Summary

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Published: August 23, 2022
doi:

Summary

Questo protocollo dimostra la microiniezione di lipopolisaccaride nella regione ventricolare del cervello in un modello larvale di zebrafish per studiare la risposta neuroinfiammatoria risultante e la neurotossicità.

Abstract

La neuroinfiammazione è un attore chiave in vari disturbi neurologici, comprese le malattie neurodegenerative. Pertanto, è di grande interesse ricercare e sviluppare modelli alternativi di neuroinfiammazione in vivo per comprendere il ruolo della neuroinfiammazione nella neurodegenerazione. In questo studio, è stato sviluppato e convalidato un modello larvale di zebrafish di neuroinfiammazione mediata da microiniezione ventricolare di lipopolisaccaride (LPS) per indurre una risposta immunitaria e neurotossicità. Le linee transgeniche di zebrafish elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state utilizzate per la quantificazione in tempo reale della vitalità dei neuroni cerebrali mediante imaging live a fluorescenza integrato con l’analisi dell’intensità di fluorescenza. Il comportamento locomotore delle larve di zebrafish è stato registrato automaticamente utilizzando un registratore di tracciamento video. Il contenuto di ossido nitrico (NO) e i livelli di espressione dell’mRNA delle citochine infiammatorie tra cui l’interleuchina-6 (IL-6), l’interleuchina-1β (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale umano α (TNF-α) sono stati studiati per valutare la risposta immunitaria indotta da LPS nella testa larvale del pesce zebra. A 24 ore dopo l’iniezione ventricolare cerebrale di LPS, sono stati osservati perdita di neuroni e deficit di locomozione nelle larve di zebrafish. Inoltre, la neuroinfiammazione indotta da LPS ha aumentato il rilascio di NO e l’espressione di mRNA di IL-6, IL-1β e TNF-α nella testa delle larve di zebrafish 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) e ha portato al reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra. In questo studio, l’iniezione di zebrafish con LPS ad una concentrazione di 2,5-5 mg/ml a 5 dpf è stata determinata come condizione ottimale per questo test farmacologico di neuroinfiammazione. Questo protocollo presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per la microiniezione di LPS nel ventricolo cerebrale per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS in una larva di zebrafish, che è utile per studiare la neuroinfiammazione e potrebbe anche essere utilizzata come test di screening farmacologico in vivo ad alto rendimento.

Introduction

La neuroinfiammazione è stata descritta come un fattore antineurogeno cruciale coinvolto nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC)1. A seguito di insulti patologici, la neuroinfiammazione può provocare varie conseguenze avverse, tra cui l’inibizione della neurogenesi e l’induzione della morte delle cellule neuronali 2,3. Nel processo alla base della risposta all’induzione dell’infiammazione, citochine infiammatorie multiple (come TNF-α, IL-1β e IL-6) sono secrete nello spazio extracellulare e agiscono come componenti cruciali nella morte neuronale e nella soppressione della neurogenesi 4,5,6.

La microiniezione di mediatori dell’infiammazione (come IL-1β, L-arginina ed endotossine) nel cervello può causare riduzione delle cellule neuronali e neuroinfiammazione 7,8,9. Il lipopolisaccaride (LPS, Figura 1), un’endotossina patogena presente nella parete cellulare dei batteri Gram-negativi, può indurre neuroinfiammazione, esacerbare la neurodegenerazione e ridurre la neurogenesi negli animali10. L’iniezione di LPS direttamente nel SNC del cervello del topo ha aumentato i livelli di ossido nitrico, citochine pro-infiammatorie e altri regolatori11. Inoltre, l’iniezione stereotassica di LPS nell’ambiente cerebrale locale può indurre un’eccessiva produzione di molecole neurotossiche, con conseguente compromissione della funzione neuronale e successivo sviluppo di malattie neurodegenerative 10,12,13,14,15. Nel campo delle neuroscienze, le osservazioni microscopiche dal vivo e nel tempo dei processi cellulari e biologici negli organismi viventi sono cruciali per comprendere i meccanismi alla base della patogenesi e dell’azione farmacologica16. Tuttavia, l’imaging dal vivo di modelli murini di neuroinfiammazione e neurotossicità è fondamentalmente limitato dalla limitata profondità di penetrazione ottica della microscopia, che preclude l’imaging funzionale e l’osservazione dal vivo dei processi di sviluppo17,18,19. Pertanto, lo sviluppo di modelli alternativi di neuroinfiammazione è di grande interesse per facilitare lo studio dello sviluppo patologico e del meccanismo alla base della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione, mediante live imaging.

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello promettente per studiare la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione grazie al suo sistema immunitario innato evolutivamente conservato, alla trasparenza ottica, alle grandi dimensioni della frizione embrionale, alla trattabilità genetica e all’idoneità per l’imaging in vivo 19,20,21,22,23 . I protocolli precedenti hanno iniettato direttamente LPS nel tuorlo e nel ventricolo posteriore del pesce zebra larvale senza valutazione meccanicistica, o semplicemente aggiunto LPS all’acqua del pesce (terreno di coltura) per indurre una risposta immunitaria sistemica letale24,25,26,27. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per la microiniezione di LPS nei ventricoli cerebrali, per innescare una risposta immunitaria innata o neurotossicità nelle larve di zebrafish 5 giorni dopo la fecondazione (DPF). Questa risposta è evidenziata dalla perdita di cellule neuronali, dal deficit del comportamento locomotore, dall’aumento del rilascio di ossido di nitrito, dall’attivazione dell’espressione genica infiammatoria e dal reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra a 24 ore dopo l’iniezione.

Protocol

Le linee di zebrafish selvatico AB e zebrafish transgenico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state ottenute dall’Istituto di scienze mediche cinesi (ICMS). L’approvazione etica (UMARE-030-2017) per gli esperimenti sugli animali è stata concessa dal Comitato etico per la ricerca sugli animali, Università di Macao, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali. 1. Embrioni di zebrafish e allevamento larvale Generare embrioni d…

Representative Results

Il flusso di lavoro qui descritto presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS nelle larve di zebrafish. In questo protocollo descritto, 5 dpf zebrafish sono stati iniettati con LPS (Figura 1) nei ventricoli cerebrali utilizzando un microiniettore (Figura 2A-C). L’iniezione riuscita nel sito del ventricolo cerebrale è stata verificata utilizzando la coloraz…

Discussion

Una quantità crescente di dati epidemiologici e sperimentali implica infezioni batteriche e virali croniche come possibili fattori di rischio per le malattie neurodegenerative36. L’infezione innesca l’attivazione dei processi infiammatori e delle risposte immunitarie dell’ospite37. Anche se la risposta agisce come meccanismo di difesa, l’infiammazione iperattivata è dannosa per la neurogenesi e l’ambiente infiammatorio non consente la sopravvivenza dei neuroni neonatali<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Science and Technology Development Fund (FDCT) di Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comitato di ricerca, Università di Macao (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e National Natural Science Foundation of China (n. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

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Cite This Article
He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

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