הערכה של בריאות המיטוכונדריה בפיברובלסטים הקשורים לסרטן שבודדו מספרואידים של גידולי ריאה רב-תאיים תלת-ממדיים
Summary
ספרואידים רב-תאיים של גידולים תלת-ממדיים הוכנו עם תאי אדנוקרצינומה של הריאה, פיברובלסטים ומונוציטים, ולאחר מכן בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) מהספרואידים האלה. CAFs מבודדים הושוו לפיברובלסטים רגילים כדי להעריך את בריאות המיטוכונדריה על-ידי חקירת הפוטנציאל הטרנס-ממברני של המיטוכונדריה, מיני חמצן תגובתי ופעילויות אנזימטיות.
Abstract
פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם בין התאים הסטרומליים הנפוצים ביותר הקיימים במיקרו-סביבה של הגידול, מה שמקל על צמיחת הגידול והתקדמותו. המורכבות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, כולל הפרשת הגידול, דלקת בדרגה נמוכה, היפוקסיה וחוסר איזון חמצון-חיזור, מעודדת אינטראקציה הטרוטיפית ומאפשרת לטרנספורמציה של פיברובלסטים לא פעילים להפוך ל-CAFs פעילים. CAFs נבדלים מטבולית מפיברובלסטים רגילים (NFs) מכיוון שהם פעילים יותר מבחינה גליקוליטית, מייצרים רמות גבוהות יותר של מיני חמצן תגובתי (ROS), ויצואן לקטט בעל ביטוי יתר MCT-4, מה שמוביל לפתיחת נקבובית המעבר לחדירות מיטוכונדריאלית (MPTP). כאן תוארה שיטה לניתוח בריאות המיטוכונדריה של CAFs פעילים שבודדו מהספרואידים הרב-תאיים של גידולים תלת-ממדיים המורכבים מתאי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית (A549), מונוציטים אנושיים (THP-1) ותאי פיברובלסטים של ריאה אנושית (MRC5). ספרואידים סרטניים התפרקו במרווחי זמן שונים ובאמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנט, CAFs בודדו. פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית של CAFs הוערך באמצעות צביעת JC-1, ייצור ROS על ידי צביעת 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) ופעילות אנזים ב-CAFs המבודדים. ניתוח בריאות המיטוכונדריה של CAFs מבודדים מספק הבנה טובה יותר של אפקט ורבורג ההפוך וניתן ליישם אותו גם כדי לחקור את ההשלכות של שינויים מיטוכונדריאליים של CAF, כגון שטפי חילוף החומרים והמנגנונים הרגולטוריים המתאימים על הטרוגניות סרטן הריאות. לפיכך, המחקר הנוכחי דוגל בהבנה של אינטראקציות גידול-סטרומה על בריאות המיטוכונדריה. היא תספק פלטפורמה לבדיקת מועמדים לתרופות ספציפיות למיטוכונדריה על יעילותן מול CAFs כטיפולים פוטנציאליים במיקרו-סביבה של הגידול, ובכך למנוע מעורבות CAF בהתקדמות סרטן הריאות.
Introduction
גידולים מוצקים מורכבים מאוכלוסיות תאים הטרוגניות אשר מונחות על ידי מיקרו-סביבה של הגידול (TME), אולם מקורם של רוב התאים טרם התגלה. בעיקר תאים סטרומליים ותאי חיסון (פיברובלסטים, תאי אנדותל, מונוציטים, מקרופאגים, תאים דנדריטיים, תאי B, תאי T ותת-הקבוצות שלהם) משקפים את ההטרוגניות של הגידול בסרטן הריאה, השד, הכליות וסוגי סרטן מוצקים אחרים 1,2,3. הבנת מקורו של כל תת-סוג ופוטנציאל הטרנס-דיפרנציאציה שלו היא בעלת צורך עליון בפיתוח טיפולים מתקדמים נגד סוגי סרטן אלה. הניתוח של אוכלוסיית תאים מגוונת זו בביופסיות אנושיות מציב בפניו מספר אתגרים בגלל סוג הגידול, האתר, השלב, הגבלת כמות הדגימה, והשונות הספציפית למטופל4. לפיכך, יש צורך במודל ניסיוני, שהוא לא רק אמין אלא יכול גם לדמות את מצב הגידול in vivo, ולהוכיח את עצמו כאידיאלי לחקר הצלבת גידול-סטרומה ומעורבותו בפתופיזיולוגיה של מחלות.
תרביות תלת-ממדיות (3D) של גידולים רב-תאיים (MCTS) הן מערכת מודלים חוץ-גופית של גידולים בשל הדמיון שלהם למקביליהם הטבעיים. MCTS יכול לשכפל טוב יותר היבטים של גידולים מוצקים מאשר מודלים של תרביות תאים דו-ממדיות, כולל הארכיטקטורה המרחבית שלהם, תגובות פיזיולוגיות, שחרור מתווכים מסיסים, דפוסי ביטוי גנים ומנגנוני עמידות לתרופות. יתר על כן, אחד היתרונות העיקריים של MCTS הוא שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההטרוגניות של הגידול ואת המיקרו-סביבה של הגידול (TME). שיטת התלייה-טיפה היא הכלי הנפוץ ביותר לפיתוח וניתוח MCTS5. בשיטה זו, התאים השונים עם המדיה תלויים בצורה של טיפות, המאפשרת את צמיחתה בצורה מצרפית תלת-ממדית קוהרנטית ופשוטה לגישה לבדיקה. הטכניקה פשוטה; זה לא דורש תאים רבים ומבטל את הדרישה של מצע מיוחד כמו agarose לפיתוח ספרואידים6. יתרון נוסף של שיטה זו טמון בשחזור הטכניקה שלה. יתר על כן, שיטה זו שימשה גם לתרבית משותפת של אוכלוסיות תאים מעורבים, כגון תאי אנדותל ותאי גידול, כדי לדמות אנגיוגנזה מוקדמת של הגידול7.
במחקר זה הוכנו ספרואידים תלת-ממדיים של גידולי ריאה רב-תאיים עם תאי אדנוקרצינומה של הריאה, פיברובלסטים ומונוציטים בשיטת הטיפה התלויה, המחקה את המיקרו-סביבה של גידולי הריאה. לאחר מכן בודדה אוכלוסיית הפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAF) כדי לחקור את בריאות המיטוכונדריה. הרעיון המרכזי מאחורי פיתוח הספרואידים האלה הוא לבודד את ה-CAFs, שכן ההצלבה בין התאים בספרואידים יכולה להפוך את הפיברובלסטים למצב CAF מופעל דמוי מיו-פיברובלסט. שנית, מחקר זה עשוי גם לתאר כיצד ייצור חריג של ROS ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה מניעים את הפיברובלסטים הרגילים לעבר פנוטיפ CAF אגרסיבי יותר. נמצא כי פיברובלסטים המורכבים בתוך ספרואידים סרטניים קיבלו מאפיינים מיופיברובלסטיים עם פעילות ROS מוגברת והשראת ביטוי גנים מטבוליים. פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של מיקרו-סביבה של הגידול בהפעלת CAF ויכול להיות מודל מצוין לייצור במבחנה ולחקר מאפיינים פנוטיפיים של CAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי מציג את התפתחותם של ספרואידים סרטניים רב-תאיים הכוללים תאי גידול, אוכלוסיית תאים סטרומליים (כלומר, פיברובלסטים) ואוכלוסיית תאי מערכת החיסון (כלומר, מונוציטים) בשיטת טיפה תלויה שונה. פיברובלסטים ומונוציטים/מקרופאגים הם בין האוכלוסיות המשמעותיות ביותר המהוות את המיקרו-סביבה ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט פרס המצוינות של SERB-Women, הודו (SB/WEA-02/2017) ופרויקט פרס SERB-Early Career Research, הודו (ECR/2017/000892) ל-DP. המחברים, LA ו-SR מודים ל-IIT Ropar ול-MHRD על מלגות המחקר שלהם. ח”כ מודה ל-ICMR על מלגת המחקר שלה.
Materials
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
References
- Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
- Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
- Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
- Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , 141-151 (2007).
- Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
- Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
- Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
- Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
- Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
- Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
- Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
- Bregman, A. A. . Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).
- Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
- Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
- Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
- Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
- Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
- Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).
