Multicellulära 3D-tumörsfäroider framställdes med lungadenokarcinomceller, fibroblaster och monocyter, följt av isolering av cancerassocierade fibroblaster (CAF) från dessa sfäroider. Isolerade CAF jämfördes med normala fibroblaster för att bedöma mitokondriell hälsa genom att studera mitokondriell transmembranpotential, reaktiva syrearter och enzymatiska aktiviteter.
Cancerassocierade fibroblaster (CAF) är bland de vanligaste stromacellerna som finns i tumörmikromiljön, vilket underlättar tumörtillväxt och progression. Komplexitet inom tumörmikromiljön, inklusive tumörsekretom, låggradig inflammation, hypoxi och redoxobalans, främjar heterotypisk interaktion och gör det möjligt för omvandling av inaktiva bosatta fibroblaster att bli aktiva CAF. CAF skiljer sig metaboliskt från normala fibroblaster (NFs) eftersom de är mer glykolytiskt aktiva, producerar högre nivåer av reaktiva syrearter (ROS) och överuttrycker laktatexportören MCT-4, vilket leder till öppningen av mitokondriell permeabilitetsövergångspor (MPTP). Här har en metod beskrivits för att analysera mitokondriell hälsa hos aktiverade CAFs isolerade från de multicellulära 3D-tumörsfäroiderna bestående av humana lungadenokarcinomceller (A549), humana monocyter (THP-1) och humana lungfibroblastceller (MRC5). Tumörsfäroider sönderdelades med olika tidsintervall och genom magnetaktiverad cellsortering isolerades CAF. Mitokondriell membranpotential hos CAF bedömdes med användning av JC-1-färgämne, ROS-produktion genom 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA) färgning och enzymaktivitet i de isolerade CAF: erna. Att analysera mitokondriell hälsa hos isolerade CAFs ger en bättre förståelse för den omvända Warburg-effekten och kan också tillämpas för att studera konsekvenserna av CAF-mitokondriella förändringar, såsom metaboliska flöden och motsvarande regleringsmekanismer på lungcancer heterogenitet. Således förespråkar den aktuella studien en förståelse av tumör-stroma-interaktioner på mitokondriell hälsa. Det skulle ge en plattform för att kontrollera mitokondriella specifika läkemedelskandidater för deras effektivitet mot CAF som potentiella terapier i tumörmikromiljön, vilket förhindrar CAF-engagemang i lungcancerprogression.
Solida tumörer består av heterogena cellpopulationer som styrs av tumörmikromiljön (TME), men ursprunget till de flesta cellerna har ännu inte upptäckts. Huvudsakligen stromala och immunceller (fibroblaster, endotelceller, monocyter, makrofager, dendritiska celler, B-celler, T-celler och deras delmängder) återspeglar tumörens heterogenitet i lung-, bröst-, njur- och andra fasta cancerformer 1,2,3. Att förstå ursprunget till varje subtyp och deras transdifferentieringspotential är av yttersta behov för att utveckla avancerade terapier mot dessa cancerformer. Analysen av denna mångsidiga cellpopulation i humana biopsier presenterar sig med flera utmaningar på grund av tumörtyp, plats, stadium, begränsning av provmängd och patientspecifika variabiliteter4. Således behövs en experimentell modell, som inte bara är tillförlitlig utan också kan simulera in vivo-tumörtillståndet, vilket visar sig vara idealiskt för att studera tumör-stroma överhörning och dess engagemang i sjukdomspatofysiologi.
Tredimensionella (3D) multicellulära tumörsfäroidkulturer (MCTS) är ett fördelaktigt in vitro-modellsystem av tumörer på grund av deras likhet med naturliga motsvarigheter. MCTS kan bättre replikera aspekter av solida tumörer än 2D-cellodlingsmodeller, inklusive deras rumsliga arkitektur, fysiologiska svar, frisättning av lösliga mediatorer, genuttrycksmönster och läkemedelsresistensmekanismer. Dessutom är en stor fördel med MCTS att den kan användas för att studera tumörheterogenitet och tumörmikromiljön (TME). Hängningsmetoden är det vanligaste verktyget för att utveckla och analysera MCTS5. I denna metod suspenderas de olika cellerna med media i form av droppar, vilket möjliggör tillväxt på ett sammanhängande 3D-aggregerat sätt och är enkelt att komma åt för undersökning. Tekniken är enkel; Det kräver inte många celler och eliminerar kravet på ett specialiserat substrat som agaros för sfäroidutveckling6. En ytterligare fördel med denna metod ligger i reproducerbarheten av dess teknik. Dessutom har denna metod också använts för att samodla blandade cellpopulationer, såsom endotelceller och tumörceller, för att simulera tidig tumörangiogenes7.
I denna studie framställdes multicellulära 3D-lungtumörsfäroider med lungadenokarcinomceller, fibroblaster och monocyter med hjälp av den hängande droppmetoden som efterliknar lungtumörmikromiljön. Sedan isolerades den cancerassocierade fibroblastpopulationen (CAF) för att undersöka mitokondriell hälsa. Huvudidén bakom utvecklingen av dessa sfäroider är att isolera CAF: erna eftersom överhörningen bland cellerna i sfäroider kan omvandla fibroblasterna till ett myo-fibroblastliknande aktiverat CAF-tillstånd. För det andra kan denna studie också skildra hur avvikande ROS-produktion och mitokondriell dysfunktion driver de normala fibroblasterna mot den mer aggressiva CAF-fenotypen. Det visade sig att fibroblaster monterade i tumörsfäroider fick myofibroblastiska egenskaper med ökad ROS-aktivitet och induktion av metaboliskt genuttryck. Detta protokoll belyser vikten av tumörmikromiljön för att aktivera CAF och kan vara en utmärkt modell för in vitro-generering och studier av CAF-fenotypiska egenskaper.
Den aktuella studien introducerar utvecklingen av flercelliga tumörsfäroider bestående av tumörceller, stromacellpopulation (dvs. fibroblaster) och immuncellpopulation (dvs. monocyter) med hjälp av en modifierad hängande droppmetod. Fibroblaster och monocyter/makrofager är bland de viktigaste populationerna som utgör tumörmikromiljön (TME), och deras närvaro är ofta kopplad till dålig patientprognos16. När de finns i TME omvandlas fibroblaster och uppvisar en specifik cancerassociera…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av SERB-Women Excellence Award Project, Indien (SB/WEA-02/2017) och SERB-Early Career Research Award Project, Indien (ECR/2017/000892) till DP. Författarna, LA och SR erkänner IIT Ropar och MHRD för sina forskningsstipendier. MK erkänner ICMR för hennes forskningsstipendium.
Antibodies | |||
APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
Cell lines | |||
A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
Chemicals | |||
BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
KCl | Merck | Cat# P9541 | |
MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
Plasticware | |||
MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
Equipment | |||
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
LAS X software | Leica Microsystems | ||
Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |