3 डी बहुकोशिकीय फेफड़े के ट्यूमर स्फेरॉइड से अलग कैंसर-संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट में माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का आकलन
Summary
बहुकोशिकीय 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड को फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट और मोनोसाइट्स के साथ तैयार किया गया था, इसके बाद इन स्फेरॉइड से कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) का अलगाव हुआ। माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और एंजाइमेटिक गतिविधियों का अध्ययन करके माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए पृथक सीएएफ की तुलना सामान्य फाइब्रोब्लास्ट के साथ की गई थी।
Abstract
कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मौजूद सबसे प्रचुर मात्रा में स्ट्रोमल कोशिकाओं में से हैं, जो ट्यूमर के विकास और प्रगति की सुविधा प्रदान करते हैं। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर जटिलता, जिसमें ट्यूमर स्राव, निम्न श्रेणी की सूजन, हाइपोक्सिया और रेडॉक्स असंतुलन शामिल हैं, हेटरोटाइपिक इंटरैक्शन को बढ़ावा देता है और निष्क्रिय निवासी फाइब्रोब्लास्ट के परिवर्तन को सक्रिय सीएएफ बनने की अनुमति देता है। सीएएफ सामान्य फाइब्रोब्लास्ट (एनएफ) से चयापचय रूप से अलग होते हैं क्योंकि वे अधिक ग्लाइकोलाइटिक रूप से सक्रिय होते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उच्च स्तर का उत्पादन करते हैं, और लैक्टेट निर्यातक एमसीटी -4 को ओवरएक्सप्रेस करते हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र (एमपीटीपी) खुल जाता है। यहां मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं (ए 549), मानव मोनोसाइट्स (टीएचपी -1), और मानव फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं (एमआरसी 5) सहित बहुकोशिकीय 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड से अलग सक्रिय सीएएफ के माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। ट्यूमर स्फेरॉइड को अलग-अलग समय अंतराल पर विघटित किया गया था और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के माध्यम से, सीएएफ को अलग किया गया था। सीएएफ की माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का मूल्यांकन जेसी -1 डाई, आरओएस उत्पादन 2′, 7′-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफडीए) धुंधला, और पृथक सीएएफ में एंजाइम गतिविधि का उपयोग करके किया गया था। पृथक सीएएफ के माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का विश्लेषण रिवर्स वारबर्ग प्रभाव की बेहतर समझ प्रदान करता है और सीएएफ माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों के परिणामों का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे चयापचय फ्लक्स और फेफड़ों के कैंसर विषमता पर संबंधित नियामक तंत्र। इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य पर ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन की समझ की वकालत करता है। यह ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में संभावित चिकित्सीय के रूप में सीएएफ के खिलाफ उनकी प्रभावशीलता के लिए माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट दवा उम्मीदवारों की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करेगा, जिससे फेफड़ों के कैंसर की प्रगति में सीएएफ की भागीदारी को रोका जा सकेगा।
Introduction
ठोस ट्यूमर विषम कोशिका आबादी से बने होते हैं जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) द्वारा निर्देशित होते हैं, हालांकि, अधिकांश कोशिकाओं की उत्पत्ति अभी तक खोजी नहीं गई है। मुख्य रूप से स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाएं (फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाएं, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाएं, बी कोशिकाएं, टी कोशिकाएं और उनके उपसमुच्चय) फेफड़े, स्तन, गुर्दे और अन्य ठोस कैंसर में ट्यूमर विषमता को दर्शाते हैं। प्रत्येक उपप्रकार की उत्पत्ति और उनकी ट्रांस-भेदभाव क्षमता को समझना इन कैंसर के खिलाफ उन्नत उपचार विकसित करने की अत्यंत आवश्यकता है। मानव बायोप्सी में इस विविध सेल आबादी का विश्लेषण ट्यूमर प्रकार, साइट, चरण, नमूना राशि की सीमा और रोगी-विशिष्ट वैरिएबिलिटीके कारण कई चुनौतियों के साथ खुद को प्रस्तुत करता है। इस प्रकार, एक प्रयोगात्मक मॉडल की आवश्यकता है, जो न केवल विश्वसनीय है, बल्कि विवो ट्यूमर की स्थिति का अनुकरण भी कर सकता है, जो ट्यूमर-स्ट्रोमा क्रॉसटॉक और रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में इसकी भागीदारी का अध्ययन करने के लिए आदर्श साबित होता है।
त्रि-आयामी (3 डी) बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड (एमसीटीएस) संस्कृतियां प्राकृतिक समकक्षों के साथ समानता के कारण ट्यूमर की एक लाभप्रद इन विट्रो मॉडल प्रणाली हैं। एमसीटीएस 2 डी सेल कल्चर मॉडल की तुलना में ठोस ट्यूमर के पहलुओं को बेहतर ढंग से दोहरा सकता है, जिसमें उनकी स्थानिक वास्तुकला, शारीरिक प्रतिक्रियाएं, घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और दवा प्रतिरोध तंत्र शामिल हैं। इसके अलावा, एमसीटीएस का एक मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग ट्यूमर विषमता और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हैंगिंग-ड्रॉप विधि एमसीटीएस5 के विकास और विश्लेषण के लिए सबसे अधिक नियोजित उपकरण है। इस विधि में, मीडिया के साथ विभिन्न कोशिकाओं को बूंदों के रूप में निलंबित कर दिया जाता है, जो एक सुसंगत 3 डी समग्र फैशन में इसकी वृद्धि की अनुमति देता है और परीक्षा के लिए पहुंचने में आसान है। तकनीक सीधी है; इसे कई कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं होती है और स्फेरॉइड विकास के लिए अगारोस जैसे विशेष सब्सट्रेट की आवश्यकता समाप्तहो जाती है। इस विधि का एक अतिरिक्त लाभ इसकी तकनीक की प्रजनन क्षमता में निहित है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग मिश्रित कोशिका आबादी, जैसे एंडोथेलियल कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं को सह-संस्कृति करने के लिए भी किया गया है, ताकि प्रारंभिक ट्यूमर एंजियोजेनेसिस 7 का अनुकरणकिया जा सके।
इस अध्ययन में, बहुकोशिकीय 3 डी फेफड़ों के ट्यूमर स्फेरॉइड को फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और मोनोसाइट्स के साथ हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करके तैयार किया गया था जो फेफड़ों के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करता है। फिर माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य की जांच के लिए कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) आबादी को अलग किया गया था। इन स्फेरॉइड को विकसित करने के पीछे मुख्य विचार सीएएफ को अलग करना है क्योंकि स्फेरॉइड में कोशिकाओं के बीच क्रॉसस्टॉक फाइब्रोब्लास्ट को मायो-फाइब्रोब्लास्ट जैसी सक्रिय सीएएफ अवस्था में बदल सकता है। दूसरे, यह अध्ययन यह भी दर्शा सकता है कि कैसे असामान्य आरओएस उत्पादन और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन सामान्य फाइब्रोब्लास्ट को अधिक आक्रामक सीएएफ फेनोटाइप की ओर ले जाता है। यह पाया गया कि ट्यूमर स्फेरॉइड के भीतर इकट्ठे फाइब्रोब्लास्ट ने आरओएस गतिविधि में वृद्धि और चयापचय जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण के साथ मायोफाइब्रोब्लास्टिक विशेषताओं को प्राप्त किया। यह प्रोटोकॉल सीएएफ को सक्रिय करने में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के महत्व पर प्रकाश डालता है और इन विट्रो पीढ़ी और सीएएफ फेनोटाइपिक विशेषताओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन एक संशोधित हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करके ट्यूमर कोशिकाओं, स्ट्रोमल सेल आबादी (यानी, फाइब्रोब्लास्ट), और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी (यानी, मोनोसाइट्स) सहित बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को एसईआरबी-महिला उत्कृष्टता पुरस्कार परियोजना, भारत (एसबी /डब्ल्यूईए-02/2017) और एसईआरबी-अर्ली करियर रिसर्च अवार्ड प्रोजेक्ट, भारत (ईसीआर / 2017/000892) द्वारा डीपी को समर्थित किया गया था। लेखक, एलए और एसआर अपने शोध फैलोशिप के लिए आईआईटी रोपड़ और एमएचआरडी को स्वीकार करते हैं। एमके ने अपनी रिसर्च फैलोशिप के लिए आईसीएमआर को स्वीकार किया।
Materials
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
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