Summary
다세포 3D 종양 스페로이드는 폐 선암 세포, 섬유아세포 및 단핵구로 준비한 후 이러한 스페로이드에서 암 관련 섬유아세포(CAF)를 분리했습니다. 분리된 CAF를 정상 섬유아세포와 비교하여 미토콘드리아 막횡단 전위, 활성 산소 종 및 효소 활성을 연구하여 미토콘드리아 건강을 평가했습니다.
Abstract
암 관련 섬유아세포(CAF)는 종양 미세 환경에 존재하는 가장 풍부한 기질 세포 중 하나이며 종양 성장 및 진행을 촉진합니다. 종양 분비물, 저등급 염증, 저산소증 및 산화 환원 불균형을 포함한 종양 미세 환경 내의 복잡성은 이형 상호 작용을 촉진하고 비활성 상주 섬유아세포를 활성 CAF로 변형시킬 수 있습니다. CAF는 더 당분해 활성이고, 더 높은 수준의 활성 산소 종(ROS)을 생성하며, 젖산 수출업자 MCT-4를 과발현하여 미토콘드리아 투과성 전이 공극(MPTP)을 개방하기 때문에 정상 섬유아세포(NF)와 대사적으로 구별됩니다. 여기에서는 인간 폐 선암 세포 (A549), 인간 단핵구 (THP-1) 및 인간 폐 섬유 아세포 세포 (MRC5)로 구성된 다세포 3D 종양 스페로이드로부터 분리 된 활성화 된 CAF의 미토콘드리아 건강을 분석하는 방법이 설명되었다. 종양 스페로이드는 서로 다른 시간 간격으로 분해되고 자기 활성화 세포 분류를 통해 CAF가 분리되었습니다. CAF의 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 염료, 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 염색에 의한 ROS 생산 및 분리된 CAF에서의 효소 활성을 사용하여 평가되었습니다. 분리된 CAF의 미토콘드리아 건강을 분석하면 역 바르부르크 효과를 더 잘 이해할 수 있으며 대사 플럭스 및 폐암 이질성에 대한 해당 조절 메커니즘과 같은 CAF 미토콘드리아 변화의 결과를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 따라서 본 연구는 미토콘드리아 건강에 대한 종양-기질 상호 작용에 대한 이해를 옹호합니다. 이는 종양 미세 환경에서 잠재적인 치료제로서 CAF에 대한 미토콘드리아 특이적 약물 후보의 효율성을 확인할 수 있는 플랫폼을 제공하여 폐암 진행에 CAF가 관여하는 것을 방지합니다.
Introduction
고형 종양은 종양 미세 환경 (TME)에 의해 유도되는 이질적인 세포 집단으로 구성되지만 대부분의 세포의 기원은 아직 밝혀지지 않았습니다. 주로 기질 및 면역 세포 (섬유 아세포, 내피 세포, 단핵구, 대 식세포, 수지상 세포, B 세포, T 세포 및 그 하위 집합)는 폐암, 유방암, 신장 및 기타 고형암 1,2,3에서 종양 이질성을 반영합니다. 각 아형의 기원과 트랜스 분화 잠재력을 이해하는 것은 이러한 암에 대한 고급 치료법을 개발하는 데 가장 필요합니다. 인간 생검에서 이러한 다양한 세포 집단의 분석은 종양 유형, 부위, 단계, 샘플 양의 제한 및 환자 별 변동성으로 인해 몇 가지 문제를 제시합니다4. 따라서 신뢰할 수 있을 뿐만 아니라 생체 내 종양 상태를 시뮬레이션할 수 있는 실험 모델이 필요하며, 이는 종양-기질 혼선 및 질병 병태생리학에 대한 관여를 연구하는 데 이상적임이 입증되었습니다.
3차원(3D) 다세포 종양 스페로이드(MCTS) 배양물은 천연 대응물과 유사하기 때문에 종양의 유리한 시험관내 모델 시스템입니다. MCTS는 공간 구조, 생리적 반응, 가용성 매개체의 방출, 유전자 발현 패턴 및 약물 내성 메커니즘을 포함하여 2D 세포 배양 모델보다 고형 종양의 측면을 더 잘 복제할 수 있습니다. 또한, MCTS의 한 가지 주요 이점은 종양 이질성 및 종양 미세 환경(TME)을 연구하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 행잉 드롭 방법은 MCTS5를 개발하고 분석하는 데 가장 일반적으로 사용되는 도구입니다. 이 방법에서는 배지가 있는 다른 세포가 액적 형태로 현탁되어 일관된 3D 응집체 방식으로 성장할 수 있으며 검사를 위해 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 기술은 간단합니다. 많은 세포가 필요하지 않으며 스페로이드 개발을 위한 아가로스와 같은 특수 기질이 필요하지 않습니다6. 이 방법의 또 다른 장점은 기술의 재현성에 있습니다. 또한, 이 방법은 초기 종양 혈관신생7을 시뮬레이션하기 위해 내피 세포 및 종양 세포와 같은 혼합 세포 집단을 공동 배양하는 데에도 사용되었습니다.
이 연구에서는 폐 종양 미세 환경을 모방한 행잉 드롭 방법을 사용하여 폐 선암 세포, 섬유아세포 및 단핵구로 다세포 3D 폐 종양 스페로이드를 제조했습니다. 그런 다음 암 관련 섬유아세포(CAF) 집단을 분리하여 미토콘드리아 건강을 조사했습니다. 이러한 스페로이드 개발의 주요 아이디어는 스페로이드의 세포 간의 혼선이 섬유아세포를 근섬유아세포와 같은 활성화된 CAF 상태로 변형시킬 수 있기 때문에 CAF를 분리하는 것입니다. 둘째,이 연구는 비정상적인 ROS 생산 및 미토콘드리아 기능 장애가 정상적인 섬유 아세포를보다 공격적인 CAF 표현형으로 유도하는 방법을 묘사 할 수도 있습니다. 종양 스페로이드 내에서 조립 된 섬유 아세포는 증가 된 ROS 활성 및 대사 유전자 발현의 유도로 근 섬유 아세포 특성을 얻는 것으로 밝혀졌다. 이 프로토콜은 CAF 활성화에서 종양 미세 환경의 중요성을 강조하며 CAF 표현형 특성의 시험 관 내 생성 및 연구를위한 훌륭한 모델이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 인간 폐 선암 세포주 A549 및 인간 단핵구 세포주 THP-1을 5%CO2로 가습된 챔버에서 37°C에서 10% FBS 및 1% 페니실린이 보충된 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
- MRC-5 인간 폐 섬유아세포를 5%CO2로 가습된 챔버에서 37°C에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다.
2. A549 폐선암 세포주, MRC5 섬유아세포 및 THP-1 단핵구를 이용한 다세포암 스페로이드 제조
참고: 다세포 종양 및 비종양성 3D 스페로이드는 90mm 세포 배양 접시에 행잉 드롭 방법을 사용하여 준비되었습니다. 이러한 스페로이드의 발달에 대한 자세한 설명은 다음과 같습니다. 완전 배지, PBS 및 0.25% 트립신-EDTA 용액과 같은 모든 세포 배양 시약은 달리 명시되지 않는 한 사용 전에 37°C에서 예열해야 합니다.
- 세포 현탁액의 제조
- 5%CO2가 있는 가습된 챔버에서 37°C의 T25 플라스크에서 DMEM 완전 성장 배지(둘베코의 변형된 독수리 배지[DMEM] + 10% 태아 소 혈청[FBS] + 1% 페니실린-스트렙토마이신)에서 A549 및 MRC5 부착 세포(각각 5 x 106 세포)를 성장시킵니다.
- THP-1 세포의 경우 T25 플라스크에서 완전한 성장 배지(RPMI1640 + 10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신)에서 세포 현탁액(5 x 106 세포)을 성장시킵니다. 더 나은 성장을 위해 T25 플라스크를 37 ° C의 가습 챔버에 놓고 5 %CO2 를 서있는 위치에 놓습니다.
- 3일 후, 80%-85% 컨플루언시에서 A549 및 MRC5 세포를 각 플라스크에 PBS 1mL(25-30°C)를 추가하여 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS(인산염 완충 식염수)로 세척하고 1분 동안 흡인합니다.
- A549 및 MRC5 세포를 5%CO2 가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA 용액 500 μL와 함께 인큐베이션하여 플라스크로부터 수확한다. 그 직후, 4mL의 완전한 성장 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
- T25 플라스크에서 세포 현탁액을 15mL 튜브에 모으고 125 x g 에서 5분 동안 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 제거하고 세포를 5mL의 완전한 성장 배지에 재현탁시킨다.
- 다세포 종양 스페로이드 확립
알림: 종양 스페로이드 형성의 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 생물안전 캐비닛 내부에서 수행해야 합니다. 세포 현탁액의 최대 부피는 뚜껑을 뒤집는 동안 떨어지지 않도록 액적을 준비하기 위해 25μL의 방울로 표준화되었습니다.- 셀 카운터를 사용하여 A549, MRC5 및 THP-1 셀 번호를 계산합니다. 각 스페로이드 액적(25μL)에 대해 Arora et al.7에 설명된 프로토콜에 따라 5,000개의 A549 세포, 4,000개의 MRC5 세포 및 1,000개의 THP-1 세포를 유지합니다. 1mL 부피에 따라 세포 수를 계산합니다.
참고: 스페로이드는 처음에 스페로이드당 세 가지 다른 세포 수(즉, 5000, 8000 및 10,000)로 준비되었습니다. 또한 종양 세포/섬유아세포/단핵구의 다른 세포 비율(1:1:1, 2:2:1, 4:2:1, 5:2:1 및 5:4:1)을 확인했습니다. 마지막으로, 성공적인 3D 다세포 스페로이드 형성이 5:4:1의 비율로 관찰되어 연구에 사용되었습니다. 섬유아세포 농도는 종양 미세 환경에서의 비율에 따라 증가하여 종양 스페로이드의 강성을 더욱 향상시켰습니다. 자세한 절차는 Arora et al.7의 최근 간행물에보고되었습니다. - 세포 현탁액을 5 (A549, 2 x 10 5 세포/mL) 대 4 (MRC5, 1.6 x 10 5 세포/mL) 대 1 (THP-1,5 x 104 세포/mL)의 비율로 준비하고 완전한 DMEM으로 부피를 1mL로 구성합니다.
- 25μL의 세포 현탁액 혼합물을 90mm 배양 접시(약 50방울/90mm 접시)의 덮개에 놓습니다. 90mm 배양 접시의 바닥을 멸균수 10mL로 채 웁니다.
- 물이 채워진 수화 챔버 위로 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고 접시를 세포 배양 인큐베이터에 3 일 동안 두십시오.
- 4일째에 현미경으로 스페로이드를 10배 배율로 모니터링합니다. 이미지를 획득하려면 전원 스위치를 켜고 60mm 접시를 스테이지에 조심스럽게 놓고 배율(10x)을 선택합니다. 렌즈를 조정하고 세포를 검사하여 세포 응집 및 증식을 분석합니다. 현미경에 제공된 고정 및 저장 버튼을 눌러 이미지를 캡처합니다.
- 각 액적에서 20μL의 배지를 조심스럽게 흡인하고 새로운 완전 성장 배지로 교체하여 4일째에 성장 배지를 교체합니다.
- 셀 카운터를 사용하여 A549, MRC5 및 THP-1 셀 번호를 계산합니다. 각 스페로이드 액적(25μL)에 대해 Arora et al.7에 설명된 프로토콜에 따라 5,000개의 A549 세포, 4,000개의 MRC5 세포 및 1,000개의 THP-1 세포를 유지합니다. 1mL 부피에 따라 세포 수를 계산합니다.
3. 종양 스페로이드의 살아있는 죽은 분석
- 7일과 10일에 생물안전 캐비닛의 90mm 접시를 조심스럽게 뒤집고 200μL 피펫을 사용하여 각 방울에서 스페로이드를 수집합니다. 1.5mL 튜브에 각각 5개의 스페로이드를 수집합니다.
- 스페로이드가 들어 있는 1.5mL 튜브에 500μL의 1x PBS를 넣고 125 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 버리고 스페로이드를 200μL의 1x PBS에 재현탁시킵니다. 스페로이드 분해를 방지하기 위해 엄격하게 피펫팅하지 마십시오.
- 칼세인-AM 및 요오드화프로피듐 염색을 위해 60mm 접시에 200μL 피펫을 사용하여 스페타이드를 피펫팅합니다.
- 5μL의 1μM 칼세인-AM 용액과 5μL의 2mg/mL 프로피듐 요오드화물 용액을 스페로이드에 넣습니다. 10 분 동안 배양하십시오. 배양 기간이 끝나면 스페로이드를 1x PBS로 부드럽게 두 번 세척합니다.
- 형광 도립 현미경 아래에 스페로이드가 들어 있는 60mm 접시를 놓고 현미경 소프트웨어에서 형광 옵션을 선택하고 칼세인 및 텍사스 적색 채널(TXR, 여기 535nm, 방출 617nm)에 대한 FITC(녹색 형광 채널, 여기 490nm, 방출 515nm)를 선택하여 10배 배율로 이미지를 관찰하고 캡처합니다.
- 이미지를 획득하려면 스위치 1인 Ctr Adv를 켠 다음 CPU를 켭니다. 소프트웨어 시스템이 부팅될 때까지 기다립니다. 부팅할 때 60mm 접시를 스테이지에 조심스럽게 놓고 배율(10x)과 형광 채널(FITC, TXR)을 선택합니다. 렌즈를 조정하고 이미지를 스캔합니다.
- 시스템에서 이미지를 보려면 라이브 옵션을 선택하고 이미지를 봅니다. 적절한 최적화를 위해 형광 강도를 조정합니다. 저장 버튼을 클릭하여 이미지를 저장합니다.
알림: 이 단계에서 스페로이드는 육안을 통해 볼 수 있습니다. 광학 현미경에서 스페로이드는 10배 배율에서 둥글고 단단한 구체로 나타납니다. 200μL 피펫을 사용하여 여러 스페로이드를 한 번에 수집할 수 있습니다.
4. 종양 스페로이드의 분해 및 세포 현탁액
- 15mL 튜브에 1mL 피펫을 사용하여 7일과 10일에 각각 200개의 종양 스페로이드를 수집합니다.
참고: 수집하기 전에 단일 스페로이드를 현미경 슬라이드나 30mm 접시에 옮긴 후 모양과 형태를 주의 깊게 확인하고 현미경으로 관찰하십시오. - 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 스페로이드를 펠릿화합니다. 종양 스페로이드를 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
- 200μL의 PBS로 스페로이드를 조심스럽게 세척하고 125 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 스페로이드 붕해의 경우 0.25% 트립신-EDTA 용액 400μL를 추가하고 37°C에서 10분 동안 유지합니다. 스페로이드의 완전한 분해를 위해 격렬한 피펫팅을 수행합니다.
- 완전한 DMEM 성장 배지 1mL를 추가하여 트립신을 중화합니다. 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 펠릿을 완전한 DMEM 배지 1mL에 재현탁하고 총 세포 수를 계산합니다.
