פענוח המנגנון המולקולרי והתפקוד של רעלנים יוצרי נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור
Summary
מוצג כאן פרוטוקול המשתמש בפרומסטיגוטים גדולים של לישמניה כדי לקבוע את הקשירה, הציטוטוקסיות והאיתות המושרים על ידי רעלנים היוצרים נקבוביות. הוכחת היתכנות עם סטרפטוליזין O מסופקת. רעלנים אחרים יכולים לשמש גם כדי למנף את המוטציות הגנטיות הזמינות בל’ מז’ור כדי להגדיר מנגנונים חדשים של עמידות לרעלנים.
Abstract
הבנת התפקוד והמנגנון של רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs) היא מאתגרת מכיוון שהתאים עמידים בפני נזקי הממברנה הנגרמים על-ידי PFTs. בעוד שגישות ביופיזיות עוזרות להבין את היווצרות הנקבוביות, לעתים קרובות הן מסתמכות על גישות רדוקציוניסטיות חסרות את ההשלמה המלאה של שומנים וחלבונים של הממברנה. תאים אנושיים בתרבית מספקים מערכת חלופית, אך המורכבות והיתירות שלהם במנגנוני התיקון מקשות על זיהוי מנגנונים ספציפיים. לעומת זאת, הפתוגן הפרוטוזואני האנושי האחראי ללישמניאזיס עורי, לישמניה מז’ור, מציע איזון אופטימלי בין מורכבות לרלוונטיות פיזיולוגית. L. major ניתנת למתיחה גנטית וניתן לתרבת אותה לצפיפות גבוהה במבחנה, וכל השפעה של הפרעות על זיהום ניתנת למדידה במודלים מבוססים של מורין. בנוסף, L. major מסנתז שומנים שונים ממקביליהם היונקים, מה שיכול לשנות את הדינמיקה של הממברנה. שינויים אלה בדינמיקה של הממברנה ניתנים לבדיקה באמצעות PFTs ממשפחת הרעלנים המאופיינים ביותר, ציטוליזין תלויי כולסטרול (CDC). CDCs נקשרים לארגוסטרול בקרום לישמניה ויכולים להרוג את L. major promastigotes, מה שמצביע על כך ש– L. major היא מערכת מודל מתאימה לקביעת המנגנונים התאיים והמולקולריים של תפקוד PFT. עבודה זו מתארת שיטות לבדיקת תפקוד PFT בפרומסטיגוטים גדולים של L. , כולל תרבית טפילים, כלים גנטיים להערכת רגישות לשומנים, מבחני קשירת ממברנות ומבחני מוות של תאים. מבחנים אלה יאפשרו שימוש מהיר ב– L. major כמערכת מודל רבת עוצמה להבנת תפקוד PFT במגוון אורגניזמים מגוונים אבולוציונית ומשותפים בארגון השומנים.
Introduction
רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs) הם המשפחה הגדולה ביותר של רעלנים חיידקיים1, אך המנגנונים שבאמצעותם הם מנקבים והורסים תאים אינם מובנים היטב. המשפחה הנחקרת ביותר של רעלנים יוצרי נקבוביות היא זו של ציטוליזין תלויי כולסטרול (CDC). CDCs מסונתזים בעיקר על ידי חיידקים גראם חיוביים, כולל הגורם הסיבתי של דלקת החיתולית הנמקית, סטרפטוקוקוס פיוגנס2. S. pyogenes מפריש את הסטרפטוליזין O (SLO) של CDC, אשר נקשר לסטרולים בקרום הפלזמה של התאים המארחים כמונומרים, אוליגומריז, ומכניס ~ 20-30 ננומטר נקבוביות לתוך הממברנה1. התפקיד כי שומנים לשחק בתהליך זה נשאר נקבע היטב.
גישה אחת לחקר אינטראקציות שומנים-CDC היא שימוש בליפוזומים המוגדרים כימית. בעוד שליפוזומים מוגדרים מספקים מידע על ערכי הסף הדרושים של שומנים כדי לקיים קשירת רעלנים והיווצרות נקבוביות 3,4, הם אינם משחזרים באופן מלא את תפקודי התא. לדוגמה, ליפוזומים משוחזרים חסרים את אסימטריית השומנים של פונדקאים של יונקים ושינויים בשומנים בתגובה לרעלנים5. חלופה אחת לליפוזומים היא שימוש בקווי תאים של יונקים. בעוד שקווי התאים האלה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, יש מידה רבה של יתירות במנגנוני חישת רעלנים והתנגדות2. כתוצאה מכך, מסלולי התיקון המשמשים להתנגדות ל-CDC נותרים לא מוגדרים היטב. יש לציין כי זרם Ca2+ הוא המפעיל העיקרי של תיקון ממברנה1. במורד הזרם של זרםCa 2+, מסלולים מרובים מעורבים, כולל תיקון תלוי סרמיד 6,7 ומסלול תיקון תלוי MEK6. מסלולים אלה מתקשרים עם אפקטים אחרים של חלבונים, כולל קומפלקס המיון האנדוזומלי הנדרש להובלה (ESCRT)8, ונספחים 6,9,10. ניתוח מסלולים אלה בתאי יונקים הוא מאתגר בשל היתירות, אשר מבלבלת את פענוח הנתונים.
אחת הדרכים לאזן את המורכבות עם פשטות לניתוח מסלולי תיקון היא השימוש באורגניזמים פשוטים יותר, כגון פתוגנים פרוטוזואנים בסוג לישמניה. לישמניה sp. גורמת ללישמניאזיס בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. לישמניאזיס נע בין לישמניאזיס עורית (נגעים בעור מוגבלים בעצמם) ללישמניאזיס הקרביים הקטלניים (hepatosplenomegaly), בהתאם למין ולגורמים אחרים11. לישמניה מייג’ור, הגורם הסיבתי של לישמניאזיס עורי, מועברת לבני אדם באמצעות וקטור חול ומשמשת להבנת תפקוד לישמניה וזיהום12. בנוסף, לישמניה sp. הם digenic12. הם קיימים כטפילי מקרופאגים תוך-תאיים המכונים אמסטיגוטים וכפרומסטיגוטים בעלי חיים חופשיים ומסומנים בחול12. L . פרומסטיגוטים עיקריים יכולים להיות מתורבתת במדיה עם תוספת סרום כגון M199 לצפיפות גבוהה13. פרומסטיגוטים ניתנים גם למתיחה גנטית; קיימים נוקאאוטים גנטיים רבים, כולל אלה המכוונים למסלולי ביוסינתזה של שומנים13. ניתן להעריך נוקאאוטים אלה לגדילה ולהבדלים בהדבקה ובהתפתחות הנגעים באמצעות זיהום של עכברי Balb/c13.
בנוסף לקלות היחסית של תרבית לישמניה ומגוון הנוקאאוטים של ביוסינתזה של שומנים, לטפיל יש גנום פשוט יותר מאשר ליונקים. המין המאופיין ביותר של לישמניה הוא L. major, שיש לו כלים גנטיים קיימים רבים, כגון מוטנטים עם מטבוליזם שומנים פגום14. יש לציין כי חלבוני תיקון רבים נעדרים. ל-L. major אין הומולוגים שזוהו עד כה עבור חלבוני תיקון מרכזיים של יונקים כגון נספחים. זה מאפשר אפיון של מסלולי תיקון משומרים אבולוציונית ללא המורכבות של מערכות יונקים. עם זאת, מסלולי תיקון לא אופיינו בלישמניה עד כה. יחד עם זאת, מסלולי איתות מרכזיים המעורבים בתיקון, כגון מסלול MEK6, נשמרים בלישמניה sp.15,16, אם כי יש לאמת הומולוגים. מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) נחקר היטב ב-L. mexicana, שם הוא תורם להישרדות תוך-תאית וליציבות תרמו-תאית בתאי יונקים ושולט במטה-ציקלוגנזה16. בליישמניה sp., 10 מתוך 15 MAPKs אופיינו17. LmMAPK9 ו-LmMAPK13 צפויים להיות הדומים ביותר ליונקים ERK1/2 בהתבסס על זהותם ברצף שפתי הזרחון המשומר. רצף שפתי הזרחון הוא TEY הן עבור יונקים ERK1/2 והן עבור LmMAPK9 ו- LmMAPK13. עם זאת, לשמונה מה-MAPKs של לישמניה יש מוטיב זרחון TDY15. לפחות שני הומולוגים של MEK זוהו בלישמניה sp., LmxMKK18 וקינאז הקשור ל-MEKK (MRK1)19. זה מצביע על כך שתובנות שזוהו בלישמניה יכולות להיות מתורגמות למערכות יונקים. כאשר הם אינם מתורגמים למערכות יונקים, הם מייצגים מטרות טיפוליות לטיפול בלישמניאזיס.
על מנת להשתמש ב- L. promastigotes כדי לחקור תיקון ממברנות ואינטראקציות עם רעלים, יש צורך בטכניקות של תפוקה בינונית . בעוד שהדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה מאפשרת הדמיה של חלבונים וממברנות מסומנים בזמן אמת, התפוקה נמוכה וייתכן שהיא אינה מודדת את הישרדות התאים. מבחני כדאיות בתפוקה בינונית כוללים ספיגת צבע הנמדדת על ידי ציטומטריה של זרימה, מדידת פעילות מיטוכונדריאלית או שחרור חלבונים תאיים כמו לקטט דהידרוגנאז (LDH). בתאי יונקים, מבחני LDH אינם מודדים באופן כמותי מוות תאי20. יתר על כן, מבחנים מבוססי אוכלוסייה כמו שחרור LDH או פעילות מיטוכונדריאלית אינם מאפשרים ניתוח חד-תאי או רב-ממדי חזק20. לעומת זאת, מבחנים מבוססי ציטומטריה של זרימה מאפשרים אנליזה רב-פרמטרית של תא יחיד20. עם זאת, מבחנים אלה לא יושמו להבנת הביולוגיה של רעלנים או לתגובות לרעלנים ב – L . major promastigotes.
במחקר זה, SLO משמש ככלי להבנת ההפרעה של קרום הפלזמה של מוטציית ה-sphingolipid null של L. major בשני חוצצים שונים – המדיה M199 המשמשת באופן שגרתי לתרבות L. promastigotes גדולים והמאגר הפשוט יותר של Tyrode. בדיקת ציטומטריה של זרימה בתפוקה בינונית מתוארת ומשמשת ליצירת עקומות מינון-תגובה של רעלן. נתונים מהמבחן הציטומטרי של הזרימה ממודלים לעקומה לוגיסטית כדי לקבוע את ערכי LC50. בעזרת מידע זה, ניתן לקבוע מינון תת-ליטי של SLO כך שניתן יהיה לאמת נוגדני MAPK באמצעות כתם מערבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה תוארו שיטות לחקר המנגנונים והתפקודים המולקולריים של PFTs, תוך שימוש בפתוגן האנושי לישמניה מייג’ור כמערכת מודל. פותחה בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת ציטוטוקסיות של זרימה בתפוקה בינונית למדידת כדאיות של תא בודד. הכדאיות היא כמותית ברמת האוכלוסייה מכיוון שניתן לחשב ערכי LC50 מעקו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לחברי מעבדות קייל וג’אנג על הסקירה הביקורתית של כתב היד. המחברים מודים למיקרוסקופיה של המכללה לאמנויות ומדעים על השימוש במתקנים.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases–Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. Protein kinase involved in flagellar-length control. Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
