de tecido. Centrifugar o PBS resultante e a suspensão da porção da cabeça a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recolha os lisados e efectue o ensaio de concentração de nitrito34 utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).

7. Ensaio comportamental da locomotiva peixe-zebra

  1. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral LPS, transfira as larvas de peixe-zebra para os poços de uma microplaca quadrada de 96 poços individualmente. Adicionar 300 μL de meio E3 a cada poço e, em seguida, incubar as larvas por 4 h para se aclimatar à placa de teste.
  2. Transfira a microplaca carregada de larvas para a caixa de rastreamento de peixe-zebra (consulte Tabela de Materiais). Ligue a fonte de luz e, em seguida, incube as larvas na caixa de teste por 30 minutos para aclimatar o ambiente.
  3. Monitore e registre o comportamento do peixe-zebra usando um sistema automatizado de rastreamento de vídeo. Registre 12 sessões (5 min cada, total de 1 h) para cada peixe-zebra. Defina a distância total (consiste em distâncias inativas, pequenas e grandes) como a distância (em mm) que cada peixe se moveu durante um período de rastreamento de 60 minutos.

8. Análise estatística

  1. Realizar análises estatísticas usando um software de análise padrão (consulte Tabela de Materiais).
  2. Realizar análise estatística das diferenças entre dois grupos usando ANOVA unidirecional comum. Calcule o coeficiente de correlação de Pearson para avaliar a força das correlações. P < 0,05 foi considerado significativo em todas as análises.

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Representative Results

O fluxo de trabalho descrito aqui apresenta uma metodologia nova, rápida e eficiente para induzir neuroinflamação e neurotoxicidade mediadas por LPS em larvas de peixe-zebra. Neste protocolo descrito, 5 peixes-zebra dpf foram injetados com LPS (Figura 1) nos ventrículos cerebrais utilizando um microinjetor (Figura 2A-C). A injeção bem-sucedida no local do ventrículo cerebral foi verificada usando a coloração azul de Evans a 1% (Figura 2D). A cabeça do peixe-zebra foi separada de seus olhos e corpo usando seringas (Figura 2E) para excluir qualquer influência da expressão de citocinas inflamatórias e liberação de óxido nítrico no corpo do peixe-zebra na determinação da neuroinflamação e neurotoxicidade no cérebro.

O mesmo volume de PBS (como LPS) foi injetado na área ventricular cerebral do peixe-zebra como um controle operado por simulação. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos controle e simulado operados nos neurônios, em particular do grupo anterior de núcleos da rafe (Ra) (Figura 3A-C), densidade integrada de fluorescência dos neurônios cerebrais (Figura 3D,E), a distância total de movimento do peixe-zebra (Figura 4A,B), produção de NO e expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (Figura 4A-D) e recrutamento de neutrófilos para o cérebro larval do peixe-zebra (Figura 6A,B). Estes resultados demonstraram que a microinjeção adequada não causa qualquer neurotoxicidade e neuroinflamação no peixe-zebra.

Após tratamento por 24 h, a injeção ventricular cerebral de LPS induziu neurotoxicidade em peixe-zebra. O LPS (1-5 mg/mL) induziu uma perda significativa de neurônios Ra no cérebro do peixe-zebra larval Tg(ETvmat2:GFP) em comparação com os grupos controle e sham (Figura 3A-C). A linha transgênica elav13:mCherry zebrafish delineia as células neuronais com a proteína fluorescente vermelha nuclear35. Como mostrado na Figura 3D,E, 2,5-5 mg/mL de LPS levaram a mudanças significativas na densidade integrada de fluorescência dos neurônios cerebrais nesta linhagem larval de peixe-zebra. No entanto, o grupo de injeção de LPS de 1 mg/mL não mostrou efeito sobre a densidade integrada de fluorescência dos neurônios cerebrais em comparação com os grupos controle e simulação. Além disso, o LPS de 5 mg/mL induziu uma deficiência de locomoção (Figura 4A) e diminuiu a distância total de movimento do peixe-zebra durante um período de rastreamento de 60 minutos (Figura 4B). Os resultados demonstraram que 1-2,5 mg/mL de LPS poderia induzir a perda de neurônios, mas nenhuma deficiência significativa de locomoção.

Além disso, a injeção ventricular cerebral de LPS também pode ativar a resposta inflamatória no cérebro do peixe-zebra. A produção de NO (Figura 5A) e a expressão de RNAm de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (Figura 5B-D) na cabeça de larvas de peixe-zebra foram aumentadas no tratamento com LPS de 2,5-5 mg/mL em comparação com a expressão nos grupos controle e sham. Após injeção de LPS de 1-5 mg/mL, observou-se o recrutamento de neutrófilos para o cérebro larval do peixe-zebra (Figura 6A), resultando em um aumento significativo no número de neutrófilos na região cerebral do peixe-zebra Tg(mpo:EGFP) (Figura 6B).

