Summary
Этот протокол демонстрирует микроинъекцию липополисахарида в желудочковую область мозга в модели личинок рыбок данио для изучения результирующей нейровоспалительной реакции и нейротоксичности.
Abstract
Нейровоспаление является ключевым игроком в различных неврологических расстройствах, включая нейродегенеративные заболевания. Поэтому большой интерес представляют исследования и разработка альтернативных моделей нейрововоспаления in vivo для понимания роли нейровоспаления в нейродегенерации. В этом исследовании была разработана и подтверждена модель нейровоспаления личиночной рыбки данио, опосредованной желудочковой микроинъекцией липополисахарида (ЛПС) для индуцирования иммунного ответа и нейротоксичности. Трансгенные линии рыбок данио elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP и mpo:EGFP использовались для количественной оценки жизнеспособности нейронов мозга в режиме реального времени с помощью флуоресцентной живой визуализации, интегрированной с анализом интенсивности флуоресценции. Локомоторное поведение личинок рыбок данио было записано автоматически с помощью видеорегистратора. Содержание оксида азота (NO) и уровни экспрессии мРНК воспалительных цитокинов, включая интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли человека α (TNF-α), были исследованы для оценки вызванного ЛПС иммунного ответа в голове личинок рыбок данио. Через 24 ч после желудочковой инъекции ЛПС в мозг у личинок рыбок данио наблюдалась потеря нейронов и дефицит локомоции. Кроме того, вызванное ЛПС нейровоспаление увеличивало высвобождение NO и экспрессию мРНК IL-6, IL-1β и TNF-α в голове в течение 6 дней после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио и приводило к набору нейтрофилов в мозг рыбок данио. В этом исследовании инъекция рыбок данио с ЛПС в концентрации 2,5-5 мг/мл при 5 dpf была определена как оптимальное условие для этого фармакологического нейровоспаленного анализа. Этот протокол представляет собой новую, быструю и эффективную методологию микроинъекции ЛПС в желудочек головного мозга для индуцирования ЛПС-опосредованного нейровоспаления и нейротоксичности у личинки рыбок данио, которая полезна для изучения нейровоспаления, а также может быть использована в качестве высокопроизводительного анализа лекарств in vivo .
Introduction
Нейровоспаление было описано как важнейший антинейрогенный фактор, участвующий в патогенезе ряда нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС)1. После патологических инсультов нейровоспаление может привести к различным неблагоприятным последствиям, включая ингибирование нейрогенеза и индукцию гибели нейрональных клеток 2,3. В процессе, лежащем в основе реакции на индукцию воспаления, множественные воспалительные цитокины (такие как TNF-α, IL-1β и IL-6) секретируются во внеклеточное пространство и действуют как важнейшие компоненты в гибели нейронов и подавлении нейрогенеза 4,5,6.
Микроинъекция медиаторов воспаления (таких как IL-1β, L-аргинин и эндотоксины) в мозг может вызвать сокращение нейрональных клеток и нейровоспаление 7,8,9. Липополисахарид (ЛПС, рисунок 1), патогенный эндотоксин, присутствующий в клеточной стенке грамотрицательных бактерий, может вызывать нейровоспаление, усугублять нейродегенерацию и уменьшать нейрогенез у животных10. Инъекция ЛПС непосредственно в ЦНС мозга мыши повышала уровень оксида азота, провоспалительных цитокинов и других регуляторов11. Кроме того, стереотаксическая инъекция ЛПС в локальную среду мозга может индуцировать чрезмерную выработку нейротоксических молекул, что приводит к нарушению функции нейронов и последующему развитию нейродегенеративных заболеваний 10,12,13,14,15. В области неврологии микроскопические наблюдения за клеточными и биологическими процессами в живых организмах имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в основе патогенеза и фармакологического действия16. Однако живая визуализация мышиных моделей нейровоспаления и нейротоксичности принципиально ограничена ограниченной глубиной оптического проникновения микроскопии, что исключает функциональную визуализацию и живое наблюдение за процессами развития 17,18,19. Поэтому разработка альтернативных моделей нейровоспаления представляет большой интерес для облегчения изучения патологического развития и механизма, лежащего в основе нейровоспаления и нейродегенерации, с помощью живой визуализации.
