Summary

Bedömning av mitokondriell hälsa vid cancerassocierade fibroblaster isolerade från 3D multicellulära lungtumörsfäroider

Published: October 21, 2022
doi:

Summary

Multicellulära 3D-tumörsfäroider framställdes med lungadenokarcinomceller, fibroblaster och monocyter, följt av isolering av cancerassocierade fibroblaster (CAF) från dessa sfäroider. Isolerade CAF jämfördes med normala fibroblaster för att bedöma mitokondriell hälsa genom att studera mitokondriell transmembranpotential, reaktiva syrearter och enzymatiska aktiviteter.

Abstract

Cancerassocierade fibroblaster (CAF) är bland de vanligaste stromacellerna som finns i tumörmikromiljön, vilket underlättar tumörtillväxt och progression. Komplexitet inom tumörmikromiljön, inklusive tumörsekretom, låggradig inflammation, hypoxi och redoxobalans, främjar heterotypisk interaktion och gör det möjligt för omvandling av inaktiva bosatta fibroblaster att bli aktiva CAF. CAF skiljer sig metaboliskt från normala fibroblaster (NFs) eftersom de är mer glykolytiskt aktiva, producerar högre nivåer av reaktiva syrearter (ROS) och överuttrycker laktatexportören MCT-4, vilket leder till öppningen av mitokondriell permeabilitetsövergångspor (MPTP). Här har en metod beskrivits för att analysera mitokondriell hälsa hos aktiverade CAFs isolerade från de multicellulära 3D-tumörsfäroiderna bestående av humana lungadenokarcinomceller (A549), humana monocyter (THP-1) och humana lungfibroblastceller (MRC5). Tumörsfäroider sönderdelades med olika tidsintervall och genom magnetaktiverad cellsortering isolerades CAF. Mitokondriell membranpotential hos CAF bedömdes med användning av JC-1-färgämne, ROS-produktion genom 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA) färgning och enzymaktivitet i de isolerade CAF: erna. Att analysera mitokondriell hälsa hos isolerade CAFs ger en bättre förståelse för den omvända Warburg-effekten och kan också tillämpas för att studera konsekvenserna av CAF-mitokondriella förändringar, såsom metaboliska flöden och motsvarande regleringsmekanismer på lungcancer heterogenitet. Således förespråkar den aktuella studien en förståelse av tumör-stroma-interaktioner på mitokondriell hälsa. Det skulle ge en plattform för att kontrollera mitokondriella specifika läkemedelskandidater för deras effektivitet mot CAF som potentiella terapier i tumörmikromiljön, vilket förhindrar CAF-engagemang i lungcancerprogression.

Introduction

Solida tumörer består av heterogena cellpopulationer som styrs av tumörmikromiljön (TME), men ursprunget till de flesta cellerna har ännu inte upptäckts. Huvudsakligen stromala och immunceller (fibroblaster, endotelceller, monocyter, makrofager, dendritiska celler, B-celler, T-celler och deras delmängder) återspeglar tumörens heterogenitet i lung-, bröst-, njur- och andra fasta cancerformer 1,2,3. Att förstå ursprunget till varje subtyp och deras transdifferentieringspotential är av yttersta behov för att utveckla avancerade terapier mot dessa cancerformer. Analysen av denna mångsidiga cellpopulation i humana biopsier presenterar sig med flera utmaningar på grund av tumörtyp, plats, stadium, begränsning av provmängd och patientspecifika variabiliteter4. Således behövs en experimentell modell, som inte bara är tillförlitlig utan också kan simulera in vivo-tumörtillståndet, vilket visar sig vara idealiskt för att studera tumör-stroma överhörning och dess engagemang i sjukdomspatofysiologi.

Tredimensionella (3D) multicellulära tumörsfäroidkulturer (MCTS) är ett fördelaktigt in vitro-modellsystem av tumörer på grund av deras likhet med naturliga motsvarigheter. MCTS kan bättre replikera aspekter av solida tumörer än 2D-cellodlingsmodeller, inklusive deras rumsliga arkitektur, fysiologiska svar, frisättning av lösliga mediatorer, genuttrycksmönster och läkemedelsresistensmekanismer. Dessutom är en stor fördel med MCTS att den kan användas för att studera tumörheterogenitet och tumörmikromiljön (TME). Hängningsmetoden är det vanligaste verktyget för att utveckla och analysera MCTS5. I denna metod suspenderas de olika cellerna med media i form av droppar, vilket möjliggör tillväxt på ett sammanhängande 3D-aggregerat sätt och är enkelt att komma åt för undersökning. Tekniken är enkel; Det kräver inte många celler och eliminerar kravet på ett specialiserat substrat som agaros för sfäroidutveckling6. En ytterligare fördel med denna metod ligger i reproducerbarheten av dess teknik. Dessutom har denna metod också använts för att samodla blandade cellpopulationer, såsom endotelceller och tumörceller, för att simulera tidig tumörangiogenes7.