Passo Tempo de funcionamento (seg) Nível de calor Ação
T1 L> H80-89 P1L005
T2 1.6-3 H00
T3 L> H00 P2L001c
T4 3 H00 FRESCO
T5 0 H00

Tabela 1: Protocolo de cinco etapas para a tração do tubo capilar de vidro.

Nome da cartilha Seqüenciar
IL-1β para a frente 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3'
IL-1β reverso 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3'
IL-6 para a frente 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3'
IL-6 reverso 5'-TCTTTCCCTCTTTTTTCCTCCTG-3'
TNF-α para a frente 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3'
TNF-α reverso 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3'
Ef1α para a frente 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3'
Ef1α reverso 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3'

Tabela 2: Primers utilizados em tempo real qPCR.

Figure 1
Figura 1: Estrutura geral do lipopolissacarídeo (LPS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuração da microinjeção, postura corporal e posição do peixe-zebra e separação da porção da cabeça. (A) Seleção da agulha de vidro: use uma pinça para cortar a ponta de uma agulha pré-puxada sob o microscópio, para obter uma agulha com uma abertura semelhante à mostrada na figura. (B) Ajuste a distância focal do microscópio para que a área ventricular cerebral das larvas de peixe-zebra possa ser observada em alta ampliação (delineada em preto). Círculos azuis claros indicam o local de injeção. (C) As larvas montadas precisam ser orientadas com o lado do cérebro para cima para o acesso da agulha (tecto cerebral indicado por círculo vermelho). (D) Demonstração de injeção ventricular bem-sucedida com azul de Evans no cérebro de larvas de peixe-zebra. (E) Porção da cabeça do peixe-zebra sem as regiões do olho e do saco vitelino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Injeção ventricular cerebral de neurônios LPS ablate após 24 h em larvas de peixe-zebra. (A) (Top) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de vmat2:GFP zebrafish após tratamento com diferentes concentrações de LPS (bráquetes vermelhos indicam neurônios de núcleos de rafe [Ra]; barra de escala = 265,2 μm). (Abaixo) A região neuronal Ra foi ampliada para melhorar a visualização morfológica. (B,C) Intensidade média de fluorescência e comprimento da região do neurônio Ra em larvas de peixe-zebra vmat2:GFP. (D,E) Morfologia representativa (barra de escala = 265,2 μm) e intensidade média de fluorescência dos neurônios cerebrais do peixe-zebra Tg(elavl3:mCherry). Os dados são expressos como uma porcentagem do grupo controle. *P < 0,05 e **P < 0,01 versus grupo controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A injeção ventricular cerebral de LPS induz deficiência de locomoção após 24 h em larvas de peixe-zebra. (A) Padrões representativos de traços de locomoção de peixe-zebra. No mapa de rastreamento digital, o movimento de alta velocidade é representado por linhas vermelhas (> 6,6 mm/s); o movimento de média velocidade é representado por linhas verdes (3,3 a 6,6 mm/s); o movimento de baixa velocidade é representado por linhas pretas (< 3,3 mm/s). (B) Análise quantitativa da distância total média percorrida pelo peixe-zebra em 60 min. *P < 0,05 versus grupo controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: A injeção ventricular cerebral de LPS aumenta os mediadores pró-inflamatórios. (A) Os níveis de óxido nítrico foram medidos usando o reagente de Griess. (B-D) Os níveis de expressão gênica de interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) na cabeça do peixe-zebra foram investigados por qPCR. *P < 0,05 e **P < 0,01 versus grupo controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A microinjeção ventricular cerebral LPS leva ao recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra após 24 h. (A) Migração de neutrófilos (área dentro do círculo vermelho) para a cabeça das larvas após injeção ventricular cerebral LPS (barra de escala = 851,1 μm). (B) O número de neutrófilos em cabeças de larvas após injeção ventricular cerebral de LPS. *P < 0,05 e **P < 0,01 versus grupo controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Dados brutos Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Uma quantidade crescente de dados epidemiológicos e experimentais implica infecções bacterianas e virais crônicas como possíveis fatores de risco para doenças neurodegenerativas36. A infecção desencadeia a ativação de processos inflamatórios e respostas imunes do hospedeiro37. Mesmo que a resposta atue como um mecanismo de defesa, a inflamação superativada é prejudicial à neurogênese, e o ambiente inflamatório não permite a sobrevivência dos neurônios recém-nascidos38. Como resultado, causa danos às funções neuronais do hospedeiro e viabilidade. Estudos indicam que a inflamação desempenha um papel significativo na fisiopatologia da neurodegeneração39.