Рыбка данио (Danio rerio) стала многообещающей моделью для изучения нейровоспаления и нейродегенерации благодаря своей эволюционно сохраненной врожденной иммунной системе, оптической прозрачности, большому размеру кладки эмбрионов, генетической управляемости и пригодности для визуализации in vivo 19,20,21,22,23 . Предыдущие протоколы либо непосредственно вводили ЛПС в желток и желудочек заднего мозга личинок рыбок данио без механистической оценки, либо просто добавляли ЛПС в рыбью воду (культуральную среду), чтобы вызвать смертельный системный иммунный ответ 24,25,26,27. Здесь мы разработали протокол для микроинъекции ЛПС в желудочки мозга, чтобы вызвать врожденный иммунный ответ или нейротоксичность в течение 5 дней после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио. Эта реакция подтверждается потерей нейрональных клеток, дефицитом локомоторного поведения, повышенным высвобождением оксида нитритов, активацией экспрессии воспалительных генов и набором нейтрофилов в мозг рыбок данио через 24 ч после инъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ab диких рыбок данио и трансгенных линий рыбок данио elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP и mpo: EGFP были получены из Института китайских медицинских наук (ICMS). Этическое одобрение (UMARE-030-2017) для экспериментов на животных было предоставлено Комитетом по этике исследований животных Университета Макао, и протокол следует институциональным руководящим принципам ухода за животными.
1. Зародыши рыбок данио и личиночное животноводство
- Генерация эмбрионов рыбок данио (200-300 эмбрионов за спаривание) путем естественного парного спаривания, как сообщалось ранее28.
- Приготовьте яичную воду (E3) из среднего запаса (60×), растворив 34,8 г NaCl, 1,6 г KCl, 5,8 г CaCl2·2H 2O и 9,78 г MgCl2·6H2Oв ddH2Oдо конечного объема 2 л и отрегулируйте рН до 7,2 с использованием NaOH и HCl. Чтобы получить рабочую концентрацию среды Е3 (1×), разбавьте запас 60 раз в ddH2O. Хранить при 28,5 °C, когда он не используется.
- Используйте пластиковую переносную пипетку для переноса эмбрионов рыбок данио в блюдо, содержащее среду E3. Выращивайте эмбрионы при 28,5 °C в инкубаторе и следите за их развитием и здоровьем. Удалите мертвые эмбрионы и замените нечистую среду E3 свежей средой ежедневно.
- Для экспериментов по визуализации рыбок данио используйте пластиковую переносную пипетку для сбора эмбрионов 0-2 ч после оплодотворения (hpf) (около 200 яиц) примерно в 15 мл 1× среде E3, содержащей 0,003% N-фенилтемочевины (PTU).
ПРИМЕЧАНИЕ: ПТУ может ингибировать образование меланофоров во время эмбриогенеза29. Лечение эмбрионов ПТУ во время эмбриогенеза может улучшить обнаружение сигналов в микроскопии или экспрессию флуоресценции30. - Поддерживайте эмбрионы рыбок данио в вышеуказанных условиях до тех пор, пока эмбрионы не достигнут желаемой стадии развития личинок.
2. Подготовка к микроинъекции
- Подготовьтесь к инъекции, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника микропипетки (см. Таблицу материалов), следуя пятиступенчатому протоколу для вытягивания стеклянной капиллярной трубки (таблица 1).
- Откройте наконечник иглы (тонкостенные стеклянные капилляры [3,5 дюйма] с нитью накаливания, OD 1,14 мм) до соответствующего размера под углом с помощью щипцов (рисунок 2A).