I denna studie framställdes multicellulära 3D-lungtumörsfäroider med lungadenokarcinomceller, fibroblaster och monocyter med hjälp av den hängande droppmetoden som efterliknar lungtumörmikromiljön. Sedan isolerades den cancerassocierade fibroblastpopulationen (CAF) för att undersöka mitokondriell hälsa. Huvudidén bakom utvecklingen av dessa sfäroider är att isolera CAF: erna eftersom överhörningen bland cellerna i sfäroider kan omvandla fibroblasterna till ett myo-fibroblastliknande aktiverat CAF-tillstånd. För det andra kan denna studie också skildra hur avvikande ROS-produktion och mitokondriell dysfunktion driver de normala fibroblasterna mot den mer aggressiva CAF-fenotypen. Det visade sig att fibroblaster monterade i tumörsfäroider fick myofibroblastiska egenskaper med ökad ROS-aktivitet och induktion av metaboliskt genuttryck. Detta protokoll belyser vikten av tumörmikromiljön för att aktivera CAF och kan vara en utmärkt modell för in vitro-generering och studier av CAF-fenotypiska egenskaper.

Protocol

1. Cellodling Odling av humant lungadenokarcinomcellinje A549 och human monocytisk cellinje THP-1 i RPMI1640-media kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en fuktad kammare med 5%CO2. Odling MRC-5 humana lungfibroblastceller i DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycinlösning vid 37 ° C i en fuktad kammare med 5%CO2. 2. Framställning av multicellulära tumörsfäroid…

Representative Results

Figur 1 visar utvecklingen av flercelliga tumörsfäroider med användning av tre olika cellpopulationer-A549 (lungadenokarcinom), MRC-5 (fibroblaster) och THP-1 (monocyter)-med hängande droppmetoden som observerats dag 7 och dag 10 under mikroskopet. På dag 7 var sfäroider kompakta och styva med en diameter på 260 ± 5,3 μm, och dag 10 var sfäroider 480 ± 7,5 μm i diameter (figur 1A övre panel, figur 1B-D)…

Discussion

Den aktuella studien introducerar utvecklingen av flercelliga tumörsfäroider bestående av tumörceller, stromacellpopulation (dvs. fibroblaster) och immuncellpopulation (dvs. monocyter) med hjälp av en modifierad hängande droppmetod. Fibroblaster och monocyter/makrofager är bland de viktigaste populationerna som utgör tumörmikromiljön (TME), och deras närvaro är ofta kopplad till dålig patientprognos16. När de finns i TME omvandlas fibroblaster och uppvisar en specifik cancerassociera…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av SERB-Women Excellence Award Project, Indien (SB/WEA-02/2017) och SERB-Early Career Research Award Project, Indien (ECR/2017/000892) till DP. Författarna, LA och SR erkänner IIT Ropar och MHRD för sina forskningsstipendier. MK erkänner ICMR för hennes forskningsstipendium.

Materials

Antibodies
APC anti-human α-SMA R&D systems Cat# IC1420A
Anti-fibroblast microbeads Miltenyi Biotec Cat# 130-050-601
Cell lines
A549 lung adenocarcinoma cells NCCS Pune
MRC-5 fetal lung fibroblasts ATCC CCL-171
THP-1 Human monocytes NCCS Pune
Chemicals
BSA Himedia Cat# 9048-46-8
2,6-dichloroindophenol (DCPIP) SRL Cat# 55287
Calcein-AM Thermo Fisher Scientific Cat# C3099
DAPI Thermo Fisher Scientific Cat# D1306
DCFDA Sigma Cat# D6883
DMEM Gibco Cat# 11995073
DPBS Gibco Cat# 14190-144
EDTA Thermo fisher scientific Cat# 17892
EGTA SRL Cat# 62858
EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit HiMedia Cat# CCK036
FBS Gibco Cat# 10082147
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific Cat# 87786
HEPES Thermo Fisher Scientific Cat# 15630080
Horse heart Cytochrome c SRL Cat# 81551
Image-iT Red hypoxia reagent Thermo Fisher Scientific Cat# H10498
JC-1 Dye Thermo Fisher Scientific Cat# T3168
KCl Merck Cat# P9541
MgCl2 Merck Cat# M8266
MOPS Thermo Fisher Scientific Cat# 69824
Nacl Sigma-Aldrich Cat# S9888
NADH MB Grade SRL Cat# 54941
NP-40 Thermo Fisher Scientific Cat# 85124
Penicillin/Streptomycin Gibco Cat# 15140122
Phenazine methosulfate (PMS) SRL Cat# 55782
Propidium iodide Thermo fisher scientific Cat# P1304MP
RPMI 1640 Gibco Cat# 11875093
Single Cell Lysis Kit Thermo Fisher Scientific Cat# 4458235
Sodium ascorbate Merck Cat# A7631
Sodium cyanide Sigma Cat# 205222
Sodium Deoxycholate Thermo Fisher Scientific Cat# 89904
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich Cat# L3771
Sodium succinate hexahydrate SRL Cat# 36313
Sucrose Sigma Cat# S0389
SuperScript VILO cDNA synthesis kit Thermo Fisher Scientific Cat# 11754-050
Triton X-100 Sigma Cat# T8787
Trypsin 0.25% EDTA Gibco Cat# 25200072
Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD Cat# 172-5124
Plasticware
MACS LS Columns Miltenyi Biotec Cat# 130-042-401
Equipment
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific Cat# AMQAF1000
EVOS XL core imaging system Thermo Fisher Scientific Serial Number F0518-1727-0191
LAS X software Leica Microsystems
Leica fluorescent inverted microscope s DMi8 automated S/N 424150)
Midi MACS separator Miltenyi Biotec Cat# 130-042-302

References

  1. Kim, N., et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nature Communications. 11 (1), 1-5 (2020).
  2. Davidson, S., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a dynamic stromal niche that supports tumor growth. Cell Reports. 31 (7), 107628 (2020).
  3. Zhang, Y., et al. Single-cell analyses of renal cell cancers reveal insights into tumor microenvironment, cell of origin, and therapy response. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (24), (2021).
  4. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing patient specificity in the engineering of tumor models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  5. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Tissue Engineering. , 141-151 (2007).
  6. Dituri, F., et al. Complex tumor spheroid formation and one-step cancer-associated fibroblasts purification from hepatocellular carcinoma tissue promoted by inorganic surface topography. Nanomaterials. 11 (12), 3233 (2021).
  7. Arora, L., et al. Development of a multicellular 3D tumor model to study cellular heterogeneity and plasticity in NSCLC tumor microenvironment. Frontiers in Oncology. 12, 881207 (2022).
  8. Nurmik, M., Ullmann, P., Rodriguez, F., Haan, S., Letellier, E. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers. International Journal of Cancer. 146 (4), 895-905 (2020).
  9. Zhang, Y., et al. HIF-1α is necessary for activation and tumour-promotion effect of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (12), 5457-5469 (2021).
  10. Bu, L., et al. Biological heterogeneity and versatility of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Oncogene. 38 (25), 4887-4901 (2019).
  11. Whitaker-Menezes, D., et al. Evidence for a stromal-epithelial "lactate shuttle" in human tumors: MCT4 is a marker of oxidative stress in cancer-associated fibroblasts. Cell cycle. 10 (11), 1772-1783 (2011).
  12. Mandujano-Tinoco, E. A., Gallardo-Pérez, J. C., Marín-Hernández, A., Moreno-Sánchez, R., Rodríguez-Enríquez, S. Anti-mitochondrial therapy in human breast cancer multi-cellular spheroids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1833 (3), 541-551 (2013).
  13. Bregman, A. A. . Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. , (2002).
  14. Berry, E. A., Trumpower, B. L. Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra. Analytical Biochemistry. 161 (1), 1-15 (1987).
  15. Avagliano, A., et al. Metabolic reprogramming of cancer associated fibroblasts: the slavery of stromal fibroblasts. BioMed Research International. , (2018).
  16. Lorusso, G., Rüegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  17. Liu, T., Zhou, L., Li, D., Andl, T., Zhang, Y. Cancer-associated fibroblasts build and secure the tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 60 (2019).
  18. Sebastian, A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of tumor-derived fibroblasts and normal tissue-resident fibroblasts reveals fibroblast heterogeneity in breast cancer. Cancers. 12 (5), 1307 (2020).
  19. Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
  20. Ganguly, D., et al. Cancer-associated fibroblasts: Versatile players in the tumor microenvironment. Cancers. 12 (9), 2652 (2020).
  21. Harryvan, T. J., Verdegaal, E. M., Hardwick, J. C., Hawinkels, L. J., vander Burg, S. H. Targeting of the cancer-associated fibroblast-T-cell axis in solid malignancies. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1989 (2019).
  22. Santi, A., Kugeratski, F. G., Zanivan, S. Cancer associated fibroblasts: the architects of stroma remodeling. Proteomics. 18 (5-6), 1700167 (2018).

Play Video

Cite This Article
Arora, L., Kalia, M., Roy, S., Pal, D. Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids. J. Vis. Exp. (188), e64315, doi:10.3791/64315 (2022).

View Video