5. 마이크로비드를 통한 암 관련 섬유아세포(CAF) 분리
- 종양 스페로이드에서 CAF를 분리하려면 80μL의 저온 자기 활성화 세포 분류(MACS) 완충액(0.5% 소 혈청 알부민[BSA] 및 2mM 에틸렌디아민 테트라아세트산[EDTA]을 포함하는 pH 7.2의 PBS)에 1 x 107 세포를 재현탁합니다.
- 세포 현탁액(1 x 107 세포 함유)을 20 μL의 항섬유아세포 마이크로비드와 함께 인큐베이션합니다. 튜브를 부드럽게 두드려 잘 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 1mL의 차가운 MACS 완충액으로 세포를 세척하고 125 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 흡인합니다. 세포를 500 μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다.
- 마그네틱 비드 기반 세포 분리의 경우 3mL의 MACS 완충액으로 헹구어 MACS 컬럼을 준비합니다.
- 세포 현탁액을 컬럼에 넣은 다음, 표지되지 않은 세포 집단을 포함하는 유동 수집을 이어서 수집한다.
- 3mL의 MACS 완충액으로 컬럼을 3회 세척합니다. 분리기에서 컬럼을 제거하고 수집 튜브에 놓습니다.
- 5mL의 MACS 완충액을 추가하고 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 항섬유아세포 마이크로비드 표지된 세포를 수집합니다.
- 표지된 세포를 125 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 다운스트림 적용을 위해 분리된 섬유아세포로 진행하십시오.
6. 분리된 CAF에서 ACTA2 발현의 유세포분석 기반 분석
- 분리된 CAF의 수를 세고 약 6 x 104 셀을 사용합니다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인한다.
- 100μL의 세포 투과화 완충액(PBS + 0.5% BSA + 0.3% v/v Triton X-100)을 추가하고 세포를 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 세포를 간헐적으로 와동시켜 단일 세포 현탁액을 유지한다. 세포를 원심분리하고 100 μL의 세포 투과화 완충액에 재현탁시킨다.
- 2 μL의 APC 접합된 항-인간 α-SMA 항체를 추가하고 4°C에서 45분 동안 배양합니다. 배양 후 투과화 완충액 1mL를 추가하고 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 과도한 항체를 제거합니다.
- 유세포 분석을 위해 400μL의 투과화 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 유세포분석기에서 각 샘플의 총 10,000개 이벤트를 수집합니다. 전방 및 측면 산란을 기반으로 세포 집단을 구별한 후 ACTA2 양성 세포를 선택하고 일중항 집단을 선택한 다음 단일 매개변수 히스토그램에서 단일 피크로 나타나는 ACTA2 양성 세포를 선택합니다.
7. 미토콘드리아 막 전위를 결정하기 위한 JC-1 염색
- 분리된 CAF의 수를 세고 유세포분석을 사용하여 5,5,6,6'-테트라클로로-1,1',3,3' 테트라에틸벤지미-다조일카르보시아닌 요오드화물(JC-1) 염색에 대해 약 6 x 104 세포를 사용합니다.
- 세포를 PBS로 철저히 세척하고, 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 100μL의 세포 염색 완충액을 첨가한다.
- JC-1 염료를 2μM의 작동 농도로 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 배양이 종료되면, 세포를 PBS로 세척하고, 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 400 μL의 최종 부피로 재현탁시킨다.
- 유세포분석기에서 각 샘플의 총 20,000개 이벤트를 수집합니다. FL-2 채널의 적색 이동 JC-1 응집체와 FL-1 채널의 녹색 이동 단량체를 측정하여 미토콘드리아 막 전위를 정량화합니다.
8. 세포 활성 산소종(ROS) 수준을 추정하기 위한 DCFDA 염색
- 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 염색을 위해 스페로이드에서 분리된 CAF(6 x 104 세포)뿐만 아니라 전체 스페로이드(50개 숫자)를 사용합니다.
- 세포를 PBS로 철저히 세척하고, 125 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 100μL의 세포 염색 완충액을 첨가한다.
- 1μM의 작동 농도에서 DCFDA 염료를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 125 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음, 400μL의 최종 부피로 재현탁시킨다.
- 유세포분석기에서 각 샘플의 총 20,000개 이벤트를 수집합니다. 스페로이드와 분리된 CAF에 대한 7일차와 10일차에 형광을 측정하여 ROS 수준을 평가합니다.
9. CAF 마커 및 해당 유전자의 RT-qPCR 분석
- 제조업체의 프로토콜에 따라 단일 세포 용해 키트를 사용하여 분류된 CAF에서 RNA를 추출합니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 100ng의 RNA에서 cDNA를 준비합니다.
- 상대적인 CAF 마커(ACTA2 8 및 COL1A29) 및 해당 유전자(GLUT1 10 및 MCT4 11) 발현을 분석하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다. 최종 확장 후 용융 곡선 분석을 수행하여 제품의 특이성을 보장합니다. GAPDH의 발현을 기준 유전자로 사용하여 데이터를 정규화한다. RT-qPCR에 사용된 프라이머 서열은 보충 표 1에 열거되어 있다.
10. CAF로부터 세포 단백질의 추출 및 정량화
알림: 단백질 분해를 피하기 위해 얼음에서 단백질 추출의 모든 단계를 수행하십시오.