- Наполните иглу 0,1 мл минерального масла, чтобы убедиться, что пузырьков нет.
- Снимите винтовой колпачок стальной иглы микроинъекционного аппарата. Совместите отверстие стеклянной иглы со стальной иглой, а затем затяните крышку винта. Установите нагруженный игольчатый микроинъекционный аппарат в микроманипулятор (см. Таблицу материалов).
- Отрегулируйте положение микроинъекционного аппарата так, чтобы микроманипулятор мог гибко перемещать аппарат под микроскопом. Выгрузите определенный объем парафинового масла, чтобы стальная игла попала в капиллярную стеклянную трубку.
- Опустите раствор для инъекций (например, 1× PBS или 5 мг/мл LPS) на стеклянную горку, стерилизованную 70% этанолом, и отрегулируйте микроинъекционный аппарат так, чтобы наконечник был вставлен в каплю жидкости. Загрузите ~2 мкл инъекционного раствора в иглу.
- Настройте микроманипулятор (тонкая регулировка настроек вверх, вниз, влево и вправо) так, чтобы кончик иглы микроинъекционного аппарата находился в том же поле зрения, что и личинки на большом увеличении (рисунок 2B).
3. Крепление рыбок данио для микроинъекций
ПРИМЕЧАНИЕ: Развитие мозга рыбок данио происходит в пределах 3 dpf и созревает при 5 dpf с хорошо развитой центральной нервной системой31,32. Таким образом, личинки 5 dpf уже подходят для изучения Опосредованного ЛПС повреждения нейронов, а также поведенческих и воспалительных реакций.
- Введите личинкам рыбок данио в течение примерно 30 минут после достижения стадии интереса, чтобы сохранить постоянство времени инъекции.
- Чтобы обезболить личинок рыбок данио, соедините трикаин с чистой водой аквариума (конечная концентрация 0,02% мас./об. трикаина).
- Расплавить раствор 2% агарозы в ddH2Oс помощью микроволновой печи. Перелейте расплавленную агарозу в пластиковую посуду. Пластиковая тарелка с 2% покрытием агарозой может храниться при температуре 4 °C до 2 недель.
- Используйте пластиковую передаточную пипетку для транспортировки обезболенных личинок к центру пластиковой посуды с 2% покрытием из агарозы. Ориентируйте конных личинок головной стороной вверх для доступа иглы.
4. Инъекция желудочка мозга
- Отрегулируйте увеличение микроскопа так, чтобы желудочковая структура мозга рыбок данио четко отображалась в поле зрения (рисунок 2В).
- Осторожно поместите иглу над тектумом мозга (рисунок 2C).
- Медленно прокалывайте кожу мозга рыбки данио кончиком иглы с помощью микроманипулятора.
- Нажмите ножную педаль, чтобы извлечь 1 нл 1x PBS или различные концентрации LPS (1,0, 2,5 и 5,0 мг/мл) (см. Таблицу материалов). В качестве примера показаны успешные инъекционные изображения желудочков, при которых желудочку мозга вводили 1 нл 1% синего красителя Эванса (разбавленного в PBS) (рисунок 2D). Перенесите личинок в чистую среду Е3 сразу после инъекции. Через 24 ч собирают личинок для микроскопической визуализации, анализа поведения локомотивов и определения других показателей.
5. Визуализация
- Приготовьте 1,5% низкоплавкий раствор агарозы в среде Е3 и нагрейте его в микроволновой печи с образованием прозрачной жидкости.
- Используйте чистую пластиковую передаточную пипетку, чтобы транспортировать личинок на стеклянную горку и удалить как можно больше воды.
- Используйте пластиковую переносную пипетку, чтобы добавить каплю 1,5% низкоплавкой агарозы к личинкам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите агарозу с низким расплавом в пипетке на некоторое время перед добавлением, чтобы не травмировать личинок. - Используйте иглу шприца объемом 1 мл для ориентации личинок. Подождите, пока агароза остынет и затвердеет, прежде чем начинать визуализацию.
