Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D
Summary
Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.
Abstract
Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) se encuentran entre las células estromales más abundantes presentes en el microambiente tumoral, lo que facilita el crecimiento y la progresión del tumor. La complejidad dentro del microambiente tumoral, incluyendo el secretoma tumoral, la inflamación de bajo grado, la hipoxia y el desequilibrio redox, fomenta la interacción heterotípica y permite la transformación de fibroblastos residentes inactivos para convertirse en CAF activos. Los CAF se distinguen metabólicamente de los fibroblastos normales (NF) ya que son más activos glucolíticamente, producen niveles más altos de especies reactivas de oxígeno (ROS) y sobreexpresan el exportador de lactato MCT-4, lo que lleva a la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP). Aquí se ha descrito un método para analizar la salud mitocondrial de CAF activados aislados de los esferoides tumorales 3D multicelulares que comprenden células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549), monocitos humanos (THP-1) y células de fibroblastos de pulmón humano (MRC5). Los esferoides tumorales se desintegraron en diferentes intervalos de tiempo y, mediante la clasificación celular activada magnéticamente, se aislaron los CAF. El potencial de membrana mitocondrial de los CAF se evaluó mediante colorante JC-1, la producción de ROS mediante tinción de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFDA) y la actividad enzimática en los CAF aislados. El análisis de la salud mitocondrial de CAF aisladas proporciona una mejor comprensión del efecto Warburg inverso y también se puede aplicar para estudiar las consecuencias de los cambios mitocondriales de CAF, como los flujos metabólicos y los mecanismos reguladores correspondientes sobre la heterogeneidad del cáncer de pulmón. Por lo tanto, el presente estudio aboga por una comprensión de las interacciones tumor-estroma en la salud mitocondrial. Proporcionaría una plataforma para verificar la eficacia de los candidatos a fármacos mitocondriales específicos contra los CAF como posibles terapias en el microambiente tumoral, evitando así la participación de CAF en la progresión del cáncer de pulmón.
Introduction
Los tumores sólidos están compuestos por poblaciones celulares heterogéneas que son guiadas por el microambiente tumoral (TME), sin embargo, el origen de la mayoría de las células aún no se ha descubierto. Principalmente las células estromales e inmunes (fibroblastos, células endoteliales, monocitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T y sus subconjuntos) reflejan la heterogeneidad tumoral en los cánceres de pulmón, mama, riñón y otros cánceres sólidos 1,2,3. Comprender el origen de cada subtipo y su potencial de transdiferenciación es de suma necesidad para desarrollar terapias avanzadas contra estos cánceres. El análisis de esta población celular diversa en biopsias humanas se presenta con varios desafíos debido al tipo de tumor, sitio, etapa, limitación de la cantidad de muestra y variabilidades específicas del paciente4. Por lo tanto, se necesita un modelo experimental, que no solo sea confiable sino que también pueda simular la condición tumoral in vivo, demostrando ser ideal para estudiar la diafonía tumor-estroma y su participación en la fisiopatología de la enfermedad.
Los cultivos tridimensionales (3D) multicelulares de esferoides tumorales (MCTS) son un sistema modelo de tumores in vitro ventajoso debido a su parecido con sus contrapartes naturales. MCTS puede replicar mejor aspectos de tumores sólidos que los modelos de cultivo celular 2D, incluida su arquitectura espacial, respuestas fisiológicas, liberación de mediadores solubles, patrones de expresión génica y mecanismos de resistencia a los medicamentos. Además, una ventaja principal de MCTS es que se puede utilizar para estudiar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral (TME). El método de caída colgante es la herramienta más comúnmente empleada para desarrollar y analizar MCTS5. En este método, las diferentes células con medios se suspenden en forma de gotas, lo que permite su crecimiento de forma coherente en 3D agregado y es fácil de acceder para su examen. La técnica es sencilla; No requiere muchas células y elimina la necesidad de un sustrato especializado como la agarosa para el desarrollo de esferoides6. Una ventaja adicional de este método radica en la reproducibilidad de su técnica. Además, este método también se ha utilizado para cocultivar poblaciones de células mixtas, como células endoteliales y células tumorales, para simular la angiogénesis tumoral temprana7.
En este estudio, se prepararon esferoides tumorales pulmonares 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos utilizando el método de gota colgante que imita el microambiente del tumor pulmonar. Luego, la población de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) se aisló para investigar la salud mitocondrial. La idea principal detrás del desarrollo de estos esferoides es aislar los CAF, ya que la diafonía entre las células en los esferoides podría transformar los fibroblastos en un estado de CAF activado similar al miofibroblasto. En segundo lugar, este estudio también puede representar cómo la producción aberrante de ROS y la disfunción mitocondrial impulsan a los fibroblastos normales hacia el fenotipo CAF más agresivo. Se encontró que los fibroblastos ensamblados dentro de los esferoides tumorales ganaron características miofibroblásticas, con el aumento de la actividad de ROS y la inducción de la expresión génica metabólica. Este protocolo destaca la importancia del microambiente tumoral en la activación de CAF y podría ser un excelente modelo para la generación in vitro y el estudio de las características fenotípicas de CAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente estudio introduce el desarrollo de esferoides tumorales multicelulares que comprenden células tumorales, población de células estromales (es decir, fibroblastos) y población de células inmunes (es decir, monocitos) utilizando un método modificado de gota colgante. Los fibroblastos y los monocitos/macrófagos se encuentran entre las poblaciones más significativas que constituyen el microambiente tumoral (EMT), y su presencia a menudo está relacionada con un mal pronósticodel paciente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Premio a la Excelencia de las Mujeres SERBIAS, India (SB/WEA-02/2017) y el Proyecto del Premio de Investigación de Carrera Temprana SERB, India (ECR/2017/000892) al PD. Los autores, LA y SR reconocen a IIT Ropar y MHRD por sus becas de investigación. MK reconoce a ICMR por su beca de investigación.
Materials
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
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