- 약 4 x 106 CAF 세포를 100 μL의 얼음처럼 차가운 RIPA 용해 완충액(pH 7.4에서 5mM의 Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 및 5mM의 EDTA와 함께 30mM Hepes, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS 및 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 함유)에 재현탁합니다.
- 적절한 세포 용해를 위해 엄격하게 소용돌이. 20Hz 주파수, 20초 동안 15% 진폭 및 3x 펄스에서 세포 현탁액을 초음파 처리합니다.
- 초음파 처리 후, 단백질 추출물을 13,000 x g 에서 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리한다. 상청액을 사전 냉각된 1.5mL 튜브로 옮깁니다. BCA 단백질 분석을 수행하여 단백질을 정량화합니다.
11. CAF의 효소 활성에 대한 분광 광도계 분석
참고: 다음 효소 활성은 종양 스페로이드 유래 CAF에서 분석됩니다.
- 숙시네이트 탈수소효소 활성의 측정
- CAF에서 숙시 네이트 탈수소 효소 (SDH)의 활성을 평가하기 위해 250mM 자당, 10mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 및 1mM 에틸렌 글리콜 -비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA)으로 SHE 완충액을 준비하고 pH를 7.3으로 조정하십시오. SHE 완충액에 0.4 mM 페나진 메토설페이트(PMS), 0.2 mM 2,6-디클로로인도페놀(DCPIP), 50 mM MgCl2,0.02% 트리톤 X-100, 및 1 mM 시안화물을 첨가하고 37°C에서 유지한다.
- 단계 10에 기재된 바와 같이 CAFs로부터 세포 단백질을 추출한다 (2 x 106 세포). 96-웰 플레이트의 각 웰에서, 100 μL의 세포 단백질 0.1 μL를 100 μL의 SHE 반응 혼합물과 함께 37°C에서 15분 동안 배양한다.
- 효소 활성을 시작하려면, 10 mM 숙시네이트12를 첨가한다. 600nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 nM/min/mL 단위의 효소 활성을 계산합니다.
- DCIP의 변환 계수는 몰 흡광 계수 0.0215를 기준으로12A/nM입니다. 언급 된 공식을 사용하여 SDH의 상대 활동을 계산하십시오.
상대 활성 (nM / 분 / mL / 효소) =
X 
X V
여기서 ΔA/분 = 효소 반응 속도(A 초기-A 최종)/(시간최종-A/분 초기), Ve = 샘플의 부피, V = 반응의 부피.
- 시토크롬 c 산화 효소 활성의 추정
- CAF에서 시토크롬 c 산화 효소 (COX) 활성을 평가하려면 KME 완충액 (125 mM KCl, 20 mM 3- (N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산 [MOPS] 및 1 mM EGTA, pH 7.4), 0.02 % 트리톤 X-100 및 5 mM 나트륨 아스 코르 베이트를 포함하는 KME 반응 완충 용액에 0.2 mg / mL의 세포 단백질을 첨가하십시오.
- 별도의 튜브에서 50μM 말 심장 시토크롬 c와 5mM 아스코르브산 나트륨을 혼합하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.13. 배양 후, 세포 단백질을 함유하는 500 μL의 KME 반응 완충액에 20 μL의 환원된 시토크롬 c를 첨가한다.
- 550nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 효소 활성을 단위/μL 단위로 계산합니다. 550 nm에서 시토크롬 c의 흡수는 산화 상태에 따라 변합니다. 환원 된 시토크롬과 산화 된 시토크롬 c 사이의 흡광 계수 (mM)의 차이는 550 nm에서 21.84입니다14. 세포 용해물에서 효소 활성의 양을 다음과 같이 계산하십시오.
단위/μL =
여기서 ΔA / min = A / min샘플 -A / min블랭크 및 21.84 = ΔmM 550nm에서 산화 된 시토크롬 c와 감소 된 시토크롬 c 사이
- 젖산 탈수소 효소 활성 평가
- 제조업체의 지침에 따라 젖산 탈수소효소 세포 분석 키트를 사용하여 젖산 탈수소효소(LDH) 분석을 수행합니다.
- 0.5 mg/mL의 세포 단백질에 LDH 테스트 시약(10 μL)을 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 종료되면 8분 동안 1분마다 45nm에서 흡광도를 측정합니다.
- NADH의 0(블랭크), 2.5, 5, 7.5, 10 및 12.5nM/웰을 사용하여 비색 검출을 위한 NADH 표준물질을 준비한 후 LDH 테스트 시약을 최종 부피 50μL에 추가합니다.
- T초기 및 T최종 흡광도의 차이를 NADH 표준 곡선에 플로팅하여 NADH 생성량을 결정합니다. 언급 된 공식을 사용하여 LDH의 활동을 평가하십시오.
LDH 활성 =
X 샘플 희석 계수
여기서, B = T 초기 및 T 최종 사이에 생성된 NADH의 양 (nmole), 반응 시간 = T최종 - T초기 (분), 및 Ve = 웰에 첨가된 샘플 부피 (mL).
X 
X V
X 샘플 희석 계수Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1은 현미경으로 7일째와 10일째에 관찰된 행드롭 방법에 의한 A549(폐 선암), MRC-5(섬유아세포) 및 THP-1(단핵구)의 세 가지 다른 세포 집단을 사용하는 다세포 종양 스페로이드의 발달을 보여줍니다. 7일차에 스페로이드는 직경이 260± 5.3μm로 작고 단단했으며 10일차에는 스페로이드의 직경이 480± 7.5μm였습니다(그림 1A 상단 패널, 그림 1B-D). 7일째와 10일째 스페로이드는 전체 배치 분석에서 관찰된 바와 같이 타이트한 응집체였으며 크기와 직경이 대부분 균일했습니다. 3D 다세포 스페로이드의 소형화 및 강성 피크는 10일경에 나타났습니다(그림 1A 상단 패널, 그림 1B-D). 세포 생존율은 칼세인-AM/PI 염색에 의해 평가하였다. 7일째부터 10일째까지 요오드화프로피듐 형광(빨간색)의 감소와 칼세인-AM 형광(녹색)의 증가가 관찰되어 3D 미세 환경에서 세포 증식을 나타냅니다(그림 1A,E). 스페로이드는 또한 Image-iT Red 저산소증 염색을 사용하여 저산소 특성에 대해 평가되었습니다. 10일차 스페로이드의 중심에서 저산소 코어가 발견되었습니다(그림 1F). 또한, E-cadherin 유전자 발현의 현저한 상향 조절이 4일차와 비교하여 7일째 및 10일째 스페로이드에서 관찰되었으며(그림 1G), 이는 세포 소형화 및 강성을 시사합니다. 또한, 종양 스페로이드 형성 일수의 증가에 따른 MKi67 유전자 발현의 증가(도 1H)는 세포 성장 및 증식을 나타낸다.
암-관련 섬유아세포 (CAFs)는 도 2A의 도식적 개요에 의해 설명된 바와 같이 항섬유아세포 마이크로비드를 사용하여 10일째 종양 스페로이드로부터 단리하였다. 이들 종양 스페로이드로부터 분리된 섬유아세포는 대략 69%가 ACTA2 양성이다(도 2B). mRNA 수준에서 분리된 섬유아세포는 정상 MRC-5 섬유아세포와 비교하여 각각 ACTA2 및 COL1A2(콜라겐 유형 1 알파 2 사슬) 유전자 발현에서 거의 3배(그림 2C) 및 10배(그림 2D) 상향조절을 보였으며, 이는 이러한 종양 스페로이드 내에서 CAF 형질전환/활성화에서 미세환경적 단서의 역할을 시사합니다.
활성화된 CAF에서 세포 활성 산소종(ROS) 수준을 평가하기 위해 종양 스페로이드의 ROS 수준을 먼저 2',7'-디클로로플루오레세인디아세테이트(DCFDA)를 사용하여 검사했으며, 이는 세포 내로 확산되고 세포 에스테라아제에 의해 탈아세틸화된 후 ROS 의존적으로 형광 분자 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)으로 산화되었습니다. 7일째와 비교했을 때 10일째 종양 스페로이드에서 ROS 수준의 유의미한 증가가 관찰되었으며, 이는 CAF 활성화에 대한 ROS 생성의 관여 가능성을 시사합니다(그림 3A,B). 7일째 및 10일째 종양 스페로이드에서 분리된 CAF에서 세포 ROS 수준이 유의하게 증가하는 것이 관찰되었습니다(그림 3C). 또한, JC-1 염색에 의해 나타난 바와 같이 미토콘드리아 막 전위의 변화가 발견되었다 (그림 3D). 종합적으로, 이러한 결과는 종양 스페로이드로부터 분리된 활성화된 CAF에서 미토콘드리아 막 전위 및 산화 스트레스의 변화를 시사합니다.
CAFs의 증가된 ROS 수준 및 미토콘드리아 막 탈분극이 종양 미세환경에서 암세포에 대한 역 Warburg 효과를 생성하기 위한 특정 해당 표적의 상향 조절과 인과 관계가 있는지 분석하기 위해 GLUT1 및 MCT4의 상대적인 유전자 발현을 조사했습니다. GLUT1 (도 4A) 및 MCT4 (도 4B) 유전자 발현의 유도가 정상 섬유아세포와 비교하였을 때 CAF에서 관찰되었다. 이 관찰은 CAF11에서 GLUT1 및 MCT4 수준의 증가를 보여주는이 분야의 이전 연구와 일치합니다. GLUT1은 포도당을 세포 내로 운반하는 역할을하는 반면, MCT4는 세포에서 젖산염을 압출하므로 이러한 경향은 CAF 생물학에서 상당히 논리적으로 보입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 다양한 미토콘드리아 효소 활성의 변화와 현저하게 상관 관계가 있기 때문에 분리 된 CAF에서 다른 미토콘드리아 효소 활성을 분석했습니다. 정상 섬유아세포와 비교하여 CAF에서 젖산 탈수소효소(LDH) 효소 활성의 유의미한 유도가 관찰되었으며(그림 4C), 이는 활성화된 CAF에서 높은 젖산 생산, 높은 산화 미토콘드리아 스트레스 및 역 Warburg 효과를 시사합니다. 다음으로, 세포 ROS 수준의 향상이 NF-kB 의존성 경로15를 통해 COX 발현 및 활성을 증가시키는 것으로 알려진 바와 같이 CAFs에서 시토크롬 c 산화효소(COX) 효소 활성을 조사하였다. 정상 섬유아세포와 비교하여 CAF에서 COX 활성의 유도가 관찰되었으며(도 4D), 이는 정상 섬유아세포로부터의 CAF의 전환에 ROS 의존적 신호전달의 관여를 시사한다. CAF에서 미토콘드리아 숙시 네이트 탈수소 효소 (SDH) 효소 활성도 평가되었으며 정상 섬유 아세포에 비해 주목할만한 유도를 발견했습니다 (그림 4E).