- Наблюдать и фотографировать область нейронов во всем мозге рыбок данио Tg(ETvmat2:EGFP) и Tg(elavl3:mCherry), а также рекрутирование нейтрофилов в мозге рыбок данио Tg(mpo:EGFP) под флуоресцентным стереомикроскопом (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки флуоресцентного микроскопа, используемые для визуализации, показаны ниже. Tg(ETvmat2:EGFP) мозг рыбки данио (длина волны возбуждения: 450-490 нм, длина волны излучения: 500-550 нм, визуальное увеличение: 100x); Tg(elavl3:mCherry) мозг рыбки данио (длина волны возбуждения: 541-551 нм, длина волны излучения: 590 нм, визуальное увеличение: 100x); Tg(mpo:EFGP) мозг рыбки данио (длина волны возбуждения: 450-490 нм, длина волны излучения: 500-550 нм, визуальное увеличение: 63x). - Измерьте и проанализируйте интенсивность флуоресценции и длину области нейрона Ra у рыбок данио Tg(ETvmat2: EGFP) и интенсивность флуоресценции нейронов мозга рыбок данио Tg (elavl3: mCherry) с помощью программного обеспечения ImageJ. Вручную подсчитайте нейтрофилы в области мозга рыбок данио Tg(mpo:EFGP).
6. Определение маркеров экспрессии генов
- Через 24 ч после ЛПС желудочковой инъекции в мозг приступают к определению маркеров экспрессии генов. Для этого обезболивайте личинок рыбок данио 0,02% трикаина (как упоминалось на этапе 3.2).
- Используйте два шприца по 1 мл, чтобы отделить головные части личинок (40 личинок на группу) без областей глаз и желточного мешка (рисунок 2Е).
- Извлеките РНК из частей головки личинки.
- Для экстракции РНК гомогенизируйте головную часть 200 мкл реагента экстракции РНК (см. Таблицу материалов) с помощью измельчителя тканей (см. Таблицу материалов) со скоростью вращения 11 000 об/мин в течение 5 с.
- Выполняют экстракцию РНК методом хлороформ-изопропанол. Для этого добавляют 40 мкл хлороформа, энергично встряхивают пробирки и инкубируют их при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугируйте образцы при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
- Переместите водную фазу в свежую трубку (около 100 мкл) и добавьте 100 мкл изопропанола. Инкубировать в течение 10 мин, а затем центрифугу при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите супернатант.
- Добавьте 200 мкл 75% этанола для промывки гранулы РНК. Вращайте образцы ненадолго, а затем центрифугируйте при 7500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и снова промыте гранулу РНК.
- Высушите гранулу РНК на воздухе в течение 5-10 мин, затем добавьте 30 мкл рваазной воды для растворения гранулы РНК. Проверить чистоту (соотношение поглощения при 260 нм и 280 нм) и целостность РНК проверяют с помощью микрообъемного спектрофотометра (см. Таблицу материалов).
- Синтезируют кДНК из РНК, извлеченной на стадии 6.3, используя обратную транскриптазу со случайными праймерами (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 1 мкл случайных праймеров, 1 мкл дНТП, 1 мкг РНК и дистиллированную воду (общий объем до 12 мкл) в трубку без нуклеазы. Разогрейте смесь до 65 °C в течение 5 мин и быстро охладите на льду.
- Добавьте в пробирку 1 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл ингибитора РНКАЗЫ, 4 мкл 5× буфера первой цепи и 1 мкл обратной транскриптазы M-MLV (общий объем: 20 мкл). Осторожно перемешать и инкубировать пробирку при 25 °C в течение 2 мин, затем 42 °C в течение 50 мин. Инактивируют реакцию нагреванием при 70 °C в течение 15 мин.
- Выполняйте ПЦР в режиме реального времени в системе qPCR (см. Таблицу материалов) с использованием коммерчески доступного набора RT-qPCR (см. Таблицу материалов) для определения экспрессии генов-мишеней (IL-1β, IL-6 и TNF-α). Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10 мкл зеленого SYBR, 0,4 мкл эталонного красителя ROX, 0,8 мкл каждого из прямой и обратной праймеров, 6 мкл ddH2O и 2 мкл шаблонной кДНК (1 мкг). Проводят ПЦР-амплификацию в условиях: 95 °С в течение 30 с, затем 40 циклов, 95 °С в течение 5 с и 60 °С в течение 34 с, и со стадией диссоциации 95 °С в течение 15 с, 60 °С в течение 60 с и 95 °С в течение 15 с.
- Нормализуйте уровни мРНК генов-мишеней до уровня гена домашнего хозяйства, фактор удлинения 1 α (Ef1α). Рассчитайте уровни экспрессии для каждого гена-мишени методом 2−ΔΔCT33. Праймерные последовательности каждого гена описаны в таблице 2.
- Для определения оксида азота гомогенизируют головную часть (полученную на стадии 6.2) в 100 мкл холодного ПБС с помощью тканевой шлифовальной машины. Центрифуга полученной PBS и суспензии головной части при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Соберите лизаты и выполните анализ концентрации нитритов34 с использованием коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов).
7. Поведенческий анализ локомотива рыбок данио
- Через 24 ч после инъекции ЛПС желудочков в мозг переносят личинок рыбок данио в колодцы 96-луночной квадратной микропластины по отдельности. Добавьте 300 мкл среды E3 в каждую лунку, а затем инкубируйте личинки в течение 4 часов для акклиматизации к испытательной пластине.
- Перенесите загруженную личинками микропластинку в ящик для отслеживания рыбок данио (см. Таблицу материалов). Включите источник света, а затем высиживайте личинок в испытательной коробке в течение 30 минут, чтобы акклиматизировать окружающую среду.
- Отслеживайте и записывайте поведение рыбок данио с помощью автоматизированной системы видеослежения. Запишите 12 сеансов (по 5 мин каждый, всего 1 ч) для каждой рыбки данио. Определите общее расстояние (состоит из неактивных, малых и больших расстояний) как расстояние (в мм), которое каждая рыба преодолела в течение 60-минутного периода отслеживания.
8. Статистический анализ
- Выполняйте статистический анализ с помощью стандартного аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
- Выполнить статистический анализ различий между двумя группами с помощью обычной односторонней ANOVA. Рассчитайте коэффициент корреляции Пирсона, чтобы оценить силу корреляций. P < 0,05 было признано значимым во всех анализах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный здесь рабочий процесс представляет собой новую, быструю и эффективную методологию индуцирования ЛПС-опосредованного нейровоспаления и нейротоксичности у личинок рыбок данио. В этом описанном протоколе 5 dpf рыбок данио вводили с ЛПС (рисунок 1) в желудочки мозга с использованием микроинъектора (рисунок 2A-C). Успешная инъекция в участок желудочка мозга была проверена с использованием 1% синего пятна Эванса (рисунок 2D). Голову рыбки данио отделяли от глаз и тела с помощью шприцев (рисунок 2Е), чтобы исключить любое влияние воспалительной экспрессии цитокинов и высвобождения оксида азота в организме рыбки данио на определение нейровоспаления и нейротоксичности в головном мозге.
Такой же объем PBS (как и LPS) вводился в желудочковую область мозга рыбок данио в качестве фиктивного контроля. Не наблюдалось существенных различий между контрольной и фиктивно-управляемой группами в нейронах, в частности, особенно из передней группы ядер рафе (Ra) (Рисунок 3A-C), флуоресцентной интегральной плотности нейронов мозга (Рисунок 3D, E), общего расстояния движения рыбок данио (Рисунок 4A,B), NO продукции и экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-1β) (Рисунок 4A-D), а также рекрутирование нейтрофилов в мозг личинок рыбок данио (Рисунок 6A,B). Эти результаты показали, что правильная микроинъекция не вызывает никакой нейротоксичности и нейровоспаления у рыбок данио.
