Здесь представлен протокол, использующий основные промастиготы Leishmania для определения связывания, цитотоксичности и передачи сигналов, индуцированных порообразующими токсинами. Приведено доказательство концепции со стрептолизином О. Другие токсины также могут быть использованы для использования генетических мутантов, доступных в L. major , для определения новых механизмов устойчивости к токсинам.
Понимание функции и механизма порообразующих токсинов (PFT) является сложной задачей, потому что клетки сопротивляются повреждению мембраны, вызванному PFT. Хотя биофизические подходы помогают понять формирование пор, они часто полагаются на редукционистские подходы, в которых отсутствует полный набор мембранных липидов и белков. Культивируемые клетки человека обеспечивают альтернативную систему, но их сложность и избыточность в механизмах восстановления затрудняют идентификацию конкретных механизмов. Напротив, простейший патоген человека, ответственный за кожный лейшманиоз, Leishmania major, предлагает оптимальный баланс между сложностью и физиологической значимостью. L. major генетически поддается лечению и может культивироваться до высокой плотности in vitro, и любое влияние возмущений на инфекцию может быть измерено в установленных мышиных моделях. Кроме того, L. major синтезирует липиды, отличные от их коллег млекопитающих, которые могут изменять динамику мембран. Эти изменения в динамике мембран могут быть исследованы с помощью PFT из наиболее характерного семейства токсинов, холестерин-зависимых цитолизинов (CDC). CDC связываются с эргостерином в мембране Leishmania и могут убивать L. major promastigotes, что указывает на то, что L. major является подходящей модельной системой для определения клеточных и молекулярных механизмов функции PFT. В этой работе описываются методы тестирования функции PFT в L. major promastigotes, включая культуру паразитов, генетические инструменты для оценки восприимчивости к липидам, мембрансвязывающие анализы и анализы гибели клеток. Эти анализы позволят быстро использовать L. major в качестве мощной модельной системы для понимания функции PFT в ряде эволюционно разнообразных организмов и общих черт в липидной организации.
Порообразующие токсины (PFT) являются крупнейшим семейством бактериальных токсинов1, но механизмы, с помощью которых они перфорируют и разрушают клетки, плохо изучены. Наиболее изученным семейством порообразующих токсинов является семейство холестерин-зависимых цитолизинов (CDC). CDC в основном синтезируются грамположительными бактериями, включая возбудителя некротизирующего фасциита Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes секретирует стрептолизин CDC O (SLO), который связывается со стеринами в плазматической мембране клеток-хозяев в виде мономеров, олигомеризуется и вставляет ~ 20-30 нм пор в мембрану1. Роль, которую играют липиды в этом процессе, остается слабо определенной.
Одним из подходов к изучению взаимодействия липидов и CDC является использование химически определенных липосом. Хотя определенные липосомы предоставляют информацию о необходимых порогах липидов для поддержания связывания токсинов и образования пор 3,4, они не полностью повторяют клеточные функции. Например, восстановленные липосомы не имеют липидной асимметрии хозяев млекопитающих и липидных модификаций в ответ на токсины5. Одной из альтернатив липосом является использование клеточных линий млекопитающих. Хотя эти клеточные линии более физиологически значимы, существует большая степень избыточности в механизмах восприятия токсинов и резистентности2. Как следствие, пути восстановления, используемые для сопротивления CDC, остаются плохо определенными. Примечательно, что приток Ca2+ является основным активатором восстановлениямембраны 1. После притока Ca2+ задействовано несколько путей, включая керамид-зависимую репарацию 6,7 и MEK-зависимый путь восстановления6. Эти пути взаимодействуют с другими белковыми эффекторами, включая эндосомальный сортировочный комплекс, необходимый для транспортировки (ESCRT)8, и аннексины 6,9,10. Вскрытие этих путей в клетках млекопитающих является сложной задачей из-за избыточности, которая запутывает интерпретацию данных.
Одним из способов сбалансировать сложность с простотой для рассечения путей восстановления является использование более простых организмов, таких как простейшие патогены рода Leishmania. Leishmania sp. вызывает лейшманиоз у людей и других животных. Лейшманиоз варьируется от кожного лейшманиоза (самоограниченные поражения кожи) до фатального висцерального лейшманиоза (гепатоспленомегалия), в зависимости от вида и других факторов11. Leishmania major, возбудитель кожного лейшманиоза, передается людям через вектор песчаной мухи и используется для понимания функции лейшмании и инфекции12. Кроме того, Leishmania sp. являются дигенными12. Они существуют как внутриклеточные макрофаговые паразиты млекопитающих, называемые амастиготами, и как свободно плавающие, жгутиковые промастиготы в песчаной мухе12. L. major promastigotes можно культивировать в сывороточных средах, таких как M199, до высокой плотности13. Промастиготы также генетически поддаются лечению; существует много нокаутов генов, в том числе нацеленных на пути биосинтеза липидов13. Эти нокауты могут быть оценены на предмет роста и различий в инфекционности и развитии поражения через инфекцию мышей Balb/c13.