그림 1: 다세포 종양 스페로이드 개발 및 살아있는 죽은 분석. (A) 상단 패널: 7일과 10일에 A549(폐 선암 세포), MRC-5(섬유아세포) 및 THP-1(단핵구)로 구성된 다세포 3D 종양 스페로이드의 현미경 이미지. 중간 및 하단 패널: 7일째 및 10일째 종양 스페로이드에 대한 칼세인-AM 및 요오드화프로피듐(PI) 염색(중간 패널) 및 요오드화프로피듐 염색(하단 패널)의 병합된 이미지. (B) 10x 대물렌즈에서 캡처한 7일차 및 10일차 종양 스페로이드의 위상차 이미지. (씨,디) 스페로이드 직경의 측정을 보여주는 7일째(d7) 및 10일차(d10) 스페로이드의 대표 이미지 및 정량 분석. (E) 7일째 및 10일째에 칼세인-AM 표지된 세포의 종양 스페로이드의 정량 분석. (F) 10일째 스페로이드 절편(6μm)에서 Image-iTRed 저산소증 염색의 면역형광염색. DAPI는 핵 대조염색에 사용되었습니다. (G,H) 종양 스페로이드의 7일째 및 10일째의 E 카드헤린(G) 및 MKi67(세포 증식 마커)(H) mRNA 수준의 RT-qPCR 분석. MRC-5의 2차원 배양은 대조군으로 간주되었다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다(n=3). 데이터는 학생 t-검정± 사용한 시험(7일차 스페로이드) 대 대조군(2D 배양 MRC-5)의 경우 평균 표준 편차(S.D. **p < 0.01)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 종양 스페로이드에서 분리된 섬유아세포의 CAF 특성 분석. (A) 자성 세포 분류기의 도움으로 항섬유아세포 마이크로비드를 사용하여 10일째에 다세포 종양 스페로이드에서 섬유아세포를 분리하기 위한 프로토콜의 도식적 개요에 이어 유세포 분석 및 유전자 발현 분석을 위한 RNA 분리. (b) 단리된 섬유아세포에서 ACTA2 단백질 발현의 증가를 나타내는 유세포 분석 방법. (씨,디) 10일째 종양 스페로이드로부터 단리된 섬유아세포에서 ACTA2(C) 및 COL1A2(D) mRNA 수준의 RT-qPCR 분석. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다(n=3). 데이터는 학생 t-검정을 사용한 검정(격리된 CAF) 대 대조군(MRC-5)에 대해 S.D. **p < 0.01± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분리된 CAF에서 활성 산소종(ROS) 수준 및 JC1 염색 분석. (A) DCFDA 염색에 의한 7일차 및 10일차 스페로이드의 활성 산소종(ROS) 수준을 보여주는 면역형광 이미지. (b) DCFDA 양성 세포의 수를 나타내는 유세포 분석 방법. X축은 DCFDA를 나타내고 Y축은 세포 수를 나타냅니다. (c) 유동 세포분석에 의해 7일째 및 10일째 스페로이드로부터 단리된 DCFDA 양성 CAF의 풍부도. 2D 배양물에서 MRC-5 세포를 대조군으로 사용하였다. (D) 7일째 및 10일째 종양 스페로이드에서 분리된 CAF에서 미토콘드리아 막 전위를 분석하기 위한 JC-1 염색의 유세포 분석 분석. 2D 배양물에서 MRC-5 세포를 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다(n=3). 평균± S.D.로 표시되는 데이터 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분리된 CAF에서 미토콘드리아 효소 활성 측정. (A,B) 정상 섬유아세포(MRC-5)와 비교하여 7일째 및 10일째 종양 스페로이드에서 분리된 CAF에서 GLUT1(A) 및 MCT4(B) mRNA 수준의 RT-qPCR 분석. (씨-에) 락테이트 탈수소효소(LDH) 효소 활성(C), 시토크롬 c 산화효소(COX) 효소 활성(D) 및 숙시네이트 탈수소효소(SDH) 효소 활성(E)을 정상 섬유아세포 및 10일째 종양 스페로이드에서 분리된 CAF에서 측정했습니다. 모든 실험은 삼중으로 수행하였다(n=3). 평균으로 표현된 데이터 ± S.D. **p < 학생 t-검정을 사용한 검정(격리된 CAF) 대 대조군(MRC-5)에 대한 유의성이 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: RT-qPCR 분석을 위한 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구는 변형된 행잉 드롭 방법을 사용하여 종양 세포, 기질 세포 집단(즉, 섬유아세포) 및 면역 세포 집단(즉, 단핵구)을 포함하는 다세포 종양 스페로이드의 개발을 소개합니다. 섬유아세포 및 단핵구/대식세포는 종양 미세환경(TME)을 구성하는 가장 중요한 집단 중 하나이며, 이들의 존재는 종종 불량한 환자 예후와 관련이 있습니다16. TME에 존재하는 경우, 섬유아세포는 종양 미세환경 단서(17)로서 특정 암 관련 섬유아세포(CAF) 표현형을 나타내어 변형되어 그들에게 영향을 미친다. 근섬유아세포, 염증성 섬유아세포(iCAF) 및 항원-제시 섬유아세포(apCAFs)는 활성화된 섬유아세포(18,19)에서 흔히 발견된다. 이러한 표현형은 종종 암 공격성 및 치료 내성과 관련이 있습니다20. 근섬유아세포는 이러한 섬유아세포의 더 높은 비율이 T 세포 침윤을 제한하여 면역억제성 TME21을 유발하기 때문에 다발성 고형 종양에서 나쁜 징조로 보고됩니다. 이들 근섬유아세포는 활성 산소종(ROS)의 생산 증가와 TME22 내 세포외 기질 침착을 유도하는 엘라스틴, 콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 다양한 매개체의 분비의 특징적인 특징을 나타낸다.