После лечения в течение 24 ч желудочковая инъекция ЛПС в мозг индуцировала нейротоксичность у рыбок данио. ЛПС (1-5 мг/мл) индуцировал значительную потерю нейронов Ra в мозге личинок рыбок данио Tg(ETvmat2:GFP) по сравнению с контрольной и фиктивной группами (рисунок 3A-C). Трансгенная линия elav13:m Вишня данио очерчивает нейрональные клетки ядерным красным флуоресцентным белком35. Как показано на рисунке 3D,E, 2,5-5 мг/мл ЛПС привело к значительным изменениям флуоресцентной интегральной плотности нейронов мозга в этой личиночной линии рыбок данио. Тем не менее, группа инъекций ЛПС 1 мг/мл не показала влияния на флуоресцентную интегральную плотность нейронов мозга по сравнению с контрольной и фиктивной группами. Кроме того, 5 мг/мл ЛПС вызывал дефицит локомоции (рисунок 4А) и уменьшал общее расстояние движения рыбок данио в течение 60-минутного периода отслеживания (рисунок 4B). Результаты показали, что 1-2,5 мг / мл ЛПС может индуцировать потерю нейронов, но при этом нет значительного дефицита локомоции.
Кроме того, желудочковая инъекция ЛПС в мозг также может активировать воспалительную реакцию в мозге рыбок данио. No-продуцирование (Рисунок 5А) и экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-1β) (Рисунок 5B-D) в голове личинок рыбок данио были увеличены на 2,5-5 мг/мл ЛПС по сравнению с экспрессией в контрольной и фиктивной группах. После инъекции ЛПС 1-5 мг/мл наблюдался рекрутирование нейтрофилов в мозг личинок рыбок данио (Рисунок 6А), что приводило к значительному увеличению числа нейтрофилов в области мозга рыбок данио Tg(mpo:EGFP) (Рисунок 6В).
| Шаг | Время работы (сек) | Уровень нагрева | Действие |
| Т1 | Л> | Н80-89 | П1Л005 |
| Т2 | 1.6-3 | Н00 | |
| Т3 | Л> | Н00 | P2L001c |
| Т4 | 3 | Н00 | КЛАССНО |
| Т5 | 0 | Н00 |
Таблица 1: Пятиступенчатый протокол для вытягивания стеклянных капиллярных трубок.
| Название грунтовки | Последовательность | |
| Ил-1β форвард | 5'-КАТТТГЦАГГГКГГТЦАКА-3' | |
| IL-1β реверс | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| Ил-6 форвард | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| Ил-6 реверс | 5'-TCTTTCCCTCTTCCTCCTG-3' | |
| TNF-α вперед | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3' | |
| TNF-α реверс | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α вперед | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| Ef1α реверс | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3' | |
Таблица 2: Грунтовки, используемые в режиме реального времени qPCR.
Рисунок 1: Общая структура липополисахарида (LPS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Установка микроинъекции, поза тела и положение рыбок данио, а также разделение части головы. (А) Выбор стеклянной иглы: используйте пинцет, чтобы разрезать кончик предварительно вытянутой иглы под микроскопом, чтобы получить иглу с аналогичным отверстием, как показано на рисунке. (B) Отрегулируйте фокусное расстояние микроскопа таким образом, чтобы область желудочков мозга личинок рыбок данио можно было наблюдать при большом увеличении (выделено черным цветом). Светло-синие круги указывают на место инъекции. (C) Смонтированные личинки должны быть ориентированы головной стороной вверх для доступа иглы (мозговой тектум, обозначенный красным кругом). (D) Демонстрация успешной желудочковой инъекции с голубым Эвансом в мозг личинок рыбок данио. (E) Часть головы рыбки данио без области глаз и желточного мешка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Желудочковая инъекция ЛПС в мозг аблятирует нейроны через 24 ч у личинок рыбок данио. (А) (Вверху) Репрезентативные флуоресцентные микроскопические изображения vmat2:GFP рыбок данио после обработки различными концентрациями ЛПС (красные скобки указывают на нейроны ядер рафе [Ra]; шкала бар = 265,2 мкм). (Внизу) Нейрональная область Ra была увеличена для улучшения морфологической визуализации. (В,С) Средняя интенсивность флуоресценции и длина области нейрона Ra у личинок рыбок данио vmat2:GFP. (Д,Д) Репрезентативная морфология (шкала = 265,2 мкм) и средняя интенсивность флуоресценции нейронов мозга рыбок данио Tg(elavl3:mCherry). Данные выражаются в процентах от контрольной группы. *P < 0,05 и **P < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Инъекция ЛПС в желудочки в мозг вызывает дефицит локомоции через 24 ч у личинок рыбок данио. (А) Репрезентативные паттерны следов передвижения рыбок данио. На цифровой карте слежения высокоскоростное движение представлено красными линиями (> 6,6 мм/с); среднескоростное движение изображено зелеными линиями (3,3−6,6 мм/с); движение на низкой скорости изображено черными линиями (< 3,3 мм/с). (B) Количественный анализ среднего общего расстояния, пройденного рыбками данио за 60 мин. *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Желудочковая инъекция ЛПС в мозг увеличивает провоспалительные медиаторы. (А) Уровни оксида азота измеряли с использованием реагента Грисса. (Б-Д) Уровни экспрессии генов интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1β (IL-1β) и фактора некроза опухоли α (TNF-α) в голове рыбок данио были исследованы с помощью qPCR. *P < 0,05 и **P < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Микроинъекция желудочков ЛПС головного мозга приводит к рекрутированию нейтрофилов в мозг рыбок данио через 24 ч. (А) Миграция нейтрофилов (область внутри красного круга) в головку личинок после инъекции ЛПС в желудочковый мозг (шкала бар = 851,1 мкм). (B) Количество нейтрофилов в головах личинок после инъекции ЛПС желудочков в мозг. *P < 0,05 и **P < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Необработанные данные Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Все больше эпидемиологических и экспериментальных данных указывают на хронические бактериальные и вирусные инфекции в качестве возможных факторов риска нейродегенеративных заболеваний36. Инфекция запускает активацию воспалительных процессов и иммунных реакций хозяина37. Даже если ответ действует как защитный механизм, гиперактивированное воспаление вредно для нейрогенеза, а воспалительная среда не позволяет выживать новорожденным нейронам38. В результате это вызывает повреждение функций нейронов хозяина и жизнеспособности. Исследования показывают, что воспаление играет значительную роль в патофизиологии нейродегенерации39.
Как часто изучаемый патогенный эндотоксин, ЛПС был вовлечен в ингибирование нейрогенеза и нейродегенерации. Активация ЛПС воспалительных процессов значительно ухудшает нейрогенез, частично за счет выработки NO, TNF-α, IL-6 и IL-1β40. Растущее количество доказательств показывает, что ЛПС вызывает дефицит поведения и потерю нейронов, а также влияет на прогрессирование нейрогенеза при центральном введении в нейродегенеративные модели грызунов10,38. Модели рыбок данио широко использовались в качестве альтернативных экспериментальных моделей для изучения иммунных реакций41 и скрининга новых противовоспалительных препаратов. Врожденная и адаптивная иммунная системы рыбок данио аналогичны таковой у млекопитающих42. Кроме того, некоторые исследования выявили несколько воспалительных цитокинов и рецепторов, присутствующих у млекопитающих в ЦНС43. Более ранние исследования показывают, что погружение эмбрионов / личинок рыбок данио в LPS или введение LPS в желток личинок рыбок данио может вызвать иммунный ответ и увеличить провоспалительные факторы, связанные с воспалением44,45. Однако специфическое влияние ЛПС на нервную ткань рыбок данио, а также на индукцию нейровоспаления пока не известно.
Хотя модели грызунов имеют много преимуществ перед другими моделями животных, их ограничения с точки зрения визуализации in vivo в режиме реального времени и скрининга лекарств очевидны. Визуализация in vivo широко используется для исследования механизмов, лежащих в основе развития нервной системы и патологических изменений мозга в качестве мощного и неинвазивного инструмента46,47. Благодаря оптической прозрачности эмбрионов и личинок рыбок данио, они хорошо подходят для живых экспериментов по визуализации наблюдения мозга48,49. В частности, небольшой размер рыбок данио и их способность производить тысячи эмбрионов означают, что высокопроизводительный скрининг лекарств может быть проведен с использованием эмбрионов рыбок данио или личинок50,51. Более того, с развитием науки и техники роботизированные микроинъекции могут быть доставлены точно и эффективно и могут быть использованы для инъекции большого количества эмбрионов или личинок 52,53. Применение системы микророботизированных инъекций для исследования нейронов, для своевременной инъекции материалов в большое количество эмбрионов или личинок, облегчит масштабный скрининг биомолекул и лекарственных соединений.
В этом исследовании рыбкам данио при 5 dpf вводили ЛПС в концентрации 2,5-5 мг/мл; это было определено как оптимальное условие для разработки модели нейровоспаления. Насколько нам известно, эта методология не была описана в литературе. Следовательно, микроинъекция ЛПС желудочков головного мозга у личинок рыбок данио смогла вызвать потерю нейронов и дефицит локомоции. Более того, наши результаты показали, что вызванное ЛПС нейровоспаление повышает уровни провоспалительных медиаторов, таких как NO, TNF-α, IL-6 и IL-1β, и приводит к набору нейтрофилов в мозг личинок рыбок данио через 24 ч после инъекции. В других животных моделях инъекция ЛПС также может способствовать развитию воспаления и вызывать нейропатологические изменения в мозге13,54. Результаты этого исследования способствуют нашему пониманию нейровоспалительных путей. При этом способе следует отметить, что отверстие игл для микроинъекции не должно быть слишком большим, чтобы избежать повреждения головного мозга, вызванного механической операцией, и следует приложить разумное количество силы, чтобы избежать повреждения личинок. Кроме того, важно отделить голову от глаз и тела рыбок данио для определения воспалительных факторов и оксида азота, так как это поможет получить направленные результаты, конкретно отражающие нейровоспаление, вызванное инъекцией ЛПС желудочков в мозг.
Небольшим недостатком этого метода является то, что из-за небольшого размера личинок рыбок данио количество биомолекул, таких как общая мРНК, полученная путем гомогенизации и экстракции, ниже, чем у мышиной модели. Тем не менее, рыбки данио способны часто нереститься с несколькими сотнями яиц каждую неделю. Увеличение количества личинок рыбок данио, используемых в каждой группе, может обеспечить достаточное количество экстрагированных биомолекул для различных биохимических анализов. В заключение, этот метод вызывает нейротоксичность и иммунный ответ в мозге личинок рыбок данио. Из-за прозрачности рыбок данио изменения в мозге личинок живой рыбки данио могут быть лучше поняты с помощью визуализации in vivo . Методика, описанная здесь, является отличным инструментом для быстрой и эффективной оценки возможных противоневровоспалительных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Фонда развития науки и техники (FDCT) САР Макао (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 и 0016/2019/AKP), Исследовательский комитет Университета Макао (MYRG2020-00183-ICMS и CPG2022-00023-ICMS) и Национальный фонд естественных наук Китая (No 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al.
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O.
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J.
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