Como uma endotoxina patogênica frequentemente estudada, a LPS tem sido implicada na inibição da neurogênese e da neurodegeneração. A ativação do LPS de processos inflamatórios prejudica significativamente a neurogênese, parcialmente através da produção de NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β40. Um crescente corpo de evidências demonstra que o LPS causa déficits de comportamento e perda neuronal, e influencia a progressão da neurogênese quando injetado centralmente em modelos neurodegenerativos de roedores10,38. Modelos de peixe-zebra têm sido amplamente utilizados como modelos experimentais alternativos para estudar respostas imunes41 e rastrear novos anti-inflamatórios. Os sistemas imunológicos inato e adaptativo do peixe-zebra são semelhantes aos dos mamíferos42. Além disso, alguns estudos identificaram várias citocinas e receptores inflamatórios presentes em mamíferos no peixe-zebra do SNC43. Estudos anteriores sugerem que a imersão de embriões/larvas de peixe-zebra em LPS ou a injeção de LPS na gema de larvas de peixe-zebra pode induzir a resposta imune e aumentar os fatores pró-inflamatórios associados à inflamação44,45. No entanto, o efeito específico do LPS no tecido nervoso do peixe-zebra e na indução da neuroinflamação ainda não é conhecido.

Embora os modelos de roedores tenham muitas vantagens sobre outros modelos animais, suas limitações em termos de imagens in vivo em tempo real e triagem de medicamentos são óbvias. A imagem in vivo é amplamente utilizada para investigar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso e as alterações cerebrais patológicas como uma ferramenta poderosa e não invasiva46,47. Devido à transparência óptica de embriões e larvas de peixe-zebra, eles são adequados para experimentos de imagem ao vivo de observação cerebral48,49. Em particular, o pequeno tamanho do peixe-zebra e sua capacidade de produzir milhares de embriões significam que a triagem de drogas de alto rendimento pode ser realizada usando embriões ou larvas de peixe-zebra50,51. Além disso, com o desenvolvimento da ciência e da tecnologia, as microinjeções robóticas podem ser administradas de forma precisa e eficaz, podendo ser utilizadas para injetar grandes quantidades de embriões ou larvas52,53. A aplicação do sistema de injeção microrrobótica à pesquisa neuronal, para injeção oportuna de materiais em um grande número de embriões ou larvas, facilitará a triagem em larga escala de biomoléculas e compostos de drogas.

Neste estudo, o peixe-zebra a 5 dpf foi injetado com LPS na concentração de 2,5-5 mg/mL; esta foi determinada como a condição ideal para o desenvolvimento do modelo de neuroinflamação. Até onde sabemos, essa metodologia não foi descrita na literatura. Consequentemente, a microinjeção ventricular cerebral de LPS em larvas de peixe-zebra foi capaz de causar perda de neurônios e deficiência de locomoção. Além disso, nossos resultados demonstraram que a neuroinflamação induzida por LPS aumenta os níveis de mediadores pró-inflamatórios, como NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β, e leva ao recrutamento de neutrófilos no cérebro larval do peixe-zebra em 24 h após a injeção. Em outros modelos animais, a injeção de LPS também pode promover o desenvolvimento de inflamação e causar alterações neuropatológicas no cérebro13,54. Os resultados deste estudo aprofundam nossa compreensão das vias neuroinflamatórias. Neste método, deve-se notar que a abertura de agulhas para microinjeção não deve ser muito grande para evitar danos cerebrais causados por operação mecânica, e uma quantidade razoável de força deve ser aplicada para evitar danificar as larvas. Além disso, é importante separar a cabeça dos olhos e do corpo do peixe-zebra para a determinação de fatores inflamatórios e óxido nítrico, pois isso ajudará a obter resultados direcionais que reflitam especificamente a neuroinflamação induzida pela injeção ventricular cerebral LPS.

Uma ligeira desvantagem deste método é que, devido ao pequeno tamanho das larvas de peixe-zebra, as quantidades de biomoléculas, como o mRNA total obtido por homogeneização e extração, são menores do que as do modelo de camundongo. No entanto, o peixe-zebra é capaz de desovar com frequência com várias centenas de ovos a cada semana. Aumentar o número de larvas de peixe-zebra usadas em cada grupo pode fornecer quantidades suficientes de biomoléculas extraídas para diferentes ensaios bioquímicos. Em conclusão, este método induz neurotoxicidade e uma resposta imune no cérebro larval do peixe-zebra. Devido à transparência do peixe-zebra, as mudanças no cérebro do peixe-zebra vivo da larva podem ser melhor compreendidas por meio de imagens in vivo. A técnica aqui descrita é uma excelente ferramenta para avaliar de forma rápida e eficiente possíveis anti-neuroinflamatórios.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por subvenções do Fundo de Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia (FDCT) da RAEM (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comissão de Investigação da Universidade de Macau (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (n.º 81803398).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

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Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade
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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

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