이 연구는 자연적인 미세 환경 조건의 종양 기질을 밀접하게 시뮬레이션하는 세포 수와 5:4:1(종양 세포:섬유아세포:단핵구)의 비율을 고려하여 A549 폐 선암 세포, MRC-5 폐 섬유아세포 및 THP-1 단핵구를 사용하는 다세포 3D 종양 스페로이드 개발을 위한 프로토콜을 최적화했습니다. 이 스페로이드의 개발 및 분석은 복잡성에 도달하기 위해 10일까지 계속되었습니다. 따라서 세포 수와 비율은 ROS 수준의 생산 증가, 미토콘드리아 기능 장애, 더 높은 해당 과정 및 정상 섬유아세포의 활성화된 CAF로의 전환에 대한 참여와 같은 TME의 여러 기능을 궁극적으로 생성하는 스페로이드 내의 종양-기질 상호 작용을 연구하기 위한 이 프로토콜의 중요한 단계입니다.
CAF 생물학 연구의 주요 제약 조건 중 하나는 원발성 종양 생검 샘플에서 CAF의 제한된 가용성에 있습니다. 주요 목표는 섬유아세포로 생체모방 3D 종양 스페로이드를 만든 다음 자기 활성화 세포 분류기(MACS)의 도움으로 항섬유아세포 자성 마이크로비드를 사용하여 종양 스페로이드에서 활성화된 CAF를 분리하는 것입니다. 이것은 CAF를 직접 연구 할 수있는 출처를 제공 할 수 있습니다. CAF 집단은 알파-평활근 액틴(α-SMA) 및 COL1A2 발현과 같은 CAF 특이적 마커를 분석하여 확인하였다. 섬유아세포와 암세포의 크로스토크는 섬유아세포 표현형을 활성화된 CAF로 전환하여 포도당의 대규모 세포 흡수 및 해당 과정의 최종 생성물인 젖산 및 피루브산의 방출과 관련된 증가된 해당 경로를 나타냅니다. 따라서이 접근법은 연구자에게 충분한 CAF 세포를 제공하여 많은 답이없는 질문을 밝힐 것입니다. 여기에서 세포 수와 비율은 폐 3D 종양 스페로이드에 최적화되어 있습니다. 다른 고형 종양 스페로이드를 형성하려면 적절한 3D 구조를 얻기 위해 수와 비율을 조정해야 할 수 있습니다. 또한 이 접근법은 면역 세포 집단, 특히 스페로이드 내의 종양 관련 대식세포를 분리하고 연구하기 위해 약간의 수정이 필요할 수 있습니다.
이 3D 폐 종양 스페로이드 모델은 자연 종양 미세 환경 특징을 요약하기 때문에 이 모델은 정상 섬유아세포에서 CAF 활성화 메커니즘, 3D 종양 미세 환경에서 폐암 진행에 관여하는 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 둘째,이 연구는 비정상적인 ROS 생산과 미토콘드리아 기능 장애가 정상적인 섬유 아세포를보다 공격적인 CAF 표현형으로 유도하는 방법을 보여줍니다. 또한 CAF와 암세포 사이의 혼선과 역 Warburg 효과와 관련된 대사 재 프로그래밍에 대한 참여를 밝힐 것입니다. 따라서이 모델은 폐 선암 관리를 위해 CAF를 표적으로하는 효과적인 치료 개입의보다 철저한 연구 및 설계를위한 길을 열 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 인도 SERB-여성 우수상 프로젝트(SB/WEA-02/2017)와 인도 SERB-조기 경력 연구 상 프로젝트(ECR/2017/000892)에서 DP로 지원했습니다. 저자 인 LA와 SR은 IIT Ropar와 MHRD의 연구 펠로우 십을 인정합니다. MK는 그녀의 연구 펠로우십에 대해 ICMR을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | - | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | - | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
References
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