В дополнение к относительной легкости культуры Лейшмании и диапазону нокаутов биосинтеза липидов, паразит имеет более простой геном, чем млекопитающие. Наиболее характерным видом Leishmania является L. major, который имеет много существующих генетических инструментов, таких как мутанты с дефектным липидным метаболизмом14. Примечательно, что многие репарационные белки отсутствуют. L. major не имеет гомологов, идентифицированных на сегодняшний день для ключевых белков репарации млекопитающих, таких как аннексины. Это позволяет характеризовать эволюционно сохраненные пути восстановления без сложности систем млекопитающих. Тем не менее, пути восстановления не были охарактеризованы в Лейшмании на сегодняшний день. В то же время ключевые сигнальные пути, участвующие в восстановлении, такие как путь MEK6, сохраняются в Leishmania sp.15,16, хотя гомологи должны быть проверены. Путь митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) хорошо изучен в L. mexicana, где он способствует внутриклеточной выживаемости и термостабильности в клетках млекопитающих и контролирует метациклогенез16. В Leishmania sp. 10 из 15 MAPK были охарактеризованы17. Прогнозируется, что LmMAPK9 и LmMAPK13 наиболее похожи на ERK1/2 млекопитающих на основе идентичности в сохраненной фосфорилирующей последовательности губ. Фосфорилирующая последовательность губ является TEY как для млекопитающих ERK1/2, так и для LmMAPK9 и LmMAPK13. Тем не менее, восемь из Leishmania MAPK имеют мотив фосфорилирования TDY15. По крайней мере, два гомолога MEK были идентифицированы в Leishmania sp., LmxMKK18 и MEKK-связанной киназе (MRK1)19. Это говорит о том, что идеи, выявленные в Лейшмании, могут быть переведены в системы млекопитающих. Там, где они не переводятся в системы млекопитающих, они представляют собой терапевтические мишени для лечения лейшманиоза.
Для того, чтобы использовать L. major promastigotes для изучения восстановления мембран и взаимодействия с токсинами, необходимы методы средней пропускной способности. Хотя визуализация живых клеток с высоким разрешением позволяет визуализировать меченые белки и мембраны в режиме реального времени, она имеет низкую пропускную способность и может не измерять клеточную выживаемость. Анализы жизнеспособности со средней пропускной способностью включают поглощение красителя, измеренное с помощью проточной цитометрии, измерение митохондриальной активности или высвобождение клеточных белков, таких как лактатдегидрогеназа (ЛДГ). В клетках млекопитающих анализы ЛДГ количественно не измеряют гибель клеток20. Кроме того, популяционные анализы, такие как высвобождение ЛДГ или митохондриальная активность, не позволяют проводить надежный одноклеточный или многопараметрический анализ20. Напротив, анализы на основе проточной цитометрии позволяют проводить многопараметрический одноклеточный анализ20. Однако эти анализы не были применены для понимания биологии токсинов или реакций на токсины в L. major promastigotes.
В этом исследовании SLO используется в качестве инструмента для понимания возмущения плазматической мембраны нулевого мутанта l . major в двух разных буферах – среде M199, обычно используемой для культивирования L. major promastigotes, и более простом буфере Tyrode. Описан и используется среднепроизводительный проточный цитометрический анализ для генерации кривых дозы-ответа токсинов. Данные цитометрического анализа потока моделируются по логистической кривой для определения значений LC50 . С помощью этой информации сублитическая доза SLO может быть определена, так что антитела MAPK могут быть проверены с использованием западного блоттинга.
В этом исследовании были описаны методы изучения молекулярных механизмов и функций PFT, используя патоген человека Leishmania major в качестве модельной системы. Был разработан среднепроизводительный анализ цитотоксичности на основе проточной цитотоксичности для измерения жизнеспособ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить членов лабораторий Кейеля и Чжана за их критический обзор рукописи. Авторы благодарят Колледж искусств и наук микроскопии за использование средств.
1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
Ice bucket | |||
Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
Antibody | |||
Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |